Name: slicing the embryonic chicken auditory brainstem to evaluate tonotopic gradients and microcircuits
Uploaded: 2022-07-12T12:30:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits at JoVE.com

Ce travail est soutenu par la subvention NIH / NIDCD R01 DC017167. Nous remercions Kristine McLellan d’avoir fourni des commentaires éditoriaux sur une version antérieure du manuscrit.

Toutes les procédures ont été approuvées par les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Northwestern et ont été effectuées conformément aux lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les protocoles de dissection et de préparation du tissu du tronc cérébral sont conformes aux protocoles précédents 5,13.
1. Manipulation des œufs
<ol><li>Achetez des œufs fécondés (Gallus gallus domesticus) auprès d’un fournisseur local d’animaux approuvé par l’IACUC.</li>
	<li>Conservez les œufs immédiatement à leur arrivée au réfrigérateur à 14 °C et incuber dans les 5 jours. NOTE: La viabilité de l’embryon diminue considérablement après 1 semaine.</li>
	<li>Stériliser les œufs avec de l’éthanol à 70% avant l’incubation à 38 ± 1 °C et ~50% d’humidité.</li>
</ol>2. Composition et préparation du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF)
<ol><li>Mélanger les produits chimiques suivants dans 1 L de 18,2 MΩcmdH2Opour créer une solution mère 10x ACSF : NaCl (chlorure de sodium) 130 mM, NaHCO3 (bicarbonate de sodium) 26 mM, KCl (chlorure de potassium) 2,5 mM, NaH2PO4 (dihydrogénophosphate de sodium) 1,25 mM, dextrose (D-(+)-glucose) 10 mM. Conservez la solution mère au réfrigérateur.</li>
	<li>Préparer les solutions de MgCl 2 (chlorure de magnésium) 1 M et CaCl2(chlorure de calcium) 1 M séparément dans 18,2 MΩcm dH2Oet conserver au réfrigérateur.</li>
	<li>Immédiatement avant utilisation, diluer 10x ACSF à 1x et buller en continu avec 95% O 2/5% CO 2 pendant 15-20 min et ajouter MgCl 2 et CaCl 2. Pour préparer ACSF et dACSF (dissection ACSF), ajuster à une concentration finale de Mg 2+ 1 mM, Ca 2+ 3 mM et Mg 2+ 3 mM, Ca 2+ 1 mM, respectivement.</li>
	<li>Réglez la vitesse de bulle pour l’ACSF de sorte que le pH soit de 7,2 à 7,4 avec une osmolalité comprise entre 300 et 310 mOsm/L. REMARQUE: Avoir l’ACSF placé dans un bain de glace pendant le barbotage est bénéfique pour maintenir une température de solution basse, ce qui favorisera l’intégrité structurelle des tissus lors de la dissection.</li>
</ol>3. Préparation du bloc d’agarose (5%)
<ol><li>Mélanger 5 g d’agarose dans 100 mL de dACSF. Utilisez un bain-marie ou un four à micro-ondes à 100 °C pendant 2-3 minutes, en remuant toutes les 30 s pour éviter les grumeaux jusqu’à ce que l’agarose se dissout complètement et commence à bouillonner.</li>
	<li>Verser l’agarose fondue dans une boîte de Petri vide jusqu’à 5 mm d’épaisseur et conserver à température ambiante pour priser. Après prise, sceller la boîte de Petri à l’aide d’un parafilm et conserver à 4 °C.</li>
	<li>Coupez l’agarose en blocs cubiques avec une lame tranchante et utilisez-les au moment de la dissection.</li>
</ol>4. Protocole de dissection et isolement du tronc cérébral auditif
<ol><li>Nettoyez la zone de dissection en vaporisant une solution d’alcool éthylique à 70 %.</li>
	<li>Collez le bloc d’agarose de support ou angulaire sur le plateau de vibratome.</li>
	<li>Choisissez des œufs de l’âge désiré (E20 et E21 dans le présent protocole). Manipulez et incuber les œufs en suivant les protocoles énumérés ci-dessus comme à l’étape 1.</li>
	<li>Localisez l’espace rempli d’air en plaçant l’œuf sous une lumière vive (mirage) et en cherchant cet espace du côté le plus grand ou le plus rond de l’œuf.</li>
	<li>Acclimatez les œufs à la température ambiante, fissurez la coquille sur l’espace rempli d’air et exposez le sac membranaire.</li>
	<li>Faites une incision douce dans le sac pour exposer le bec.</li>
	<li>Avec un scalpel, retirez doucement le cou et la tête de l’œuf.</li>
	<li>Décapitant rapidement la tête à l’aide de ciseaux tranchants.</li>
	<li>Après la décapitation, nettoyez la tête avec du dACSF glacé pour éliminer l’excès de sang du coussinet de dissection.</li>
