Name: slicing the embryonic chicken auditory brainstem to evaluate tonotopic gradients and microcircuits
Uploaded: 2022-07-12T12:30:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH/NIDCD R01 DC017167. אנו מודים לקריסטין מקללן על שסיפקה הערות עריכה על גרסה מוקדמת יותר של כתב היד.

כל הנהלים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת נורת'ווסטרן (IACUC) ובוצעו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הפרוטוקולים לדיסקציה והכנה של רקמת גזע המוח תואמים את הפרוטוקולים הקודמים 5,13.
1. טיפול בביצים
<ol><li>רכשו ביציות מופרות (Gallus gallus domesticus) מספק בעלי חיים מקומי שאושר על ידי IACUC.</li>
	<li>יש לאחסן את הביצים מיד עם ההגעה במקרר בטמפרטורה של 14 מעלות צלזיוס ולדגירה תוך 5 ימים. הערה: כדאיות העובר יורדת במידה ניכרת לאחר שבוע.</li>
	<li>לעקר את הביצים עם 70% אתנול לפני הדגירה ב 38 ± 1 מעלות צלזיוס ו ~ 50% לחות.</li>
</ol>2. הרכב והכנה של נוזל מוחי-שדרה מלאכותי (ACSF)
<ol><li>יש לערבב את הכימיקלים הבאים ב-1 ליטר של 18.2 MΩcm dH 2 O כדי ליצור תמיסת מלאי ACSF של 10x: NaCl (נתרן כלורי) 130 mM, NaHCO3 (סודיום ביקרבונט) 26 mM, KCl (אשלגן כלורי) 2.5 mM, NaH2PO4 (נתרן דיהידרוגן פוספט) 1.25 mM, דקסטרוז (D-(+)-גלוקוז) 10 mM. שמור את פתרון המלאי במקרר.</li>
	<li>יש להכין את MgCl 2 (מגנזיום כלוריד) 1 M ואת CaCl 2 (סידן כלורי) 1 M תמיסות בנפרד ב-18.2 MΩcm dH2 O ולאחסן במקרר.</li>
	<li>מיד לפני השימוש, יש לדלל 10x ACSF ל-1x ולבעבע ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2 למשך 15-20 דקות ולהוסיף MgCl 2 ו-CaCl 2. כדי להכין ACSF ו-dACSF (ניתוח ACSF), התאימו לריכוז הסופי של Mg 2+ 1 mM, Ca 2+ 3 mM ו-Mg 2+ 3 mM, Ca 2+ 1 mM, בהתאמה.</li>
	<li>הגדר את קצב המבעבע עבור ACSF כך שה- pH הוא 7.2-7.4 עם אוסמולליות בין 300 ל- 310 mOsm/L. הערה: הצבת ה-ACSF באמבט קרח בזמן מבעבע מועילה לשמירה על טמפרטורת תמיסה נמוכה, שתתמוך בשלמות המבנית של הרקמות בזמן הניתוח.</li>
</ol>3. אגרוז (5%) הכנת בלוקים
<ol><li>מערבבים 5 גרם של agarose ב 100 מ"ל של dACSF. יש להשתמש באמבט מים בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס או במיקרוגל למשך 2-3 דקות, תוך ערבוב כל 30 שניות כדי למנוע גושים עד שהאגרוז מתמוסס לחלוטין ומתחיל לבעבע.</li>
	<li>יוצקים את האגרוז המומס בצלחת פטרי ריקה בעובי של עד 5 מ"מ ושומרים בטמפרטורת החדר להתייצבות. לאחר ההגדרה, אוטמים את צלחת הפטרי באמצעות פרפילם ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>חותכים את agarose לתוך בלוקים מעוקב עם להב חד ולהשתמש בהם בזמן דיסקציה.</li>
</ol>4. פרוטוקול דיסקציה ובידוד גזע המוח השמיעתי
<ol><li>נקו את אזור הנתיחה באמצעות תרסיס תמיסת אתיל 70%.</li>
	<li>הדביקו את גוש האגרוז התומך או הזוויתי על מגש הוויברטום.</li>
	<li>בחר ביצים בגיל הרצוי (E20 ו- E21 בפרוטוקול הנוכחי). טפלו ודגרו את הביצים בהתאם לפרוטוקולים המפורטים לעיל כמו בשלב 1.</li>
	<li>אתרו את החלל המלא באוויר על ידי הנחת הביצה תחת אור בהיר (סוכריות) וחפשו את החלל הזה בצד הגדול או העגול יותר של הביצה.</li>
	<li>לאקלם את הביצים לטמפרטורת החדר, לפצח את הקליפה מעל החלל המלא באוויר ולחשוף את שק הממברנה.</li>
	<li>לעשות חתך עדין בשק כדי לחשוף את המקור.</li>
	<li>בעזרת אזמל, משכו בעדינות את הצוואר והראש מתוך הביצה.</li>
	<li>מהיר לערוף את הראש באמצעות מספריים חדים.</li>
	<li>לאחר עריפת הראש, נקו את הראש עם dACSF מקורר קרח כדי להסיר עודפי דם מפד הדיסקציה.</li>
	<li>החזיקו את הראש יציב ב-dACSF מקורר קרח ובצעו חתך רוסטרו-קאודלי. מתחילים את החתך מאחורי ובין העיניים ועוקבים אחר אורך הצוואר שנקטף. הערה: עוברים צעירים יותר עשויים לדרוש פחות לחץ בעת ביצוע החתך.</li>
	<li>להפריד את העור כדי לחשוף את הגולגולת.</li>
	<li>חותכים את הגולגולת מאחורי העין בקו אמצע לכיוון לרוחב. עשו זאת עבור שתי ההמיספרות. הערה: שלב זה עוזר להפריד את החלק הרוסטרלי של הגולגולת מהמוח המחובר תוך שמירה על רקמת המוח שלמה5.</li>
	<li>פורסים את החלק הרוסטרלי של הגולגולת. מניחים את הלהב מאחורי העיניים ומבצעים חיתוך מהיר. הערה: ייתכן שיידרש מאמץ כדי לחתוך את הגולגולת המצורפת בצורה נקייה.</li>
	<li>לטבול את הראש בצלחת של dACSF קר.</li>
	<li>בעזרת זוג מספריים קטן, יש לבצע חתכים בקו האמצע עד לרוחב באזור הקאודאלי של הגולגולת כדי לנסות ולהפריד את המוח מהגולגולת מבלי לגרום נזק לרקמות.</li>
	<li>חשוף בעדינות את גזע המוח ואת המוח הקטן. לסגת את האזור הגבי של הגולגולת כולה, להסיר את גזע המוח בזהירות, ולחשוף אותו בעזרת מכחול עדין עם מזחלת קלה. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לנקות את גזע המוח מחיבור רקמות וכלי דם. שימו לב במיוחד לאזור העצב הגולגולתיה-8 והקפידו להשאיר אורך קצר של סיבי עצב שלמים משני הצדדים.</li>
