Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

يعترف المؤلفون بدعم منصات i3S العلمية "الواجهات الحيوية وتكنولوجيا النانو" ، و "علم الأنسجة والمجهر الإلكتروني" ، وهي عضو في البنية التحتية الوطنية المنصة البرتغالية للتصوير الحيوي (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). كما نشكر البروفيسور ج. أ. غونزاليس رييس (جامعة قرطبة، إسبانيا) على المساعدة في تحسين بروتوكول تلطيخ المقاطع الرقيقة للغاية ل TEM، والدكتورة سيسيليا دورايس والدكتورة آنا ريتا بينتو (جامعة بورتو، البرتغال) على تحليل تتبع الجسيمات النانوية.
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الأمريكية (OCE-2049004 إلى SJB) ، ومن قبل صناديق Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) من خلال البرنامج التشغيلي للتنافسية والتدويل (POCI) لعام 2020 ، البرتغال ، 2020 ، ومن خلال الأموال البرتغالية من خلال Fundação para a Ciência e a Tecnologia / Ministério da Ciência ، Tecnologia e Ensino Superior في إطار المشروع POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC / BIA-OUT/29540/2017 to PO). كما تم الاعتراف بشكل كبير ب Fundação para a Ciência e a Tecnologia لزمالة الدكتوراه SFRH / BD / 130478 / 2017 (SL) ، ومنحة FCT Investigator IF/00256/2015 (PO). م. س. م. بدعم من زمالة ماري سكلودوفسكا-كوري الفردية (فريق إعادة الإدماج) ضمن البرنامج الإطاري أفق 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي هياكل كروية ، يتراوح قطرها بين ~ 20-400 نانومتر ، تطلقها جميع الكائنات الحية تقريبا في بيئتها المحيطة1،2،3. يتم تحديد الحويصلات بواسطة طبقة ثنائية الدهون ولا يمكنها تكرار نفسها. في البكتيريا سالبة الجرام ، يعتقد أن هذه الهياكل تنشأ في المقام الأول عن طريق "نفخ" أجزاء صغيرة من الغشاء الخارجي. ومع ذلك ، فإن العمليات الأخرى ، بما في ذلك حركة السوط ، وتحلل الخلايا ، وإفراز كل من مواد الغشاء الداخلي والخارجي ، يمكن أن تنتج حويصلات أيضا 4,5. يمكن أن تحتوي المركبات الكهربائية على جزيئات حيوية مختلفة ، بما في ذلك الدهون والبروتينات القابلة للذوبان والغشاء والأحماض النووية والأيضات ، ويمكن أن تنقل هذه المواد بين الخلايا4،5،6. وبالنظر إلى هذه الميزات، تجري دراسة المركبات الكهربائية لفهم أدوارها المحتملة في مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك الاتصالات الخلوية، وتكوين الأغشية الحيوية، ونقل الجينات الأفقي، وديناميكيات العاثيات المضيفة، وتبادل المغذيات 4,6.