	<li>Maintenez la tête stable dans un dACSF glacé et faites une incision rostro-caudale. Commencez l’incision derrière et entre les yeux et suivez la longueur du cou récolté. REMARQUE: Les embryons plus jeunes peuvent nécessiter moins de pression lors de l’incision.</li>
	<li>Séparez la peau pour exposer le crâne.</li>
	<li>Coupez le crâne derrière l’œil dans une ligne médiane à la direction latérale. Faites-le pour les deux hémisphères. REMARQUE: Cette étape aide à séparer la partie rostrale du crâne du cerveau attaché tout en gardant le tissu cérébral intact5.</li>
	<li>Trancher la partie rostrale du crâne. Placez la lame derrière les yeux et faites une coupe rapide. REMARQUE: Un effort peut être nécessaire pour couper proprement le crâne attaché.</li>
	<li>Plongez la tête dans un plat de dACSF froid.</li>
	<li>À l’aide d’une petite paire de ciseaux, faites des incisions médianes à latérales dans la région caudale du crâne pour essayer de séparer le cerveau du crâne sans causer de dommages tissulaires.</li>
	<li>Exposez doucement le tronc cérébral et le cervelet. Rétractez la zone dorsale de tout le crâne, retirez soigneusement le tronc cérébral et exposez-le à l’aide d’un pinceau fin avec une luge douce. Utilisez des pinces incurvées pour nettoyer le tronc cérébral des tissus et des vaisseaux sanguins qui se connectent. Portez une attention particulière à la 8e zone du nerf crânien et assurez-vous de laisser une courte longueur de fibres nerveuses intactes des deux côtés.</li>
	<li>Séparez le tronc cérébral du cervelet en coupant les pédoncules et en enlevant soigneusement les vaisseaux sanguins. Coupez le tronc cérébral des vaisseaux sanguins supplémentaires. REMARQUE: Assurez-vous que toute la procédure est effectuée dans du dACSF réfrigéré à la glace et continuellement barboté avec du carboxygène (95% O 2/5% CO2).</li>
</ol>5. Trancheage de vibratomes
REMARQUE: Dans les étapes suivantes, l’arrière du tissu doit être soutenu par un morceau cubique d’agarose.
<ol><li>Placez la lame du vibratome le long de l’axe horizontal et collez le tronc cérébral sur un plateau de tranchage. Collez le côté rostral, en gardant l’axe rostral-caudale vertical pour les tranches coronales.<ol><li>Gardez l’axe latéral-médian vertical pour les tranches sagittales.</li>
		<li>Collez la face ventrale en gardant l’axe dorso-ventral vertical pour les tranches horizontales.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour obtenir le plan sagittal-horizontal angulaire aigu, collez la face ventrale du tronc cérébral, en maintenant l’axe ventral-dorsal vertical sur la surface hypoténuse du bloc d’agarose, qui est coupée à un angle de 45°. Collez la surface opposée du bloc d’agarose face au plateau de tranchage et maintenez l’axe rostral-caudale parallèle au bord de la lame.</li>
</ol>6. Manipulation de morceaux fragiles ou volumineux de tissu du tronc cérébral
<ol><li>Dans une approche alternative à l’étape 5, immerger le tronc cérébral isolé dans une agarose de 4 % à bas point de fusion (LMP) à ~40 °C dans une boîte de Pétri de 35 mm x 10 mm.<ol><li>Après avoir versé de l’agarose sur le tronc cérébral immergé, placez la boîte de Petri sur de la glace pour solidifier. Coupez le bloc d’agarose cubique avec le tronc cérébral intégré à l’aide d’une lame de rasoir tranchante.</li>
	</ol></li>
	<li>Collez le bloc d’agarose LMP sur son côté rostral, en gardant l’axe rostral-caudale du tronc cérébral vertical.<ol><li>Prenez des tranches coronales jusqu’à ce que la région NM puisse être visualisée.</li>
		<li>Retirez le bloc d’agarose de la colle avec une lame tranchante. Pour repérer les noyaux, placez doucement 0,5 μL de colorant (bleu de toluidine ou orange G) sur le NM à l’aide d’une aiguille fine.</li>
		<li>Remontez ce bloc sur le plateau de tranchage pour les tranches sagittales ou horizontales et identifiez les noyaux par rapport à la région colorée.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour des performances optimales, réglez la vitesse de tranchage du vibratome à 4 - 5 (~30 ± 4 mm / min), la fréquence de vibration à 85-87 Hz et l’amplitude de tranchage à 4-6 (~1 ± 0,2 mm).</li>
