Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
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作者感谢i3S科学平台“生物界面和纳米技术”以及“组织学和电子显微镜”的支持，这是国家基础设施葡萄牙生物成像平台（PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122）的成员。我们还感谢J. A. Gonzalez-Reyes教授（西班牙科尔多瓦大学）帮助优化TEM的超薄切片染色方案，以及Cecília Durães博士和Ana Rita Pinto博士（葡萄牙波尔图大学）的纳米颗粒跟踪分析。
这项工作由美国国家科学基金会（OCE-2049004 to SJB）资助，由欧洲开发区基金会（FEDER）基金通过COMPE COMPETE 2020竞争力和国际化行动计划（POCI），葡萄牙，2020年，以及葡萄牙基金通过Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência，Tecnologia e Ensino Superior在POCI-01-0145-FEDER-029540（PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO）的框架内资助。Fundação para a Ciência e a Tecnologia也因SFRH/BD/130478/2017（SL）和FCT研究者补助金IF/00256/2015（PO）而备受认可。M.C.M.-M.由Horizon 2020框架计划（H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891）内的Marie Skłodowska-Curie个人奖学金（重返社会小组）提供支持。

作者声明没有利益冲突。

A. 一般考虑因素 该协议（图1）以一组选项的形式呈现，以强调没有“一刀切”的方法来处理蓝藻细胞外囊泡。感兴趣的研究人员可以利用该协议中与其特定模式生物，实验问题/目标和设备可用性兼容且合适的部分。所有囊泡分离方法都涉及权衡，并且不可避免地会导致一定程度的偏倚。虽然人们应该尽可能减少这种情况，但最关键的考虑因素是确保根据适当的MISEV（细胞外囊泡研究的最小信息）指南36报告所使用的详细方法。
文化成长 蓝藻培养物可以很容易地从全球众多培养物集合之一获得。一些例子是Roscoff文化收藏（法国Roscoff Biologique de Roscoff站），巴斯德文化收藏（法国巴黎巴斯德研究所）和Provasoli-Guillard国家海洋藻类和微生物群中心（NCMA，缅因州，美国）。选择的蓝藻菌株必须在适当的培养基和环境条件下培养，不同菌株之间差异很大。用于蓝藻培养的常用培养基列表可以在培养物收集网站或其他出版物37，38，39上找到。
与许多典型模型实验室异养生物报告的方法相比，使用蓝藻细胞外囊泡存在一些独特的挑战。蓝藻培养物的囊泡浓度比在其他微生物中发现的囊泡浓度低几个数量级，例如 大肠杆菌14，16，40。这些差异可能是由较低的细胞密度和/或囊泡生产率引起的，这意味着可能需要相对较大的培养物（〜1-20 L或更多）才能产生足够的材料进行批量分析。因此，鼓励研究人员测试小规模培养物的囊泡产量，以确定实现其预期最终目标所需的材料量。在开始任何实验之前，还需要强调确定用于实验的培养基是否具有可检测颗粒背景的重要性，因为该材料可能会混淆囊泡群体定量，降低囊泡浓度/尺寸测量的灵敏度，或污染最终的囊泡制备。