	<li>להפריד את גזע המוח מהמוח הקטן על ידי חיתוך peduncles והסרת כלי הדם בזהירות. לקצץ את גזע המוח של כלי דם נוספים. הערה: ודא שההליך כולו מבוצע ב-dACSF מקורר קרח המבעבע ברציפות בקרבוקסיגן (95% O 2/5% CO2).</li>
</ol>5. חיתוך ויברטום
הערה: בשלבים הבאים, יש לתמוך בחלק האחורי של הרקמה עם חתיכת אגרוז מעוקבת.
<ol><li>הניחו את להב הוויברטום לאורך הציר האופקי והדביקו את גזע המוח על מגש חיתוך. הדביקו את הצד הרוסטרלי, תוך שמירה על הציר הרוסטרלי-קאודלי אנכי לפרוסות קורונל.<ol><li>שמור על הציר הצדדי-מדיאלי אנכי עבור פרוסות סגיטליות.</li>
		<li>הדביקו את הצד הגחוני, ושמרו על הציר הגבי-גחוני אנכי לפרוסות אופקיות.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי להשיג את המישור הסאגיטלי-אופקי הזוויתי החריף, הדביקו את הצד הגחוני של גזע המוח, תוך שמירה על הציר הגחוני-גבי אנכי על משטח ההיפוטנוז של גוש האגרוז, שנחתך בזווית של 45°. הדביקו את המשטח הנגדי של גוש האגרוז הפונה למגש החיתוך ושמרו על הציר הרוסטרלי-קאודלי במקביל לקצה הלהב.</li>
</ol>6. טיפול בחתיכות שבריריות או גדולות של רקמת גזע המוח
<ol><li>בגישה חלופית לשלב 5, טבלו את גזע המוח המבודד בנקודת התכה נמוכה (LMP) בטמפרטורה של ~40 מעלות צלזיוס בצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ.<ol><li>לאחר ששפכו אגרוז על גזע המוח השקוע, הניחו את צלחת הפטרי על קרח כדי להתמצק. חותכים את גוש האגרוז המעוקב עם גזע מוח מוטבע באמצעות סכין גילוח חדה.</li>
	</ol></li>
	<li>הדביקו את גוש האגרוז LMP על הצד הרוסטרלי שלו, תוך שמירה על הציר הרוסטרלי-קאודלי של גזע המוח אנכי.<ol><li>קח פרוסות קורונל עד שניתן יהיה לדמיין את אזור NM.</li>
		<li>הסר את בלוק agarose מן הדבק עם להב חד. כדי לזהות את הגרעינים, הניחו בעדינות 0.5 μL של צבע (טולוידין כחול או כתום G) על NM עם מחט עדינה.</li>
		<li>הרכיבו מחדש בלוק זה על מגש החיתוך לפרוסות סגיטליות או אופקיות וזהו את הגרעינים ביחס לאזור המוכתם.</li>
	</ol></li>
	<li>לקבלת הביצועים הטובים ביותר, הגדר את מהירות חיתוך הוויברטום ל- 4 - 5 (~ 30 ± 4 מ"מ לדקה), תדר רטט ב- 85-87 הרץ וחותך משרעת ב- 4-6 (~ 1 ± 0.2 מ"מ).</li>
	<li>לאחר חיתוך גזע המוח, הניחו את הפרוסות שנאספו ברצף של 200-300 מיקרומטר בתא פרוסות זמין מסחרית כדי שיווי משקל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ב-ACSF, עם בועות רציפות בתערובת של 95% O 2/5% CO 2 (pH 7.2-7.4, אוסמולריות 300-310 mOsm/L). בתנאים אלה, פרוסות להישאר קיימא עד 5-6 שעות.</li>
</ol>7. אלקטרופיזיולוגיה: הליך מהדק טלאי
<ol><li>העבר פרוסת גזע מוח לתא ההקלטה עם זלוף מתמשך של ACSF קרבוקסיגנציה ~ 1.5 ± 0.5 מ"ל לדקה.</li>
	<li>משוך פיפטות טלאי עם מושך מיקרופיפט בקוטר קצה 1-2 מיקרומטר והתנגדות בטווח של 3-6 MΩ.<ol><li>מלאו פיפטות בתמיסה פנימית מבוססת K-גלוקונט (להקלטת מהדק זרם).</li>
	</ol></li>
	<li>כדי לבחון את התכונות העצביות באזורים הטונוטופיים השונים בתוך פרוסה, אתר תאי עצב בשני קצות מישור הפרוסה והתקרב באמצעות אלקטרודת ההקלטה.</li>
	<li>שמרו על לחץ אוויר חיובי בקצה הפיפטה תוך כדי התקרבות לנוירון.</li>
	<li>לנוע לכיוון סומה עד כניסה הוא הדמיה על הנוירון. בצע את שני השלבים הבאים במהירות.</li>
	<li>צרו אטימה של ג'יגה-אוהם (1 GΩ) על ידי שחרור לחץ אוויר חיובי.</li>
	<li>שמור על הגדרת המגבר במצב מהדק מתח ותקן את היסט הפיפטה כאפס pA. הפעל בדיקת איטום (דופק בדיקה של 10 mV ב-100 הרץ). החל לחץ אוויר שלילי כדי לקרוע חלק קטן של הממברנה העצבית.</li>
	<li>כדי לבחון את המאפיינים הפנימיים הפעילים של נוירונים שמיעתיים, החל זריקות זרם סומטי היפרפולריזציה ודה-פולריזציה. הערה: ניתן להציג דוגמאות להליך זה בווידאו משלים S1, S2. פרטים על הליך זה מסופקים באגדות הווידאו.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> Journal of Comparative Neurology. 164 (4), 411-433 (1975).</li><li>Rubel, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> Journal of Comparative Neurology. 166 (4), 469-489 (1976).</li><li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+synaptic+activity+in+chick+vestibular+nucleus+neurons+during+the+perinatal+period.">Spontaneous synaptic activity in chick vestibular nucleus neurons during the perinatal period.</a> Neuroscience. 127 (1), 81-90 (2004).</li><li>Fukui, I., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonotopic+gradients+of+membrane+and+synaptic+properties+for+neurons+of+the+chicken+nucleus+magnocellularis.">Tonotopic gradients of membrane and synaptic properties for neurons of the chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 24 (34), 7514-7523 (2004).