	<li>Après la section du tronc cérébral, placer les tranches de 200 à 300 μm recueillies séquentiellement dans une chambre à tranches disponible dans le commerce pour équilibrer pendant 1 h à température ambiante dans l’ACSF, en bulles continues avec un mélange de 95 % d’O 2/5 % de CO 2 (pH 7,2-7,4, osmolarité 300-310 mOsm/L). Dans ces conditions, les tranches restent viables jusqu’à 5-6 h.</li>
</ol>7. Électrophysiologie : procédure de pince patch
<ol><li>Transférer une tranche du tronc cérébral dans la chambre d’enregistrement avec perfusion continue d’ACSF carboxygéné ~ 1,5 ± 0,5 mL/min.</li>
	<li>Tirez des pipettes patch avec un extracteur de micropipettes d’un diamètre de pointe de 1-2 μm et d’une résistance comprise entre 3 et 6 MΩ.<ol><li>Remplissez les pipettes avec une solution interne à base de K-gluconate (pour l’enregistrement par pince de courant).</li>
	</ol></li>
	<li>Pour tester les propriétés neuronales dans les différentes régions tonotopiques d’une tranche, localisez les neurones à chaque extrémité du plan de tranche et approchez-vous avec l’électrode d’enregistrement.</li>
	<li>Maintenez une pression d’air positive à l’extrémité de la pipette tout en vous approchant d’un neurone.</li>
	<li>Déplacez-vous vers le soma jusqu’à ce qu’une indentation soit visualisée sur le neurone. Effectuez rapidement les deux étapes suivantes.</li>
	<li>Faites une étanchéité gigaohm (1 GΩ) en libérant une pression d’air positive.</li>
	<li>Maintenez le réglage de l’amplificateur en mode de pince de tension et corrigez le décalage de la pipette en fonction de zéro pA. Exécutez un test d’étanchéité (impulsion d’essai de 10 mV à 100 Hz). Appliquez une pression d’air négative pour rompre une petite parcelle de la membrane neuronale.</li>
	<li>Pour tester les propriétés intrinsèques actives des neurones auditifs, appliquez des injections de courant somatique hyperpolarisantes et dépolarisantes. REMARQUE : Des exemples de cette procédure peuvent être visualisés dans la vidéo supplémentaire S1, S2. Les détails de cette procédure sont fournis dans les légendes vidéo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> Journal of Comparative Neurology. 164 (4), 411-433 (1975).</li><li>Rubel, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> Journal of Comparative Neurology. 166 (4), 469-489 (1976).</li><li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+synaptic+activity+in+chick+vestibular+nucleus+neurons+during+the+perinatal+period.">Spontaneous synaptic activity in chick vestibular nucleus neurons during the perinatal period.</a> Neuroscience. 127 (1), 81-90 (2004).</li><li>Fukui, I., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonotopic+gradients+of+membrane+and+synaptic+properties+for+neurons+of+the+chicken+nucleus+magnocellularis.">Tonotopic gradients of membrane and synaptic properties for neurons of the chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 24 (34), 7514-7523 (2004).</li><li>Sanchez, J. T., Seidl, A. H., Rubel, E. W., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices.">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2527 (2011).</li><li>Sanchez, J. T., Lu, Y., Fay, R. R., Popper, A. N., Cramer, K., Coffin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+signaling+in+the+auditory+brainstem.">Glutamate signaling in the auditory brainstem.</a> Auditory Development and Plasticity: Springer Handbook of Auditory Research. 64 (4), 75-108 (2017).</li><li>Parks, T. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonotopic+organization+of+the+superior+olivary+nucleus+in+the+chicken+auditory+brainstem.">Tonotopic organization of the superior olivary nucleus in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1493-1508 (2012).</li><li>Lipovsek, M., Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+development+of+brainstem+vestibular+and+auditory+nuclei.">Conserved and divergent development of brainstem vestibular and auditory nuclei.</a> Elife. 7, 40232 (2018).</li><li>Passetto, M. 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J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+properties+of+avian+interaural+level+difference+sound+localizing+neurons.">Intrinsic properties of avian interaural level difference sound localizing neurons.</a> Brain Research. 1752, 147258 (2021).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 14 (59), 449-450 (1973).</li></ol>