该领域的另一个挑战是，并非所有蓝藻在纯培养物中都能生长良好，或者根本没有生长。在变成轴化之前，对物理囊泡特征，生产率或含量的解释不一定导致关于社区中任何一种菌株产生的囊泡的明确结论。研究人员还被建议考虑通过特定的纳米颗粒分析工具可能存在哪些其他类型的颗粒，并可能与囊泡混淆，这些工具不一定区分不同的颗粒类型。例如， 通过 基因组测序，诱导测定或其他手段验证所使用的菌株缺乏前噬菌体或不会释放其他类型的颗粒物质可能至关重要。根据我们的经验，大多数蓝藻囊泡的直径<0.2μm，但是当观察新的菌株或生长条件时，应该确认使用0.45μm孔径过滤器是否会改变纯化颗粒的尺寸分布。
培养条件的许多方面可以影响囊泡的产生及其内容物41，42。因此，用于培养生长的物理和化学条件（包括光辐照度，温度和培养基组成）需要记录和控制到可能的程度，以确保结果的可重复性。任何囊泡内容物的化学分析都必须考虑背景组成，特别是在进行“组学”式高通量分析时。当使用未定义的培养基时，这可能尤其重要，例如基于天然海水背景或补充酵母提取物或胰蛋白酶的培养基。根据实验目标，使用定义的生长培养基可能是优选的。
研究人员需要定期仔细监测培养物的生长动态，以确保他们知道给定的批次培养在生长阶段的位置，而不仅仅是在任意时间后收集样品。囊泡组成可以跨生长阶段变化，特别是在指数期和固定期41，42之间。例如，在固定期采样的囊泡的至少一部分可能来自不同的细胞机制，例如细胞裂解，这在指数增长期间不会发生。虽然这可能仍然具有很大的生物学意义，但了解样品至关重要。如果蓝藻培养物在无法直接进入样品浓度时达到所需的生长期，则建议立即将细胞从<0.2μm级分中分离出来（离心和/或直接0.2μm过滤），然后将无细胞滤液储存在4°C。该材料可以以这种方式储存数天，对囊泡的浓度或尺寸分布几乎没有明显影响。
囊泡纯化 经常需要从大量培养物中分离囊泡，这在蓝藻囊泡分离工作流程中至关重要。当处理大量材料时，囊泡需要在下游分离工作流程之前浓缩。通常建议使用标称分子量限制为100 kDa的浓缩器（切向流过滤器膜或离心柱），因为它们允许从低分子量的可溶性材料中分离，同时保持浓度时间合理，但30 kDa过滤器也经常成功使用。虽然几种非超速离心的纯化囊泡方法（例如，尺寸排阻色谱，基于微流体的系统，亲和捕获技术和基于沉淀的方法）在细胞外囊泡领域越来越流行，但根据我们的经验，这些方法可能导致产量降低，并且通常与所需的培养体积不相容。
研究人员需要考虑碘克沙醇背景的组成和囊泡纯化过程中使用的洗涤/重悬缓冲液，以确保它们与所需的下游应用相容。在许多情况下，最终的囊泡样品可以重悬于生长培养基或与生长培养基的组成相当的确定缓冲液（例如，天然与人工海水）中。然而，对于海洋蓝藻囊泡来说，这可能是不可能的，这将需要进一步的实验操作来分析，因为类似于海水水平的高盐浓度可以抑制许多酶促反应。在这种情况下，标准的实验室缓冲液，如0.2μm过滤的1x PBS，通常可以很好地维持海洋蓝藻囊泡的稳定性，并且可以与下游实验过程更兼容。
根据实验目标和培养成分，密度梯度纯化可以被认为是可选的，但强烈建议用于生产更严格纯度和可重复的样品。EV群体是异质的，可以在一系列浮力密度中找到，这些密度进一步因菌株，生长条件和其他因素而异4，5，6。上面列出的密度代表了从蓝藻培养物和碘克沙醇中的田间样品中通常发现的囊泡的密度，但其他菌株的结果可能会有所不同。其他密度梯度材料，如蔗糖和CsCl，可用于囊泡，但它们会在这些背景中迁移到不同的浮力密度。不同的梯度介质背景可以偏向脂质封闭病毒43的恢复，并可能潜在地影响不同菌株中囊泡的恢复。