</li><li>Sanchez, J. T., Seidl, A. H., Rubel, E. W., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices.">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2527 (2011).</li><li>Sanchez, J. T., Lu, Y., Fay, R. R., Popper, A. N., Cramer, K., Coffin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+signaling+in+the+auditory+brainstem.">Glutamate signaling in the auditory brainstem.</a> Auditory Development and Plasticity: Springer Handbook of Auditory Research. 64 (4), 75-108 (2017).</li><li>Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+axosomatic+endings+in+an+avian+cochlear+nucleus:+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken.">Morphology of axosomatic endings in an avian cochlear nucleus: nucleus magnocellularis of the chicken.</a> Journal of Comparative Neurology. 203 (3), 425-440 (1981).</li><li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+alterations+of+neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+developing+chicken:+a+Golgi+study.">Sequential alterations of neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the developing chicken: a Golgi study.</a> Neuroscience. 7 (4), 837-853 (1982).</li><li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl.">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li><li>K&#246;ppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis:+differences+between+low+and+high+frequencies.">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> Journal of Comparative Neurology. 339 (3), 438-446 (1994).</li><li>Fukui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+phase+information+at+low+sound+frequency+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken.">Improvement of phase information at low sound frequency in nucleus magnocellularis of the chicken.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 633-641 (2006).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+regulates+synaptogenesis+in+vivo+in+the+developing+cochlear+nucleus.">Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem.">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).</li><li>Hong, H., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed+and+precision:+structural+and+functional+specialization+in+the+cochlear+nucleus+of+the+avian+auditory+system.">Need for speed and precision: structural and functional specialization in the cochlear nucleus of the avian auditory system.</a> Journal of Experimental Neuroscience. (12), 1-16 (2018).</li><li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+intrinsic+properties+shape+functional+phenotype+of+low-frequency+neurons+in+the+auditory+brainstem.">Diverse intrinsic properties shape functional phenotype of low-frequency neurons in the auditory brainstem.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-24 (2018).</li><li>Wang, X., Hong, H., Brown, D. H., Sanchez, J. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+neural+properties+in+the+low-frequency+region+of+the+chicken+cochlear+nucleus+magnocellularis.">Distinct neural properties in the low-frequency region of the chicken cochlear nucleus magnocellularis.</a> eNeuro. 4 (2), 1-26 (2017).</li><li>Tabor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonotopic+organization+of+the+superior+olivary+nucleus+in+the+chicken+auditory+brainstem.">Tonotopic organization of the superior olivary nucleus in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1493-1508 (2012).</li><li>Lipovsek, M., Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+development+of+brainstem+vestibular+and+auditory+nuclei.">Conserved and divergent development of brainstem vestibular and auditory nuclei.</a> Elife. 7, 40232 (2018).</li><li>Passetto, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+the+AMPA-type+neurons+in+the+Deiter's+vestibular+complex+of+the+chick+brain.">Morphometric analysis of the AMPA-type neurons in the Deiter's vestibular complex of the chick brain.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 35 (4), 334-345 (2008).</li><li>Curry, R. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+properties+of+avian+interaural+level+difference+sound+localizing+neurons.">Intrinsic properties of avian interaural level difference sound localizing neurons.</a> Brain Research. 1752, 147258 (2021).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 14 (59), 449-450 (1973).</li></ol>