Tous les auteurs déclarent que la recherche a été menée sans aucun intérêt commercial ou financier et qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Les coupes coronales de tissu embryonnaire du tronc cérébral du poulet ont permis l’étude de la lame iso-fréquence individuelle relative pendant des décennies 1,2,5. Cependant, l’organisation tonotopique (c.-à-d. la fréquence) du tronc cérébral auditif du poulet est topologiquement alambiquée et peut être plus accessible dans d’autres axes anatomiques selon la question de recherche spécifique. Bien que suffisante pour étudier les questions anatomiques et physiologiques relatives aux régions iso-fréquences individuelles, l’étude des variations tonotopiques et leur développement dans de plus grandes zones auditives du tronc cérébral sont quelque peu limitées par les coupes coronales. Pour surmonter cette limitation, ce protocole décrit des approches dans les plans sagittal, horizontal et horizontal/transversal afin de fournir des exemples supplémentaires de tissu auditif du tronc cérébral qui présente des propriétés tonotopiques et des gradients maximaux dans une section individuelle du tronc cérébral.
Les coupes sagittales des régions du tronc cérébral auditif montrent que différentes zones tonotopiques sont réparties dans une région plus grande dans la tranche par rapport aux sections coronales (zone auditive sagittale = ~300-600 μm, zone auditive coronale = ~200-350 μm). Par exemple, les régions NM et NL ont été visualisées sur une plus grande surface le long de l’axe rostro-caudal en coupes sagittales (p. ex. figure 2B), et le gradient tonotopique fonctionnel qui longe cet axe anatomique était en grande partie contenu dans une seule tranche sagittale. Cela a été confirmé par des enregistrements de pince de courant des différences neuronales intrinsèques qui varient le long du gradient rostral-caudal, comme indiqué précédemment14,15 (par exemple , Figure 3C, D). Des expériences futures mettant en évidence des propriétés anatomiques et immunohistochimiques le long de l’axe tonotopique pourraient étudier davantage les gradients connus des propriétés auditives dans un seul plan de tranche sagittale. Ceux-ci incluent, sans toutefois s’y limiter, la coloration MAP2 et les modèles d’expression des canaux potassiques, qui sont des gradients connus de l’architecture dendritique et des propriétés intrinsèques de NM et NL qui ont déjà été montrés dans les sections coronales successives16.
Des coupes horizontales de régions du tronc cérébral auditif montrent que le NM et le NL sont situés vers la ligne médiane. Une partie des fibres axonales auditives est diagonale ou perpendiculaire au plan horizontal (Figure 4). Ces fibres peuvent être suivies en faisant une tranche angulaire aiguë de 45° au plan sagittal. Les tranches horizontales/transversales résultantes étaient plus grandes que les tranches sagittales ou horizontales, et de longues fibres axonales traversaient l’axe rostro-caudal pour les côtés ipsilatéral et controlatéral. NM et NL peuvent être visualisés dans une plus grande région diagonale (~400-700 μm) de sorte que les connexions controlatérales peuvent être visualisées le long d’un axe latéral-médial. De plus, le plan de tranche horizontal/transversal montre également comment les régions auditives et le gradient tonotopique qui en résulte effectuent un virage angulaire (Figure 5). L’exposition angulaire des connexions controlatérales dans une plus grande surface rend ces tranches plus appropriées pour la stimulation électrophysiologique et les études de microcircuits que les tranches coronales traditionnelles.
Avantages supplémentaires La formation de microcircuits auditifs nécessite une coordination spatio-temporelle des indices qui favorisent la survie neuronale, la synaptogenèse, la différenciation axonale, l’architecture dendritique et la maturation. Ainsi, une section alternative du tronc cérébral du microcircuit auditif de l’embryon de poulet peut être utilisée pour les sujets de recherche suivants: organisation morphologique des neurones dans des dimensions topographiquement différentes; organiser et cartographier les connectomes de tous les noyaux auditifs et vestibulaires; identification et caractérisation des profils d’activité des constituants du circuit dans les plans iso-fréquence et tonotopique; l’organisation topographique des microcircuits excitateurs par rapport aux microcircuits inhibiteurs et les relations avec les populations de neurones spécialisés (noyaux); localisation spatiale des neurones des noyaux auditifs et de sa prédiction de la fibrose kystique17; ciblage systématique de types neuronaux tonotopiques spécifiques; suivi des cellules progénitrices et de leur développement en noyaux conservés; lignée génétique des cellules à l’évolution des circuits neuronaux18 ; anatomie comparative du tronc cérébral entre les espèces; étude de circuits vestibulaires comme le complexe vestibulaire (DC) de Deiter19 ; et la synchronie et la diaphonie entre les noyaux vestibulaires.