囊泡可以通过囊泡分离和梯度纯化过程在多个点丢失，并且此处描述的梯度纯化过程，降低了产量并增加了下游应用实现给定最终囊泡产量所需的起始材料量。在超速离心后处理囊泡沉淀时应特别小心。虽然一些蓝藻囊泡可以具有类胡萝卜素或其他化合物，这些化合物可能会给囊泡样品提供一定量的色素沉着（图2），但根据菌株或材料量，不一定期望能够直接可视化囊泡颗粒。请注意颗粒的预期位置，该位置应指定所使用的离心机转子的类型。在可能的情况下，建议通过电子显微镜检查纯化的囊泡样品，以验证回收的最终材料的组成。
储存条件对囊泡及其内容物的影响仍然是一个悬而未决的问题。虽然发现储存对蓝藻囊泡大小或浓度14没有显着影响，但分离的囊泡制剂的功能可能随时间而变化44。虽然应尽可能避免冻融循环，但冷冻样品对整体囊泡数量和大小的影响似乎很小。人们应该意识到冻融循环影响囊泡内容物组成的可能性，例如囊泡相关核酸的长度或蛋白质的稳定性。
来自 field samples的囊泡 目前从自然水生环境中分离细胞外囊泡的方法在概念上和操作上与此处描述的大容量培养物的方法相似。尽管如此，它们仍可能需要更多的材料。这种现场样品可能涉及收集，过滤和浓缩数百至数千升的水，以获得足够的材料进行分析。根据所用样品的浊度，可能需要在0.2μm过滤器之前加入一个或多个预过滤步骤。所使用的特定TFF设备应适合在合理的时间内（理想情况下以小时为单位）处理如此大的体积，并且不会对样品施加过大的压力。在实践中，这通常涉及使用比应用于基于培养的样品更大的总表面积，以及更大直径的管道以促进增加流速。与较小的TFF布置和较大的最终浓缩物体积相比，这种增加的过滤器表面积可能会导致颗粒损失略有增加;但是，这些问题必须与总处理时间的考虑相平衡。对于长时间的海洋巡航，样品在采样后多天内不会返回实验室的情况，我们建议在现场执行初始0.2μm过滤和TFF步骤。然后，这种较小体积的浓缩材料可以在4°C或-80°C的船上储存（取决于可用性和下游分析考虑因素），直到将其返回实验室进行最终处理。
从其他小颗粒（有机和无机）中分离和分离细胞外囊泡可能具有挑战性，并且分离不同颗粒的方法尚不完善。例如，碘克沙醇密度梯度可能不容易分离给定样品中存在的所有类别的囊泡和病毒。由于混杂颗粒的类型及其物理性质在采样点之间会有所不同，因此目前不可能提供一种协议来可靠地划分所有类别的小水生颗粒。试验和错误是必要的，并且需要在梯度和超速离心条件下使用碘克沙醇范围的实验以最大化分离;可能还需要收集体积更小、分辨率更精细的密度分数。根据上下文，使用CsCl梯度代替碘克沙醇可能有助于分离环境颗粒45。尽管如此，如上所述，渗透条件的变化可能导致最终回收产物的偏差。
囊泡表征 纳米颗粒分析仪器尚未在微生物实验室环境中常规提供，但越来越容易获得。所有方法都有优点和缺点，我们没有具体认可一个平台比所有其他平台更好的蓝藻囊泡工作;事实上，它们在成本、分辨率、易用性、检测限、与不同生长培养基/缓冲液背景的兼容性以及数据可重复性方面都有特定的权衡。除了基于上述纳米颗粒跟踪分析的仪器外，还可以应用46，47的其他方法，包括纳米流式细胞术，微流体电阻脉冲传感和可调谐电阻脉冲传感。用户应仔细了解其可用仪器的详细信息，并验证它是否与他们的系统配合使用，因为我们在将某些平台与海水基介质一起使用时遇到了困难。我们鼓励该领域转向囊泡大小，浓度和生产率的定量表征。在每毫升基本颗粒的基础上测量囊泡浓度，而不是根据蛋白质含量或其他指标，将允许囊泡整合到更定量的框架中，并实现菌株和条件之间的相互比较。需要进一步努力提高校准<100nm颗粒浓度测量的能力。
囊泡产率测量直接从0.2μm过滤培养物上清液中完成以最小化颗粒损失的事实将与上述其他纯化步骤相关联。然而，这确实意味着该方法不一定区分实际的细胞外囊泡和培养物中发现的其他小颗粒。仅对特定尺寸范围（例如，直径50-250nm）内的颗粒进行计数可能有助于排除某些异常值，但是需要视觉确认颗粒<0.2μm培养物内容物似乎是膜结合的囊泡（通过TEM或其他方法）才能明确声称正在测量囊泡的产生，而不是囊泡样颗粒的产生。