כל המחברים מצהירים כי המחקר נערך ללא כל אינטרס מסחרי או כספי וכי אין להם כל ניגוד עניינים.

מקטעים קורונליים של רקמת גזע המוח העוברי של עוף אפשרו לחקור למינה בתדירות iso אינדיבידואלית יחסית במשך עשרות שנים 1,2,5. עם זאת, הארגון הטונוטופי (כלומר, התדירות) של גזע המוח השמיעתי של התרנגולת מפותל מבחינה טופולוגית ועשוי להיות נגיש יותר בצירים אנטומיים אחרים בהתאם לשאלת המחקר הספציפית. אף על פי שמספיק לחקור שאלות אנטומיות ופיזיולוגיות הנוגעות לאזורים בודדים בתדר איזו, חקר הווריאציות הטונוטופיות והתפתחותן על פני אזורים גדולים יותר בגזע המוח השמיעתי מוגבלים במידה מסוימת על ידי חתכים קורונליים. כדי להתגבר על מגבלה זו, פרוטוקול זה מתאר גישות במישור הסגיטאלי, האופקי והאופקי/רוחבי כדי לספק דוגמאות נוספות לרקמת גזע המוח השמיעתית המציגה תכונות טונוטופיות ושיפועים מרביים במקטע גזע מוח בודד.
מקטעים סגיטליים של אזורי גזע המוח השמיעתיים מראים כי אזורים טונוטופיים שונים מפוזרים על פני אזור גדול יותר בתוך הפרוסה בהשוואה למקטעים קורונליים (אזור שמיעתי סגיטלי = ~300-600 מיקרומטר, אזור שמיעתי קורונלי = ~200-350 מיקרומטר). לדוגמה, אזורי NM ו-NL הודגמו על פני שטח גדול יותר לאורך הציר הרוסטרו-קאודלי במקטעים סגיטליים (לדוגמה, איור 2B), והשיפוע הטונוטופי הפונקציונלי שעובר לאורך הציר האנטומי הזה נכלל במידה רבה בתוך פרוסה סגיטלית אחת. זה אושר עוד יותר עם הקלטות של מהדק זרם של הבדלים עצביים פנימיים המשתנים לאורך השיפוע הרוסטרלי-קאודלי כפי שדווח קודם לכן14,15 (למשל , איור 3C,D). ניסויים עתידיים המדגישים תכונות אנטומיות ואימונוהיסטוכימיות לאורך ציר הטונוטופיק יוכלו להמשיך ולחקור שיפועים ידועים של תכונות שמיעתיות במישור פרוסה סגיטלית אחת. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, לדפוסי צביעת MAP2 וביטוי תעלות אשלגן, שהם שיפועים ידועים של ארכיטקטורה דנדריטית ותכונות פנימיות של NM ו- NL שהוצגו בעבר בסעיפים קורונליםעוקבים 16.
מקטעים אופקיים של אזורים שמיעתיים בגזע המוח מראים שה-NM וה-NL ממוקמים לכיוון קו האמצע. חלק מהסיבים האקסונאליים השמיעתיים עוברים באלכסון או בניצב למישור האופקי (איור 4). סיבים אלה יכולים להיות מלווים על ידי יצירת פרוסה זוויתית חריפה 45° למישור sagittal. הפרוסות האופקיות/רוחביות שהתקבלו היו גדולות יותר מהפרוסות הסגיטליות או האופקיות, וסיבים אקסונאליים ארוכים עברו דרך הציר הרוסטרו-קאודלי הן עבור הצדדים האיפסילטרליים והן עבור הצדדים הקונטרלטרליים. גם NM וגם NL ניתנים להדמיה באזור אלכסוני גדול יותר (~ 400-700 מיקרומטר) כך שניתן לדמיין קשרים קונטרלטרליים לאורך ציר רוחבי-מדיאלי. בנוסף, מישור הפרוסה האופקית/רוחבית מראה גם כיצד אזורי השמיעה והשיפוע הטונוטופי שנוצר כתוצאה מכך מבצעים סיבוב זוויתי (איור 5). חשיפה זוויתית של קשרים קונטרלטרליים באזור גדול יותר הופכת את הפרוסות הללו למתאימות יותר לגירוי אלקטרופיזיולוגי ולמחקרי מיקרו-מעגלים מאשר פרוסות קורונליות מסורתיות.
יתרונות נוספים היווצרותם של מיקרו-מעגלים שמיעתיים דורשת תיאום מרחבי-טמפורלי של רמזים המקדמים הישרדות עצבית, סינפטוגנזה, התמיינות אקסונאלית, ארכיטקטורה דנדריטית והתבגרות. לפיכך, ניתן להשתמש בחלקי גזע מוח חלופיים של המיקרו-מעגל השמיעתי של עובר העוף לנושאי המחקר הבאים: ארגון מורפולוגי של נוירונים בממדים שונים מבחינה טופוגרפית; ארגון ומיפוי החיבורים של כל גרעיני השמיעה ושיווי המשקל; זיהוי ואפיון דפוסי הפעילות של מרכיבי מעגלים במישורים איזו-תדרים וטונוטופיים; הארגון הטופוגרפי של מיקרו-מעגלים מעוררים לעומת מעכבים ויחסים לאוכלוסיות נוירונים מיוחדות (גרעינים); מיקום מרחבי של גרעינים שמיעתיים נוירונים וחיזוי CF17; מיקוד שיטתי של סוגים עצביים טונוטופיים ספציפיים; מעקב אחר תאי אב והתפתחותם לגרעינים משומרים; שושלת גנטית של תאים לאבולוציה של מעגלים עצביים18; אנטומיה השוואתית של גזע המוח בין מינים; חקירה של מעגלים שיווי משקל כמו קומפלקס שיווי המשקל של דייטר (DC)19; וסינכרוניזציה ושיחות צולבות בין גרעיני שיווי המשקל.