Une approche multidimensionnelle utilisant différents plans de tranche peut aider à répondre à des questions fondamentales sur les propriétés anatomiques et biophysiques inconnues des microcircuits du tronc cérébral. Un bon exemple est la relation entre les noyaux auditifs majeurs (NM, NA, NL et SON) et les noyaux vestibulaires, y compris le noyau dorsal du lemniscus latéral (LLDp), le noyau semi-lunaire (SLu)20 et le noyau tangentiel (TN)3. Cependant, ce protocole et ces études basées sur des tranches ont certaines limites.
Précautions et limites Selon l’institution effectuant les expériences, les directives éthiques et la manipulation des embryons de poulet peuvent différer. Alors que les National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals autorisent une décapitation rapide, il existe d’autres méthodes pour l’euthanasie des embryons de poulet21. Le tissu du tronc cérébral embryonnaire de poulet en développement précoce est mou et délicat par rapport aux embryons plus âgés. Il a plusieurs connexions et vaisseaux sanguins à la surface qui nécessitent une prudence supplémentaire lors de leur retrait. Les tissus doivent être conservés dans du dACSF glacé et perfusés avec 95% O 2/5% CO2 pour augmenter la viabilité.
La méthode de tranchage sagittal n’est utile que pour la tonotopie ipsilatérale. Cette méthode de tranchage fournit des tranches plus grosses que les tranches coronales, dont la manipulation pourrait être précaire. Cependant, on peut couper les tranches en utilisant des méthodes à aiguilles croisées décrites en détail ailleurs22. L’utilisation de blocs d’agarose à 4% LMP peut sauver des structures délicates en tranches, mais il faut veiller à ne pas verser d’agarose trop chaude. Le réglage rapide en plaçant le tronc cérébral bloqué par l’agarose dans un environnement réfrigéré pendant ~ 1 min rend les tranches plus viables pour les enregistrements électrophysiologiques.
L’application de superglue en quantités excessives peut être toxique. Il doit être appliqué le moins possible, et les quantités excédentaires doivent être lavées immédiatement en changeant le dACSF. Pour les tranches angulaires aiguës (45°), il est essentiel de couper l’angle du bloc d’agarose; On peut utiliser un miroir pour voir l’angle avant tout en coupant le bloc d’agarose avec une lame tranchante. Les lames disponibles dans le commerce peuvent avoir un revêtement de cire qui doit être essuyé avec de l’alcool et séché avant utilisation. Une optimisation est nécessaire pour la vitesse et la fréquence de coupe du vibratome, car les touffes de fibres axonales sont plus dures que les tissus corticaux ou matriciels. Le maintien d’une amplitude élevée et l’utilisation d’une solution de dissection réfrigérée peuvent prévenir les lésions tissulaires.
Toutes les solutions doivent être préparées fraîches et le Ca 2+ et le Mg2+ doivent être ajoutés à l’ACSF après avoir fait bouillonner 95% O 2/5% CO2. Sinon, il peut y avoir des précipitations de Ca2+. Un pinceau doit être utilisé pour manipuler doucement les tranches dans le vibratome. Gardez le temps total de tranchage inférieur à 15 minutes si possible. Une pipette Pasteur en verre peut être utilisée pour manœuvrer des tranches de tronc cérébral.
N’utilisez pas de détergent ou d’agents de lavage corrosifs pour la verrerie et l’équipement qui entrent en contact avec les tranches utilisées en électrophysiologie. Les images prises représentent l’apparition de tissus de 200 à 300 μM d’épaisseur sous optique de contraste interférentiel différentiel (CIVD). La qualité visuelle sera inférieure à celle de l’immunohistochimie ou de la microscopie électronique, mais elle reflète avec précision ce qu’un expérimentateur verra lors de la réalisation d’enregistrements électrophysiologiques.
Les études relatives au développement précoce de microcircuits le long d’un axe anatomique alternatif, qu’ils soient dorso-ventral, rostral-caudal ou ipsilatéral-conlatéral, sont limitées dans le tronc cérébral auditif du poulet. L’une des raisons en est que le rôle des codes transcriptionnels et de la régulation du développement tonotopique dans le tronc cérébral n’est pas encore entièrement compris. Des phénomènes fonctionnels tels que la modulation descendante et l’activité spontanée sont souvent perdus lors de l’observation de l’activité in vitro. Cependant, la recherche in vivo est complétée par des enregistrements spécifiques et directs d’un seul neurone qui ne sont possibles que dans ces conditions de tranche. Le raffinement de l’obtention de tissu du tronc cérébral le long de différentes orientations pourrait fournir des informations perspicaces sur le développement et la complexité des gradients tonotopiques dans les microcircuits auditifs du tronc cérébral du poulet.