البكتيريا الزرقاء هي مجموعة كبيرة ومتنوعة من البكتيريا سالبة الجرام ، بما في ذلك الكائنات وحيدة الخلية والخيطية. وهي ذات أهمية من وجهات نظر عديدة، بما في ذلك فهم فسيولوجيتها وتنوعها 7,8، ووظائف النظام الإيكولوجي الحرجة التي تخدمها9,10، وفائدتها للتكنولوجيا الحيوية11,12. توجد البكتيريا الزرقاء في مجموعة واسعة من الموائل ، إما ككائنات حية حرة في البيئات البحرية والمياه العذبة والأرضية ، أو في ارتباطات تكافلية مع الطحالب والسرخس والنباتات أو في الأشنات والإسفنج13. وهي تعمل كمنتجين أوليين حاسمين في النظم الإيكولوجية المائية ، حيث تنتج الأكسجين والكربون العضوي من خلال التمثيل الضوئي للأكسجين 9,10 ، وبعضها قادر على تثبيت النيتروجين في الغلاف الجوي وكذلك7. تنتج البكتيريا الزرقاء البحرية والمياه العذبة ، بما في ذلك Prochlorococcus و Synechococcus و Synechocystis ، EVs تحت ظروف المختبر 14،15،16 ، ويمكن أيضا العثور على الحويصلات البكتيرية الزرقاء في البيئات الطبيعية14،17. الوظائف البيولوجية والبيئية للحويصلات البكتيرية الزرقاء غير معروفة ، ولكن من المرجح أن توفر المزيد من الأبحاث في هذا المجال رؤى جديدة في الأسئلة المتعلقة بفسيولوجيا البكتيريا الزرقاء ، والتمايز ، واستراتيجيات الاتصال ، والتطور ، والتفاعلات الغذائية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون لقدرة المركبات الكهربائية البكتيرية الزرقاء على حمل فئات متنوعة من الجزيئات الحيوية تطبيقات تجارية18,19.
يصف هذا البروتوكول طرق عزل وتوصيف الحويصلات من مزارع البكتيريا الزرقاء والعينات الميدانية لتمكين وتشجيع إجراء فحص أوسع لبيولوجيا الحويصلات خارج الخلية البكتيرية الزرقاء. في حين أن سير العمل الموصوف هنا مشابه لبروتوكولات عزل وتوصيف المركبات الكهربائية من البكتيريا الأخرى ، فإن مزارع البكتيريا الزرقاء والعينات الميدانية تحتوي عادة على تركيزات أقل من الخلايا والحويصلات مما لوحظ عادة مع أنظمة النماذج المرتبطة بالمضيف أو المسببة للأمراض 20،21،22. وبالتالي ، فإن دراسات المركبات الكهربائية البكتيرية الزرقاء تتطلب اعتبارات خاصة وتحسينات للزراعة وعزل الحويصلة ، والتي تختلف أكثر بين السلالات والخلفيات الإعلامية. نظرا لعدم وجود بروتوكول واحد سيعمل بشكل جيد على قدم المساواة لجميع السلالات وظروف النمو والتطبيقات النهائية ، فإننا نقدم خيارات متعددة ونناقش المقايضات المعنية حتى يتمكن الباحثون من تحديد الأساليب الأكثر ملاءمة لمعالجة أسئلتهم التجريبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