גישה רבת פנים המשתמשת במישורי פרוסה שונים עשויה לעזור לענות על שאלות בסיסיות לגבי תכונות אנטומיות וביופיזיות לא ידועות של מיקרו-מעגלים בגזע המוח. דוגמה טובה לכך היא הקשר בין גרעיני השמיעה העיקריים (NM, NA, NL ו-SON) לבין גרעיני שיווי המשקל, כולל הגרעין הגבי של הלמניסקוס הלטרלי (LLDp), הגרעין הסמי-לונארי (SLu)20 והגרעין המשיק (TN)3. עם זאת, לפרוטוקול זה ולמחקרים מבוססי פרוסות אלה יש כמה מגבלות.
אמצעי זהירות ומגבלות בהתאם למוסד המבצע את הניסויים, הנחיות אתיות והטיפול בעוברי עוף עשויים להיות שונים. בעוד שהנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה מתירות עריפה מהירה, ישנן שיטות חלופיות להמתת חסד של עוברי עוף21. רקמת גזע המוח של עובר עוף המתפתח מוקדם היא רכה ועדינה בהשוואה לעוברים מבוגרים יותר. יש לו כמה קשרים וכלי דם על פני השטח הזקוקים לזהירות יתרה בעת הסרתם. הרקמה צריכה להישמר ב-dACSF קר כקרח ולחמצן אותה עם 95% O 2/5% CO2 כדי להגדיל את הכדאיות.
שיטת החיתוך הסגיטלית שימושית רק עבור טונוטופיה איפסילטרלית. שיטת חיתוך זו מספקת פרוסות גדולות יותר מאשר פרוסות קורונליות, שהטיפול בהן עלול להיות מסוכן. עם זאת, ניתן לחתוך את הפרוסות בשיטות מחט צולבות המתוארות בפירוט במקום אחר22. שימוש בגזע מוח משובץ של 4% LMP agarose יכול להציל מבנים עדינים בפרוסות, אך יש להיזהר שלא לשפוך אגרוז חם מדי. הגדרתו במהירות על ידי הצבת גזע המוח החסום באגרוז בסביבה מצוננת למשך ~ 1 דקות הופכת את הפרוסות לישימות יותר להקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
יישום של superglue בכמויות עודפות יכול להיות רעיל. זה חייב להיות מיושם באופן מינימלי, כמויות עודפות יש לשטוף מיד על ידי שינוי dACSF. עבור פרוסות זוויתיות חריפות (45°), חיתוך הזווית של גוש האגרוז הוא קריטי; ניתן להשתמש במראה כדי לראות את הזווית הקדמית תוך כדי חיתוך גוש האגרוז עם להב חד. להבים מסחריים עשויים להיות בעלי ציפוי שעווה שיש לנגב עם אלכוהול ולייבש לפני השימוש. אופטימיזציה נדרשת עבור מהירות ותדירות חיתוך הוויברטום מכיוון שצינורות סיבים אקסונאליים קשים יותר מרקמת קליפת המוח או מטריקס. שמירה על משרעת גבוהה ושימוש בתמיסת דיסקציה מקוררת עשויים למנוע נזק לרקמות.
כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים טריים, ו Ca 2 + ו Mg 2+ יש להוסיף ACSF לאחר מבעבע 95% O 2/5% CO 2 . אחרת, ייתכנו משקעים של Ca2+. יש להשתמש במכחול כדי לטפל בפרוסות בעדינות בתוך הוויברטום. שמור על זמן החיתוך הכולל מתחת ל-15 דקות במידת האפשר. ניתן להשתמש בפיפטת פסטר מזכוכית כדי לתמרן פרוסות גזע המוח.
אין להשתמש בחומרי ניקוי או חומרי כביסה קורוזיביים עבור כלי זכוכית וציוד הבאים במגע עם הפרוסות המשמשות באלקטרופיזיולוגיה. התמונות שצולמו מייצגות את המראה של רקמה בעובי 200-300 מיקרומטר תחת אופטיקה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC). איכות הראייה תהיה ירודה יותר מאימונוהיסטוכימיה או ממיקרוסקופיית אלקטרונים, אך היא משקפת במדויק את מה שהנסיין יראה בעת ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
מחקרים הנוגעים להתפתחות מוקדמת של מיקרו-מעגלים לאורך ציר אנטומי חלופי, בין אם הם גב-גחוני, רוסטרלי-קאודלי או איפסילטרלי-קונטרלטרלי, מוגבלים בגזע המוח השמיעתי של התרנגולת. אחת הסיבות לכך היא שתפקידם של קודי שעתוק וויסות ההתפתחות הטונוטופית בגזע המוח עדיין אינו מובן במלואו. תופעות פונקציונליות כגון אפנון מלמעלה למטה ופעילות ספונטנית אובדות לעתים קרובות כאשר מתבוננים בפעילות במבחנה. עם זאת, מחקר in vivo משלים הקלטות ספציפיות וישירות של נוירונים בודדים האפשריים רק בתנאי פרוסה אלה. העידון של קבלת רקמת גזע המוח בכיוונים שונים יכול לספק מידע תובנה על ההתפתחות והמורכבות של שיפועים טונוטופיים במיקרו-מעגלים של גזע המוח השמיעתי.