L’embryon de poulet est un modèle de recherche précieux pour étudier des questions biologiques fondamentales dans de nombreux domaines scientifiques, notamment la biologie cellulaire, l’immunologie, la pathologie et la neurobiologie du développement. Le microcircuit du tronc cérébral auditif du poulet est un excellent exemple de circuit hautement spécialisé qui peut être compris en termes de morphologie auditive et de physiologie. Par exemple, Rubel et Parks (1975) ont d’abord décrit l’orientation tonotopique (c.-à-d. le gradient de fréquence) du noyau de poulet magnocellularis (NM) et du noyau laminaire (NL) comme une fonction linéaire à travers l’axe des noyaux, orientée ~30° par rapport au plan sagittal. Les neurones individuels de NM et NL codent leur meilleure fréquence sonore - connue sous le nom de fréquence caractéristique (CF) - le long du plan rostral-médial jusqu’à la région caudo-latérale. Les neurones sensibles aux hautes fréquences se trouvent dans la région rostrale-médiale et les neurones sensibles aux basses fréquences sont situés caudo-latéralement. En tant que telles, les méthodes traditionnelles de dissection du tissu auditif du tronc cérébral pour étudier les propriétés tonotopiques ont utilisé des tranches coronales successives. En effet, des microcircuits auditifs d’embryons de poulet en développement ont été établis comme système modèle pour étudier le traitement du signal des fonctions auditives tonotopiques à travers des tranches successives du tronc cérébral du plan coronal caudal à rostral depuis des décennies 1,2,3,4,5,6.
Cependant, l’organisation tonotopique de NM et NL est topologiquement et morphologiquement alambiquée. Les entrées du nerf auditif sont distribuées de telle sorte que les entrées élevées de fibrose kystique se terminent par des structures ressemblant à des ampoules terminales qui couvrent au moins un quart de la circonférence somatique d’une cellule NM adendritique. Inversement, les faibles entrées de mucoviscidose ne sont pas organisées avec des bornes terminales en forme de bulbe d’extrémité, mais avec de multiples synapses boutons sur les dendrites des neurones NM. Les entrées CF moyennes se terminentpar des synapses 4,7,8,9,10,11,12 en forme d’ampoule terminale et de bouton. À Terre-Neuve-et-Labrador, le gradient dendritique hautement stéréotypé est évident non seulement dans la longueur dendritique, mais aussi dans la largeur dendritique. Ce gradient dendritique unique est étroitement conforme à l’axe tonotopique. Les dendrites subissent une longueur 11 fois plus longue et cinq fois plus grande en largeur des neurones à faible CF, respectivement6. Pour surmonter ces distributions alambiquées de ces noyaux dans les tranches coronales, ce protocole décrit les approches de dissection dans les plans sagittal, horizontal et horizontal/transversal. Ces techniques de tranchage fournissent des exemples de tissu auditif du tronc cérébral qui présente des propriétés tonotopiques maximales dans un plan de tranche individuel.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop 2021</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-vibration table 30&#34;x 36&#34; - OTMC - 63533</td>
			<td>TMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sens standard software</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital amplifier&#160; multiclamp 700B</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSK line-up linearslicer pro7</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2</td>
			<td>OLYMPUS AMERICA INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller P-97</td>
			<td>SUTTER INSTRUMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope BX51W1</td>
			<td>OLYMPUS AMERICA INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS ICE software</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohaus balance model AV212</td>
			<td>Ohaus Adventurer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus DPSI0 /DPS80 camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter lab 850 benchtop</td>
			<td>SCHOTT INSTRUMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp stainless blade</td>
			<td>Dorco/Personna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapor pressure osmometer model 5600</td>
			<td>WESCOR INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purification systems Smart2pure 6UV/UF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals- list</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrose Low melt IB70051</td>
			<td>IBI SCIENTIFIC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (Calcium Chloride)</td>
			<td>ACROS organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cynergy instant adhesive CA6001</td>
			<td>Resinlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-(+)-glucose)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>IBI SCIENTIFIC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td>Amresco.Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium Chloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td>Amresco.Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate)</td>
			<td>Amresco.Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (Sodium Bicarbonate)</td>
			<td>Amresco.Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing the embryonic chicken auditory brainstem to evaluate tonotopic gradients and microcircuits