البكتيريا الزرقاء هي مجموعة متنوعة من البكتيريا الضوئية سالبة الجرام التي تلعب أدوارا حاسمة في النظم الإيكولوجية العالمية وتعمل كنماذج أساسية للتكنولوجيا الحيوية. وقد أظهرت الأبحاث الحديثة أن البكتيريا الزرقاء البحرية والعذبة تنتج حويصلات خارج الخلية - وهي هياكل صغيرة مرتبطة بالغشاء تطلق من السطح الخارجي للميكروبات. في حين أن الحويصلات من المحتمل أن تسهم في العمليات البيولوجية المتنوعة ، إلا أن أدوارها الوظيفية المحددة في بيولوجيا البكتيريا الزرقاء لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. لتشجيع وتطوير البحوث في هذا المجال ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لعزل وتركيز وتنقية الحويصلات خارج الخلية البكتيرية الزرقاء. يناقش العمل الحالي المنهجيات التي نجحت في عزل الحويصلات من الثقافات الكبيرة من Prochlorococcus و Synechococcus و Synechocystis. يتم عرض طرق لقياس وتوصيف عينات الحويصلات من هذه السلالات. كما يتم وصف نهج عزل الحويصلات عن عينات الحقول المائية. وأخيرا، تناقش أيضا التحديات النموذجية التي تواجه تنقية الحويصلة البكتيرية الزرقاء، والاعتبارات المنهجية لمختلف التطبيقات النهائية، والمفاضلات بين النهج.