עובר התרנגולת הוא מודל מחקרי רב ערך לחקר שאלות ביולוגיות בסיסיות בתחומים מדעיים רבים ומגוונים, כולל ביולוגיה של התא, אימונולוגיה, פתולוגיה ונוירוביולוגיה התפתחותית. המיקרו-מעגלים של גזע המוח השמיעתי של העוף הם דוגמה מצוינת למעגל מיוחד מאוד שניתן להבין במונחים של מורפולוגיה שמיעתית ופיזיולוגיה. לדוגמה, רובל ופארקים (1975) תיארו לראשונה את האוריינטציה הטונוטופית (כלומר, שיפוע התדרים) של גרעין העוף מגנוצלולריס (NM) וגרעין למינריס (NL) כפונקציה ליניארית על פני ציר הגרעינים, בכיוון ~30° ביחס למישור הסגיטאלי. תאי עצב בודדים ב-NM וב-NL מקודדים את תדר הצליל הטוב ביותר שלהם - הידוע בשם התדר האופייני שלהם (CF) - לאורך המישור הרוסטרלי-מדיאלי עד לאזור הקאודו-לרוחב. נוירונים רגישים לתדר גבוה נמצאים באזור הרוסטרלי-מדיאלי ונוירונים רגישים לתדר נמוך ממוקמים באופן קאודו-לרוחבי. לפיכך, שיטות דיסקציה מסורתיות של רקמת גזע המוח השמיעתית לחקר תכונות טונוטופיות השתמשו בפרוסות קורונל עוקבות. ואכן, מיקרו-מעגלים שמיעתיים של עוברי עוף מתפתחים הוקמו כמערכת מודל לחקר עיבוד אותות של תפקודים שמיעתיים טונוטופיים באמצעות פרוסות גזע מוח רציפות של מישור קורונלי קואורלי במשך עשרות שנים 1,2,3,4,5,6.
עם זאת, הארגון הטונוטופי של NM ו- NL הוא מפותל מבחינה טופולוגית ומורפולוגית. תשומות עצב השמיעה מופצות כך שכניסות CF גבוהות מסתיימות במבנים דמויי אנדבולב המכסים לפחות רבע מההיקף הסומטי של תא NM אדנדריטי. לעומת זאת, כניסות CF נמוכות אינן מאורגנות עם הדקים דמויי נורה סופית אלא עם מספר סינפסות בוטון על דנדריטים של נוירוני NM. כניסות CF אמצעיות מסתיימות הן כנורת קצה והן כסינפסות דמויות בוטון 4,7,8,9,10,11,12. ב-NL, השיפוע הדנדריטי הסטריאוטיפי ביותר ניכר לא רק באורך הדנדריטי אלא גם ברוחב הדנדריטי. שיפוע דנדריטי ייחודי זה תואם באופן הדוק את ציר הטונוטופ. הדנדריטים עוברים עלייה של פי 11 באורך ועלייה של פי חמישה ברוחב מתאי עצב בעלי CF גבוה לנמוך,בהתאמה 6. כדי להתגבר על התפלגויות מפותלות כאלה של גרעינים אלה בפרוסות קורונליות, פרוטוקול זה מתאר גישות דיסקציה במישור הסגיטלי, האופקי והאופקי/רוחבי. טכניקות חיתוך אלה מספקות דוגמאות לרקמת גזע מוח שמיעתית המציגה תכונות טונוטופיות מרביות במישור פרוסה בודד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop 2021</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-vibration table 30&#34;x 36&#34; - OTMC - 63533</td>
			<td>TMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sens standard software</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital amplifier&#160; multiclamp 700B</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSK line-up linearslicer pro7</td>
			<td>TED PELLA, INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2</td>
			<td>OLYMPUS AMERICA INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller P-97</td>
			<td>SUTTER INSTRUMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope BX51W1</td>
			<td>OLYMPUS AMERICA INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS ICE software</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohaus balance model AV212</td>
			<td>Ohaus Adventurer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus DPSI0 /DPS80 camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter lab 850 benchtop</td>
			<td>SCHOTT INSTRUMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp stainless blade</td>
			<td>Dorco/Personna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapor pressure osmometer model 5600</td>
			<td>WESCOR INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purification systems Smart2pure 6UV/UF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals- list</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrose Low melt IB70051</td>
			<td>IBI SCIENTIFIC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (Calcium Chloride)</td>
			<td>ACROS organics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cynergy instant adhesive CA6001</td>
			<td>Resinlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-(+)-glucose)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>IBI SCIENTIFIC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td>Amresco.Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium Chloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td>Amresco.Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate)</td>
			<td>Amresco.Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (Sodium Bicarbonate)</td>
			<td>Amresco.Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing the embryonic chicken auditory brainstem to evaluate tonotopic gradients and microcircuits