L’embryon de poulet est un modèle animal largement accepté pour étudier le tronc cérébral auditif, composé de microcircuits hautement spécialisés et d’une topologie neuronale orientée différemment le long d’un axe tonotopique (c’est-à-dire de fréquence). L’axe tonotopique permet le codage séparé des sons à haute fréquence dans le plan rostral-médian et le codage basse fréquence dans les régions caudo-latérales. Traditionnellement, les tranches de tissu embryonnaire du tronc cérébral coronal permettent l’étude de la lame iso-fréquence individuelle relative. Bien que suffisante pour étudier les questions anatomiques et physiologiques relatives aux régions iso-fréquences individuelles, l’étude de la variation tonotopique et de son développement dans de plus grandes zones du tronc cérébral auditif est quelque peu limitée. Ce protocole rend compte des techniques de tranchage du tronc cérébral à partir d’embryons de poulet qui englobent de plus grands gradients de régions de fréquence dans le tronc cérébral auditif inférieur. L’utilisation de différentes méthodes de tranchage pour le tissu auditif du tronc cérébral du poulet permet des expériences électrophysiologiques et anatomiques dans une tranche du tronc cérébral, où de plus grands gradients de propriétés tonotopiques et de trajectoires développementales sont mieux préservés que les sections coronales. De multiples techniques de tranchage permettent d’étudier mieux les diverses propriétés anatomiques, biophysiques et tonotopiques des microcircuits auditifs du tronc cérébral.

