Uitbreiding van de toolkit voor in vivo beeldvorming van axonaal transport

Met behulp van ons protocol kunnen we de dynamiek van signaal-endosomen en mitochondriën in axonen van motorische en sensorische neuronen van levende verdoofde muizen visualiseren en kwantitatief beoordelen. Deze methode die kan worden gebruikt om de basale fysiologie van axonen in vivo te begrijpen en belangrijke patho-mechanismen te onthullen die perifere neurodegeneratie in het muismodel van ziekte aansturen. Onze techniek kan worden gebruikt om het effect van potentiële behandelingen zoals farmacologische middelen en gentherapieën op axonaal transport in levende motorische en sensorische neuronen te beoordelen.

Deze techniek kan worden gebruikt om tegelijkertijd verschillende organellen in een specifiek perifeer zenuwaxon in beeld te brengen en de studie van motorische ziektemodellen en veroudering door te geven. Begin de voorbereidingen door een gegradeerde glazen micropipette te trekken voor optimale intramusculaire injecties in kleinere spieren. Bevestig voor de operatie een steriel chirurgisch gordijn op een warmtemat die is ingesteld op 37 graden Celsius en positioneer en focus de operatiemicroscoop.

Pak vervolgens alle benodigde chirurgische hulpmiddelen en instrumenten uit zoals beschreven in het manuscript. Wanneer de voorbereidingen zijn voltooid, brengt u de verdoofde muis over naar het mondstuk in een apart gedeelte van de chirurgische ruimte en zorgt u ervoor dat zowel de cornea- als pedaalonttrekkingsreflexen afwezig zijn voordat u de vacht van het chirurgische gebied scheert. Verwijder vervolgens de geschoren vacht van de muis met behulp van de kleverige kant van chirurgische tape.

Plaats de muis vervolgens op weegschalen om het preoperatieve gewicht te registreren. Gebruik vervolgens een wattenstaafje om oogsmeermiddel aan te brengen en breng de muis en het mondstuk over naar het chirurgische gebied. Om de tibialis anterieure of TA-spier te injecteren, plaatst u de muis op de rug en strekt u de achterpoot uit op 10 graden van de middellijn.

Wanneer de achterpoot zich in de juiste positie bevindt, plaatst u een chirurgische tape over de voet. Steriliseer het geschoren gebied met een 70% ethanol of gelijkwaardige oplossing. Teken het werkende atoxische fragment van tetanus, neurotoxine of HcT-oplossing in een micropipette van getrokken glas.

Maak vervolgens een kleine incisie over de spier van belang in het gebied dat overeenkomt met de motor- en plaatgebieden. Dan. doorboort de externe fascia op de spier om de HcT te injecteren. Laat de micropipette vijf tot 10 seconden in positie voordat u zich langzaam terugtrekt.

Sluit na de injectie de incisies met één tot twee hechtingen. Breng de muis vervolgens over naar een geïsoleerde herstelkooi onder observatie gedurende 30 minuten. Bereid je voor om de heupzenuw bloot te leggen door de chirurgische hulpmiddelen en instrumenten rond het chirurgische gebied te plaatsen.

Maak een wig door parafilm in een smalle rechthoek van een centimeter breed te snijden met een schuine punt om het beeldvormingsproces te ondersteunen. Zodra de voorbereidingen zijn voltooid, brengt u de muis over naar het mondstuk in het chirurgische gebied en gebruikt u chirurgische tape om het hoofd aan het mondstuk te bevestigen. Verleng en bevestig de beoogde achterpoot op 45 graden vanaf de middellijn met chirurgische tape.

Als cornea- en pedaalonttrekkingsreflexen afwezig zijn, knipt u de huid boven de heupzenuw met een schaar. Verwijder vervolgens de bovenliggende biceps femoris spier en spieren of bindweefsel zonder de heupzenuw en bloedvaten te beschadigen. Wanneer de intacte heupzenuw voldoende is blootgesteld, brengt u voorverwarmde steriele zoutoplossing aan op het gebied rond de heupzenuw om uitdroging te voorkomen.