עובר התרנגולת הוא מודל חייתי מקובל לחקר גזע המוח השמיעתי, המורכב ממיקרו-מעגלים מיוחדים מאוד וטופולוגיה עצבית בכיוון דיפרנציאלי לאורך ציר טונוטופי (כלומר, תדר). הציר הטונוטופי מאפשר קידוד מופרד של צלילים בתדר גבוה במישור הרוסטרלי-מדיאלי וקידוד בתדר נמוך באזורים קאודו-לרוחביים. באופן מסורתי, פרוסות גזע מוח קורונליות של רקמה עוברית מאפשרות לחקור למינה בתדר ISO אינדיבידואלי יחסית. אף על פי שמספיק לחקור שאלות אנטומיות ופיזיולוגיות הנוגעות לאזורים בודדים בתדר איזו, חקר השונות הטונוטופית והתפתחותה על פני אזורים גדולים יותר בגזע המוח השמיעתי מוגבל במקצת. פרוטוקול זה מדווח על טכניקות חיתוך גזע המוח מעוברי תרנגולות הכוללות שיפועים גדולים יותר של אזורי תדר בגזע המוח השמיעתי התחתון. השימוש בשיטות חיתוך שונות לרקמת גזע המוח השמיעתית של עוף מאפשר ניסויים אלקטרופיזיולוגיים ואנטומיים בתוך פרוסת גזע מוח אחת, שבה נשמרים טוב יותר שיפועים גדולים יותר של תכונות טונוטופיות ומסלולים התפתחותיים מאשר חתכים קורונליים. טכניקות חיתוך מרובות מאפשרות חקירה משופרת של התכונות האנטומיות, הביופיזיות והטונוטופיות המגוונות של מיקרו-מעגלים שמיעתיים בגזע המוח.