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Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits

Nous présentons ici un protocole pour obtenir des tranches du tronc cérébral auditif non coronal de l’embryon de poulet pour l’étude des propriétés tonotopiques et des trajectoires de développement dans une tranche du tronc cérébral. Ces tranches comprennent des sections sagittales, horizontales et horizontales / transversales englobant des régions tonotopiques plus grandes dans un plan de tranche individuel que les sections coronales traditionnelles.

Trancher le tronc auditif embryonnaire du poulet pour évaluer les gradients tonotopiques et les microcircuits

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology ...

Cette méthode acquiert des tranches vivantes du tronc cérébral auditif du poulet qui englobe un plus grand gradient de région de fréquence dans la même tranche. Ces tranches conviennent aux expériences électrophysiologiques et anatomiques avec un axe tonotopique plus large. Cette méthodologie aidera à comprendre le développement des microcircuits dans le tronc cérébral auditif.Bien que l’anatomie soit spécifique au poulet, d’autres espèces aviaires comme les cailles et les oiseaux chanteurs ont une anatomie similaire. Pour commencer, stérilisez les œufs avec de l’éthanol à 70% et incuberez-les à 38 degrés Celsius et 50% d’humidité. Ensuite, réglez le taux de bulle pour l’ACSF de telle sorte que le pH soit de 7,2 à 7,4 avec une osmolalité comprise entre 300 et 310 milliosmolaires par litre.Ensuite, mélangez cinq grammes d’agarose dans 100 millilitres de dACSF. Dissoudre complètement l’agarose à l’aide d’un bain-marie ou d’un four à micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose commence à bouillonner. Versez l’agarose fondue dans une boîte de Petri jusqu’à une épaisseur de cinq millimètres et maintenez-la à température ambiante pour qu’elle prenne.Après la prise, scellez la boîte de Petri et conservez à quatre degrés Celsius. Couper l’agarose en blocs de cubicules pour l’utiliser au moment de la dissection. Tout d’abord, nettoyez la zone de dissection en utilisant de l’éthanol à 70%.Collez le bloc d’agarose de support ou angulaire sur le plateau de vibratome. Placez l’œuf sous une lumière vive et localisez l’espace rempli d’air sur le côté plus grand ou plus rond de l’œuf, puis fissurez la coquille sur l’espace rempli d’air et exposez le sac à membrane. Faites une incision douce dans le sac pour exposer le bec.Avec un scalpel, retirez doucement le cou et la tête de l’œuf. Après la décapitation, nettoyer la tête avec du dACSF réfrigéré. Maintenez la tête stable dans le dACSF réfrigéré et faites une incision rostrocaudale.Commencez l’incision derrière et entre les yeux et suivez la longueur du cou récolté. Séparez la peau pour exposer le crâne. Coupez le crâne derrière l’œil en ligne médiane à la direction latérale.Répétez l’opération pour les deux hémisphères. Tranchez la partie rostrale du crâne en plaçant la lame derrière les yeux et en faisant une coupe rapide. Ensuite, plongez la tête dans un plat de dACSF réfrigéré.À l’aide d’une paire de petits ciseaux, faites des incisions médianes à latérales dans la région caudale du crâne pour séparer le cerveau sans causer de lésions tissulaires. Exposez doucement le tronc cérébral et le cervelet. Rétractez la région dorsale de tout le crâne.Retirez le tronc cérébral et exposez-le par un léger brossage à l’aide d’un pinceau fin. Utilisez des pinces incurvées pour nettoyer le tronc cérébral des tissus et des vaisseaux sanguins qui se connectent. Séparez le tronc cérébral du cervelet en coupant les pédoncules et en enlevant soigneusement les vaisseaux sanguins.Coupez le tronc cérébral des vaisseaux sanguins supplémentaires. Tout d’abord, placez la lame du vibratome le long de l’axe horizontal. Pour les tranches coronales, collez le tronc cérébral sur un plateau de tranchage du côté rostral, en gardant l’axe rostrocaudal vertical.Pour les tranches sagittales, maintenez l’axe médian latéral vertical. Pour les tranches horizontales, collez la face ventrale en maintenant l’axe ventral dorsal vertical. Pour obtenir le plan horizontal sagittal angulaire aigu, collez la face ventrale du tronc cérébral de telle sorte que l’axe dorsal ventral soit vertical sur le bloc d’agarose de surface de l’hypoténuse.Collez la surface opposée du bloc d’agarose face au plateau de tranchage et maintenez l’axe rostrocaudal parallèle au bord de la lame. Comme alternative au découpage des vibratomes, immergez le tronc cérébral isolé dans un point de fusion bas de 4% agarose à 40 degrés Celsius dans une boîte de Petri de 35 par 10 millimètres. Une fois que l’agarose s’est solidifiée, coupez le bloc d’agarose de la cabine à l’aide d’une lame de rasoir tranchante.Collez le bloc d’agarose sur son côté rostral en maintenant l’axe rostrocaudale du tronc cérébral vertical. Prendre des tranches coronales jusqu’à ce que la région NM soit visible. Retirez le bloc d’agarose de la colle avec une lame tranchante.À l’aide d’une aiguille fine, placez délicatement 0,5 microlitre de colorant bleu de toluidine sur le NM pour repérer les noyaux. Remontez ce bloc sur le plateau de tranchage pour les tranches sagittales ou horizontales. Identifier les noyaux par rapport à la région colorée et couper le tronc cérébral.Après sectionnement, placer les tranches de 200 à 300 microns collectées séquentiellement dans une chambre tranchée contenant de l’ACSF pour équilibrer pendant une heure à température ambiante. Les coupes coronales de tissu du tronc cérébral d’un embryon de poulet E19 à 21 représentent les régions d’isofréquence relative des noyaux du tronc cérébral auditif, de la région auditive de fréquence caractéristique la plus faible à la plus élevée. Les fibres du nerf auditif afférent et la bifurcation des axones NM étaient visibles.Nucleus angularis a également été observé. Dans les sections rostrales, le noyau olivaire supérieur est situé le long de la région latérale ventrale de la tranche coronale. Dans les coupes sagittales, NM et nucleus laminaris ou NL ont été identifiés là où les fibres nerveuses auditives sont entrées dans le groupe de neurones.Le noyau olivaire supérieur a été identifié dans la région rostrolatérale. Des régions auditives caractéristiques de fréquence basse et élevée de NM et NL le long de l’axe rostrocaudal ont été observées. La tranche la plus médiale montrait les touffes axonales ipsilatérales et controlatérales et le point final de la région auditive.Dans les tranches horizontales, NM et NL ont été identifiés vers la ligne médiane, et les neurones ont été répartis le long de l’axe médian latéral. Des tranches de tissu du tronc cérébral à un angle aigu par rapport à un plan horizontal ont montré les noyaux auditifs du tronc cérébral sur une grande diagonale. Les images agrandies ont montré l’axe tonotopique des noyaux auditifs le long de l’axe rostromédial à caudolatéral.Assurez-vous que l’ensemble du processus est effectué dans du dACSF refroidi à la glace et continuellement recouvert d’oxygène carboxydé. Ce protocole est utilisé par les chercheurs qui étudient les propriétés anatomiques et biophysiques des microcircuits du tronc cérébral en développement, en particulier la relation entre les principaux noyaux auditifs.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Préparation et de la culture de tranches de poulet auditive du tronc

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Recherche

Neurosciences

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Stimulation optogenetic du nerf auditif

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Insect-controlled Robot: A Mobile Robot Platform to Evaluate the Odor-tracking Capability of an Insect

Robot Insecte contrôlée: Une plate-forme de robot mobile pour évaluer la capacité Odor-suivi d&#39;un insecte

Robotic odor source localization has been a challenging area and one to which biological knowledge has been expected to contribute, as finding odor ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Réponse auditif du tronc cérébral et des cellules ciliées externes Whole-cell Patch Clamp enregistrement chez le rat Postnatal

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Implant cochléaire et les enregistrements de réponse électriquement évoqué auditif du tronc cérébral chez les souris C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Préparation de rythmiquement actifs In Vitro néonatale rongeurs tronc cérébral-moelle épinière et fine tranche

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Technologie de balayage 3D Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol

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