يقدم الشكل 1 نظرة عامة على عملية عزل الحويصلة البكتيرية الزرقاء ، مع تسليط الضوء على الجوانب الرئيسية للبروتوكول الموصوف هنا. وتجدر الإشارة بوجه خاص إلى الخطوات التي تفصل الكتلة الحيوية للبكتيريا الزرقاء عن جزء الجسيمات الصغيرة (الحويصلة)، وتركيز عينة الحويصلة وعزل الحويصلة وتنقيتها (الشكل 1، الخطوات من 2 إلى 4)، وهي خطوات حاسمة للحصول على مستحضرات قابلة للتكرار من الحويصلات. يعرض الشكل 2 نتائج تمثيلية من عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية من البكتيريا الزرقاء Synechocystis sp. PCC 6803. وقد تبين أن الغشاء الخارجي لهذه البكتيريا الزرقاء يحتوي على الكاروتينات31 ، والتي تضفي تلوينا برتقاليا مميزا على عينات الحويصلات التي يتم جمعها عن طريق التكوير المباشر من خلال الطرد المركزي الفائق (الشكل 2A). بمجرد إنعاش حبيبات الحويصلة، يمكن فحص الحويصلات عن طريق المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)، إما عن طريق تلطيخ العينات سلبا بخلات اليورانيل (الشكل 2B) أو عن طريق مراقبة المقاطع الرقيقة جدا (الشكل 2C). يمكن تقييم توزيع حجم الحويصلة وتركيزها باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) (الشكل 2D) وتحليلات تتبع الجسيمات النانوية (NTA) (الشكل 2E). باستخدام البروتوكول الموصوف ، عادة ما يتم الحصول على ~ 3.5 ± 1.0 × 108 جسيمات نانوية لكل مل في ثقافة متنامية بشكل كبير من Synechocystis sp. PCC 6803 في OD730 من 1.0. يمكن إجراء التحليلات البيوكيميائية للمركبات الكهربائية المعزولة لاستكمال التوصيف الفيزيائي للحويصلات المعزولة. على سبيل المثال ، تم فصل حويصلات Synechocystis sp. PCC 6803 المنقاة على هلام SDS-polyacrylamide وملطخة بالسكريات الدهنية (LPS; الشكل 2 واو). نظرا لأن LPS خاص بالغشاء الخارجي32 ، فإن اكتشاف LPS يمكن أن يتحقق من وجود حويصلات مرتبطة بالغشاء ويعمل كعلامة لتحليل محتوى الحويصلة النسبية بين المستحضرات من نفس السلالة33. يمكن أن يشير فحص الوفرة النسبية ل LPS منخفض الوزن مقابل الوزن الجزيئي العالي إلى تغيرات في تكوين الحويصلة بين العينات34,35.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> الشكل 1: الإجراءات التجريبية المستخدمة لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية البكتيرية الزرقاء. التمثيلات التخطيطية للثقافات المتنامية (1) وفصل الكتلة الحيوية البكتيرية الزرقاء عن وسط النمو (2). تتركز العينات الخالية من الخلايا التي تحتوي على حويصلات (3) ، ثم يتم عزل المركبات الكهربائية وتنقيتها (4). اعتمادا على التطبيق ، يمكن وصف مستحضرات الحويصلة باستخدام واحد أو مزيج من المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، وتشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، وتوصيف عديد السكاريد الشحمي (LPS) (5). RT ، درجة حرارة الغرفة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> الشكل 2: النتائج التمثيلية لعزل الحويصلة خارج الخلية وتوصيف البكتيريا الزرقاء Synechocystis sp. PCC 6803. (أ) صورة فوتوغرافية لحبيبة الحويصلة خارج الخلية (بيليه EVs) التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي الفائق للوسط خارج الخلية المركز الخالي من الخلايا من مزرعة Synechocystis sp. PCC 6803 التي تبلغ سعتها 600 مل والتي نمت إلى OD730 من 1.0-1.5. لاحظ التلوين البرتقالي النموذجي لحبيبات الحويصلة المشتقة من الكاروتينات الموجودة في الغشاء الخارجي. (ب، ج) صور المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) للمقاطع ذات البقع السلبية (B) والرقيقة جدا (C) من عينات الحويصلة Synechocystis sp. PCC 6803. أشرطة المقياس: 200 نانومتر و 50 نانومتر ، على التوالي. تم تصور العينات على مجهر إلكتروني ناقل يعمل بسرعة 80 كيلو فولت. (د) مخطط نموذجي لتشتت الضوء الديناميكي (DLS) يصور توزيع حجم الحويصلة كدالة لقطر الحويصلة (بالنانومتر). تشير الخطوط الملونة إلى بيانات من ثلاثة قياسات تقنية مكررة لنفس العينة. (ه) بيانات تحليل تتبع الجسيمات النانوية التمثيلية (NTA) لتوزيع حجم الحويصلة خارج الخلية Synechocystis (بالنانومتر). يشير الخط الأسود إلى متوسط ثلاثة تكرارات فنية، وتمثل الخطوط الحمراء الخطأ القياسي للمتوسط. (F) تم الكشف عن ملف تعريف عديدات السكاريد الشحمية (LPS) بعد فصل إعداد الحويصلة عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام SDS-polyacrylamide بنسبة 16٪ (w / v) والتلطيخ باستخدام مجموعة تلطيخ LPS تجارية. يمكن اكتشاف LPS منخفض الوزن وعالي الوزن الجزيئي ، المقابل لأشكال LPS الخشنة والملساء ، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الملف التكميلي 1: معادلة لحساب r. يتم تحديد عدد الحويصلات المنتجة لكل خلية لكل جيل بين نقطتين أثناء النمو الأسي (عادة بداية ونهاية الدورة الزمنية) باستخدام هذه المعادلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