Gebruik vervolgens een gebogen tang om het diepliggende bindweefsel te verstoren en plaats de vooraf voorbereide parafilmwig onder de zenuw. Plaats met zoutoplossing doordrenkte watten op het blootgestelde gebied voordat u de muis bovenop de warmtemat in de inductiekamer verplaatst die gevuld is met isofluraan en zuurstof. Plaats voor de beeldvorming een afdekglas van 22 bij 64 millimeter op het aangepaste microscoopstadium en beveilig de positie van het afdekglas met een tape.

Nadat u dompelolie op het doel hebt aangebracht, sluit u het microscoopstadium aan op de omgekeerde microscoop en verhoogt u langzaam het in olie ondergedompelde doel om contact te maken met het afdekglas. Wanneer de installatie klaar is, bevestigt u het verdovingsmondstuk met tape op het microscooppodium. Verwijder vervolgens de watten van de heupzenuw en breng de muis over van de inductiekamer naar het mondstuk met de blootgestelde zenuw naar het afdekglas gericht.

Bevestig het hoofd van de muis aan het mondstuk en til, met behoud van het laagste adequate niveau van anesthesie, de muis voorzichtig bij zijn staart op om steriele zoutoplossing toe te voegen aan de afdekslip in de buurt van de blootgestelde heupzenuw. Lokaliseer met behulp van de oculairen de heupzenuw om het optimale brandpunt te bepalen en selecteer een interessegebied met beweeglijke axonale organellen. Schakel vervolgens over naar de computersoftware door op de knop Acquisitie te klikken en een interessegebied te selecteren.

Gebruik digitale zoom om een 80-voudige vergroting te verkrijgen en draai het geselecteerde gebied om de axonen horizontaal te visualiseren Klik op het vak Regio's en selecteer een rechthoekig gebied van interesse. Stel in de acquisitiemodus de framegrootte in op minimaal 1024 x 1024 pixels en begin met timelapse-acquisitie van 100 tot 1.000 frames. Vang minimaal 10 beweeglijke ladingen van de drie axonen per muis.

In de studie werd in vivo motor axon-specifc labeling bereikt met behulp van transgene muizen. Het verbeterde groene florescentie-eiwit, of eGFP-expressie, in cholinerge motoraxonen werd waargenomen vanuit een levende, verdoofde ChAT. eGFP-muis.

Met de alternatieve methode, tdTomato expressie in een vers weggesneden zenuw uit een ChAT. tdTomato muis werd bereikt zonder extra weefselverwerking. Bovendien werden axonen geïdentificeerd door tracers of markers zoals HcT of adenovirussen die coderen voor eGFP in skeletspieren te injecteren.

De representatieve analyse toont een timelapse-beeldreeks die in vivo axonaal transport van signaal-endosomen in levende motorneuronen van een HB9 vertegenwoordigt. GFP-muis. De GFP had een meer korrelig patroon in HB9.

GFP-axonen. Het fokken van Mito. CFP muizen met ChAT.

tdTomato-muizen maakten de visualisatie van mitochondriën in de motorische axonen mogelijk. Bovendien kon ook de Node van Ranvier worden geïdentificeerd. De HcT injectie in de spieren van de Mito.

CFP-muizen maakten gelijktijdige visualisatie van signaal-endosomen en mitochondriën binnen dezelfde axonen in vivo mogelijk. Anterogradely en retrograde bewegende organellen, evenals vastgelopen organellen, werden waargenomen. Verminderde anesthesie tijdens het beeldvormingsproces is voordelig omdat het de impact van grote ademhalingsartefacten kan beperken en zo het volgen en analyseren van axonaal transport kan vereenvoudigen.

Heupzenuwen kunnen leerzaam zijn voor RNA- en eiwitanalyse om de organeldynamiek te correleren met belangrijke componenten van de axonale transportmachines, zoals motoreiwitten en ladingspecifieke adapters.