Watch this Scientific Journal Video about Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits at JoVE.com

Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשגת פרוסות גזע מוח שמיעתיות שאינן קורונליות של עובר העוף לחקר תכונות טונוטופיות ומסלולים התפתחותיים בתוך פרוסת גזע מוח אחת. פרוסות אלה כוללות מקטעים סגיטליים, אופקיים ואופקיים/רוחביים המקיפים אזורים טונוטופיים גדולים יותר בתוך מישור פרוסה בודד שהמקטעים הקורונליים המסורתיים.

חיתוך גזע המוח השמיעתי של העוף העוברי להערכת שיפועים טונוטופיים ומיקרו-מעגלים

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology ...

שיטה זו רוכשת פרוסות חיות של גזע המוח השמיעתי של התרנגולת, הכוללות שיפוע גדול יותר של אזור התדר באותה פרוסה. פרוסות אלה מתאימות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים ואנטומיים בעלי ציר טונוטופי גדול יותר. מתודולוגיה זו תסייע להבין את התפתחות המיקרו-מעגלים בגזע המוח השמיעתי.בעוד שהאנטומיה היא ספציפית לתרנגולת, למיני עופות אחרים כמו שליו וציפורי שיר יש אנטומיה דומה. כדי להתחיל, לעקר את הביצים עם 70% אתנול לדגור אותם ב 38 מעלות צלזיוס ו 50% לחות. לאחר מכן, להגדיר את קצב מבעבע עבור ACSF כך ה- pH הוא 7.2 עד 7.4 עם osmolality בין 300 ל 310 milliosmolar לליטר.ואז לערבב חמישה גרם של agarose ב 100 מיליליטר של dACSF. ממיסים את האגרוז לחלוטין בעזרת אמבט מים או מיקרוגל עד שהאגרוז מתחיל לבעבע. יוצקים את האגרוז המומס לתוך צלחת פטרי עד עובי של חמישה מילימטרים ושומרים על טמפרטורת החדר כדי לקבוע.לאחר ההגדרה, אוטמים את צלחת הפטרי ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס. חותכים את האגרוז לגושי תא לשימוש בזמן הנתיחה. ראשית, נקה את אזור הדיסקציה באמצעות 70% אתנול.הדביקו את גוש האגרוז התומך או הזוויתי על מגש הוויברטום. מניחים את הביצה תחת אור בהיר ומאתרים את החלל המלא באוויר בצד הגדול או העגול יותר של הביצה, ואז מפצחים את הקליפה מעל החלל המלא באוויר וחושפים את שק הממברנה. לעשות חתך עדין בשק כדי לחשוף את המקור.בעזרת אזמל, משכו בעדינות את הצוואר והראש מתוך הביצה. לאחר עריפת ראש, לנקות את הראש עם dACSF מצונן. החזיקו את הראש יציב ב-dACSF מצונן ובצעו חתך רוסטרוקאודלי.מתחילים את החתך מאחורי ובין העיניים ועוקבים אחר אורך הצוואר שנקטף. להפריד את העור כדי לחשוף את הגולגולת. חותכים את הגולגולת מאחורי העין בקו האמצע לכיוון לרוחב.חזור על הפעולה עבור שתי ההמיספרות. פורסים את החלק הרוסטרלי של הגולגולת על ידי הנחת הלהב מאחורי העיניים וביצוע חיתוך מהיר. ואז לטבול את הראש בצלחת של dACSF צונן.באמצעות זוג מספריים קטנים, בצע חתכים בקו האמצע לרוחב באזור הקאודאלי של הגולגולת כדי להפריד את המוח מבלי לגרום נזק לרקמות. חשוף בעדינות את גזע המוח ואת המוח הקטן. לסגת את האזור הגבי של הגולגולת כולה.הסר את גזע המוח וחשוף אותו על ידי הברשה עדינה באמצעות מברשת צבע עדינה. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לנקות את גזע המוח מחיבור רקמות וכלי דם. להפריד את גזע המוח מהמוח הקטן על ידי חיתוך peduncles והסרת כלי הדם בזהירות.לקצץ את גזע המוח של כלי דם נוספים. ראשית, מניחים את להב הוויברטום לאורך הציר האופקי. עבור פרוסות קורונליות, הדביקו את גזע המוח על מגש חיתוך בצד הרוסטרלי, תוך שמירה על הציר הרוסטרוקאודלי אנכי.לפרוסות סגיטליות, שמרו על הציר המדיאלי הצדדי אנכי. עבור פרוסות אופקיות, הדביקו את הצד הגחוני ושמרו על ציר הגחון הגבי אנכי. כדי להשיג את המישור האופקי הסגיטלי הזוויתי החריף, הדבק את הצד הגחוני של גזע המוח כך שהציר הגבי הגחוני הוא אנכי על גוש האגרוז של משטח היפוטנוז.הדביקו את המשטח הנגדי של גוש האגרוז הפונה למגש החיתוך ושמרו על ציר הרוסטרוקאודל במקביל לקצה הלהב. כחלופה לחיתוך ויברטום, טבלו את גזע המוח המבודד בנקודת התכה נמוכה ב-4% ב-40 מעלות צלזיוס בצלחת פטרי בגודל 35 על 10 מילימטר. לאחר שהאגרוז מתמצק, חותכים את גוש האגרוז של התא באמצעות סכין גילוח חדה.הדביקו את גוש האגרוז על צדו הרוסטרלי תוך שמירה על הציר הרוסטרוקאודלי של גזע המוח אנכי. קח פרוסות קורונל עד אזור NM נראה. הסר את בלוק agarose מן הדבק עם להב חד.בעזרת מחט עדינה, הניחו בעדינות 0.5 מיקרוליטרים של צבע כחול טולוידין על ה-NM כדי לזהות את הגרעינים. טען מחדש בלוק זה במגש החיתוך לקבלת פרוסות סגיטליות או אופקיות. זהה את הגרעינים ביחס לאזור המוכתם וחתך את גזע המוח.לאחר החתך, מניחים את הפרוסות שנאספו ברצף של 200 עד 300 מיקרון בתא פרוס המכיל ACSF לשיווי משקל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. מקטעים קורונליים של רקמת גזע המוח מעובר עוף E19 עד 21 מייצגים את אזורי האיזופריות היחסיים של גרעיני גזע המוח השמיעתיים מאזור השמיעה הנמוך ביותר לאזור השמיעה של התדר האופייני הגבוה ביותר. סיבי עצב השמיעה האפרנטיים והביפורקציה של אקסונים NM היו גלויים.גרעין זוויתי נצפה גם הוא. בקטעים רוסטרליים, גרעין האוליברי העליון ממוקם לאורך האזור הצדדי הגחוני של הפרוסה הקורונלית. בקטעים סגיטליים זוהו NM וגרעין למינריס או NL שבהם סיבי עצב השמיעה נכנסו לאשכול הנוירונים.גרעין האוליברי העליון זוהה באזור הרוסטרולטרלי. נצפו אזורי שמיעה בתדירות אופיינית נמוכה וגבוהה מ-NM ו-NL לאורך הציר הרוסטרוקאודלי. הפרוסה המדיאלית ביותר הראתה את הצינורות האקסונליים האיפסילטרליים והקונטרלטרליים ואת נקודת הסיום של אזור השמיעה.בפרוסות האופקיות זוהו NM ו-NL לכיוון קו האמצע, ותאי עצב התפשטו לאורך הציר המדיאלי הלטרלי. פרוסות של רקמת גזע המוח בזווית חדה ממישור אופקי הראו את גרעיני גזע המוח השמיעתיים על פני התפשטות אלכסונית גדולה. תמונות מוגדלות הראו את הציר הטונוטופי של גרעיני השמיעה לאורך הציר הרוסטרומדיאלי עד הקאודולטרלי.ודאו שהתהליך כולו מבוצע ב-dACSF מקורר קרח המבעבע ברציפות בחמצן פחמימות. פרוטוקול זה משמש חוקרים החוקרים תכונות אנטומיות וביופיזיות של מיקרו-מעגלים מתפתחים בגזע המוח, במיוחד את הקשר בין גרעיני השמיעה העיקריים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

הכנה והתרבות של שמיעתית פרוסות עוף גזע המוח

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בVestibulocochlear העוברי העופות

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Insect-controlled Robot: A Mobile Robot Platform to Evaluate the Odor-tracking Capability of an Insect

חרקים שבשליטת רובוט: פלטפורמת רובוט נייד על מנת להעריך את יכולת ריח המעקב של חרק

Robotic odor source localization has been a challenging area and one to which biological knowledge has been expected to contribute, as finding odor ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol

3D סריקה תלת-ממדית מיקרומעגלים ותמונות המוח המקברקנה בתלת-ממד הטבעה בפרוטוקול החופף

The human brain, being a multiscale system, has both macroscopic electrical signals, globally flowing along thick white-matter fiber bundles, and ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

תרבויות מועשרות חרוט מן הרשתית של עוברי עוף ללמוד מוט כדי חרוט אינטראקציות הסלולר

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...