يقدم هذا البروتوكول وصفا مفصلا لعزل وتركيز وتوصيف الحويصلات خارج الخلية من مزارع البكتيريا الزرقاء. كما تناقش نهج لتنقية الحويصلات من الثقافات على مستويات مختلفة، والمفاضلات بين المنهجيات، واعتبارات العمل مع العينات الميدانية.

عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية البكتيرية الزرقاء

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

هذا البروتوكول مهم لأنه لا يوضح فقط نهج لتنقية الحويصلات من الثقافة على مستويات مختلفة ، والمفاضلات ، والاختلافات بين المنهجيات ، وكذلك النظر في العمل مع العينات الميدانية. تقدم البكتيريا الزرقاء تحديات فريدة لأخذ عينات الحويصلة وتحليلها. وقد نجحت هذه التقنيات في عزل وتركيز الحويصلات من الثقافة ومن العينات البيئية.لتركيز عينات أقل من 500 ملليلتر، ابدأ بشطف مكثفات الطرد المركزي فائقة الترشيح التي يتراوح حجمها بين 15 و20 ملليلتر بمياه فائقة النقاء من النوع 1. قم بتحميل المكثفات في جهاز الطرد المركزي وقم بالدوران عند 4،400 × g عند أربع درجات مئوية. تجاهل التشغيل وكرر الخطوة مرتين على الأقل.قم بتحميل العينة الفائقة في مكثف مغسول بالماء وقم بالدوران تحت نفس الظروف. كرر هذه الخطوة حتى تتركز العينة إلى حجم نهائي من 15 إلى 30 ملليلتر. لتركيز حجم يزيد عن 500 ملليلتر، قم بإجراء ترشيح التدفق العرضي عن طريق إعداد الجهاز كما هو موضح في المخطوطة.قم بتوصيل مضخة تمعجية بخط السحب ووضع مشابك قابلة للتعديل على خط الثبات. قم بتعقيم ترشيح التدفق العرضي كما هو موضح في المخطوطة ، ثم اغسل الجهاز بلتر واحد من الماء فائق النقاء من النوع 1. أضف أقل من 0.2 ميكرون ترشيح إلى خزان العينة.قم بزيادة سرعة المضخة ببطء ومستويات الضغط الخلفي على خط الارتداد لزيادة الإنتاج من خطوط الترشيح. استمر في تشغيل ترشيح التدفق العرضي وإعادة ملء الخزان بمادة الاستزراع الفائقة عند إزالة المادة. توقف عن تركيز العينة بمجرد وصول الحجم الموجود في الخزان إلى أدنى كمية ممكنة مطلوبة للحفاظ على التدفق إلى خط السحب دون إدخال فقاعات الهواء.أغلق خط التدفق الخارجي بمشبك. قم بإزالة الضغط الخلفي على خط التوقف. أعد تدوير المادة الفائقة المركزة من خلال الفلتر لمدة 10 دقائق ، مما يقلل من معدل إعادة التدوير من 20 إلى 40 ملليلتر في الدقيقة لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش.انقل خط الارتداد إلى وعاء نظيف ، وقم بإزالة خط السحب من العينة وجمع المواد المركزة. استرجع أي مواد متبقية في خزان العينة باستخدام ماصة. قم بتصفية السوبرناتانت المركز من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون.إذا لزم الأمر، قم بتخزين التركيز النهائي عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة أسابيع تقريبا قبل الانتقال إلى تنقية الحويصلة. لتكوير عينة المستنبتة المركزة ضعها في أنبوب جهاز طرد مركزي نظيف وأضف وسائط نظيفة أو عازلا لضمان ملء الأنبوب. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant باستخدام ماصة.أعد غسل المواد الحبيبية باستخدام وسائط استزراع جديدة أو غسل عازل ، مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X وكرر الطرد المركزي. أعد تعليق الكرية النهائية في الثقافة الطازجة عن طريق السحب اللطيف باستخدام ماصة ملليلتر واحدة ونقلها إلى وعاء نظيف. لإجراء الطرد المركزي الفائق التدرج الكثافة، قم بإعداد مخزون اليوديكسانول كما هو موضح في المخطوطة.امزج جزءا واحدا من المخزن المؤقت 4X مع ثلاثة أجزاء من مخزون اليوديكسانول بنسبة 60٪ لصنع محلول يوديكسانول بنسبة 45٪. تمييع 45٪ يوديكسانول مع المخزن المؤقت 1X لإنشاء مخزونات من الوسائط المتدرجة من تركيزات اليوديكسانول النهائية 40 و 35 و 30 و 25 و 20 و 15 و 10٪. بعد ذلك ، تراكب كميات متساوية بعناية من جميع مخزونات تدرج اليوديكسانول هذه في أنبوب طرد مركزي فائق ، باستخدام حجم الأنبوب بأكمله.بعد الطرد المركزي ، اجمع كسور 0.5 ملليلتر لكل منها لتدرج 4.5 ملليلتر تقريبا عن طريق السحب بعناية أو استخدام جامع الكسور. أوجد كثافة كل كسر، بالجرام لكل ملليلتر، باستخدام ميزان تحليلي وماصة معايرة. قم بإزالة العينة من الأنبوب ، وحدد الوزن وأعد العينة إلى الأنبوب.قم بتخفيف الكسور الفردية باستخدام مخزن مؤقت نظيف في أنبوب جديد متبوعا بوسائط نظيفة أو غسيل عازل. ضع بعناية خمسة ميكرولترات من الحويصلة واتركها لمدة خمس دقائق. قم بإزالة العينة عن طريق لمس حافة الشبكة بقطعة من ورق الترشيح النظيف.ماصة من 20 إلى 50 ميكرولتر من خلات اليورانيل 2٪ على سطح مستو مغطى بفيلم بلاستيكي. ثم ضع الشبكة العائمة فوقها لمدة دقيقتين. أزل أسيتات اليورانيل باستخدام ورق الترشيح وطفو لفترة وجيزة على قطرة من الماء فائق النقاء لغسلها.املأ الغرفة بالماء فائق النقاء باستخدام حقنة نظيفة وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء. انقر فوق كاميرا بدء التشغيل وتصور المنطقة المثلى للغرفة حول بصمة الإبهام. حرك أشرطة تمرير كسب الشاشة ومستوى الكاميرا نحو الحد الأقصى، ثم قم بخفضها إلى أدنى مستوى لرؤية الجسيمات الأكثر تعتيما.اضبط التركيز البؤري حسب الضرورة لضمان أن تكون الجسيمات مرئية بالتساوي تقريبا عبر مجال الرؤية واستمر في الغسيل بالماء النظيف للغاية حتى تصبح الغرفة نظيفة. أضف عينة الحويصلة إلى الغرفة باستخدام حقنة ملليلتر واحدة وتأكد من إعدادات الاكتساب. حدد القياس القياسي' من المربع المنسدل SOP وقم بتغيير الإعدادات لجمع ما لا يقل عن ثلاثة نسخ طبق الأصل تقني من مقاطع الفيديو التي تبلغ مدة كل منها 60 ثانية.اضغط على إنشاء "وتشغيل البرنامج النصي" واتبع المطالبات وادفع ما يقرب من 100 ميكرولتر من العينة إلى الغرفة بين النسخ المتماثلة. حدد معلمات الجسيمات بالنقر فوق "وفتح التجربة" وتحميل ملف العينة. حدد معالجة الملفات المحددة' وانتظر حتى يكتمل التحليل.أظهر عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية من البكتيريا الزرقاء Synechocystis sp. PCC6803 ، أن الغشاء الخارجي يحتوي على الكاروتينات ، والتي تمنح تلوينا برتقاليا مميزا لعينات الحويصلة التي تم جمعها عن طريق التكوير المباشر من خلال الطرد المركزي الفائق. تم فحص حبيبات الحويصلة المعاد تعليقها بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل إما عن طريق تلطيخ العينات سلبا بخلات اليورانيل أو عن طريق مراقبة أقسام رقيقة للغاية.تم تقييم توزيع حجم الحويصلة وتركيزها باستخدام تحليلات تشتت الضوء الديناميكي وتتبع الجسيمات النانوية. تم فصل حويصلات Synechocystis sp. PCC6803 المنقاة على هلام كبريتات الصوديوم دوديسيل بولي أكريلاميد وملطخة بالسكريات الدهنية.يجب أخذ العينات قبل وبعد عينة الحويصلة المركزة للتأكد من أن ترشيح التدفق العرضي يعمل وأن الحويصلات تتركز. ثم تحتاج إلى قياس كلتا العينتين باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية. ويلزم بذل جهود في المستقبل لدمج هذه الطريقة مع نهج أخرى مثل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو تجزئة تدفق المجال غير المتماثل لتحسين التمييز والعزل للجسيمات الصغيرة عن العينات المستزرعة والبيئية.هذه التقنية مفيدة لدراسة حويصلات البكتيريا الزرقاء والأدوار الوظيفية المحددة لهذه الحويصلات في بيولوجيا البكتيريا الزرقاء.

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

جيل المحددة والمسوخ Markerless في أنواع السيانوبكتيريا نموذج

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

تحليل الجريان خارج الخلية عزل وتوصيف وإنتاجية عالية للماوس الأساسي كلوي أنبوبي الخلايا الظهارية

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد كمي وحجم الحويصلات خارج الخلية

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي للحوالق خارج الخلية في ثلاثة أبعاد

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

عزل وتوصيف الفيكوبيليسوم السليم في البكتيريا الزرقاء

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

عزل الحمض النووي الريبي الميكروي عن ثقافات الغدد اللعابية خارج الجسم الحي والحويصلات خارج الخلية

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...