囊泡表征的一个重要因素是确保在纳米颗粒分析设备的适当线性灵敏度范围内分析囊泡样品。当样品浓度过高时，用干净的缓冲液稀释该材料并重新分析是很简单的。另一方面，一些蓝藻培养物相对较低的细胞和/或囊泡密度有时会产生低于某些仪器检测限的囊泡制剂。在散装囊泡纯化中发生这种情况的情况下，可以考虑培养更大体积的培养物，以较小的体积重新造粒和重悬最终材料，或者评估分离过程中是否存在发生过多损失的步骤并且可以减轻。在测量囊泡产率时，修复不一定那么简单。如有必要，可以对样品进行浓缩，但第一个应该查看对培养基的调整是否会导致更高的细胞密度，或者是否可以从指数阶段的较晚时间点获得足够浓缩的样品，其中浓度会更高。
局限性 与任何方案一样，使用这些方法的囊泡分离具有明显的局限性。这些方法并不依赖于它们保证完全纯净的囊泡制备将被分离。培养物和现场样品都可能含有其他材料，其迁移类似于密度梯度的囊泡。尽管如此，至少，这些类型的附加纯化方法对于确保囊泡分析的严谨性和可重复性至关重要。虽然我们在蓝藻的背景下描述了囊泡分离方法，但许多其他微生物的培养物也将含有相对较低浓度的囊泡，这里描述的程序应该普遍适用。预计这些方法将不作为永久性方案，而是作为刺激未来使用来自不同微生物的细胞外囊泡的起点。今后需要努力将这些方法与其他方法（如尺寸排阻柱或不对称场流分馏）合并，以改善从培养物和环境样品中区分和分离不同类别的小颗粒。我们也希望这些技术能够随着纳米颗粒表征技术的改进而继续发展，以提高检查囊泡群体内异质性的能力，其内容物以及它们在环境中的确切功能角色。

细胞外囊泡（EV）是球形结构，直径在〜20-400nm之间，由几乎所有生物体释放到其周围环境1，2，3中。囊泡由脂质双层限定，不能自我复制。在革兰氏阴性细菌中，这些结构被认为主要是通过外膜的一小部分“漂白”产生的。尽管如此，其他过程，包括鞭毛运动，细胞裂解以及内膜和外膜材料的分泌，也可以产生囊泡以及4，5。EV可以含有各种生物分子，包括脂质，可溶性和膜蛋白，核酸和代谢物，并且可以在细胞4，5，6之间运输这种物质。鉴于这些特征，正在研究EV以了解它们在各种生物过程中的可能作用，包括细胞通讯，生物膜形成，水平基因转移，宿主 - 噬菌体动力学和营养交换4，6。
蓝藻是一大群多样化的革兰氏阴性菌，包括单细胞和丝状生物。从许多角度来看，它们都值得关注，包括了解它们的生理和多样性7，8，它们所服务的关键生态系统功能9，10，以及它们对生物技术的效用11，12。蓝藻存在于各种各样的栖息地中，要么是海洋，淡水和陆地环境中的自由生物，要么是与苔藓，蕨类植物，植物的共生关联，要么是地衣和海绵中的共生生物13。它们是水生生态系统中至关重要的主要生产者，通过含氧光合作用产生氧气和有机碳9，10，有些还能够固定大气中的氮7。海洋和淡水蓝藻，包括 原绿球菌， Synechococcus 和 Synechocystis， 在实验室条件下产生EV14，15，16，并且在自然环境中也可以找到蓝藻囊泡14，17。蓝藻囊泡的生物学和生态学功能尚不清楚，但该领域的进一步研究可能会为蓝藻生理学，分化，传播策略，进化和营养相互作用等问题提供新的见解。此外，蓝藻EV携带不同类别生物分子的能力可能具有商业应用18，19。
本方案描述了从蓝藻培养物和现场样品中分离和表征囊泡的方法，以便能够并鼓励对蓝藻细胞外囊泡生物学进行更广泛的检查。虽然这里描述的工作流程类似于从其他细菌中分离和表征EV的方案，但蓝藻培养物和现场样品通常含有比宿主相关或致病模型系统通常观察到的更低的细胞和囊泡浓度20，21，22。因此，对蓝藻EV的研究需要对培养和囊泡分离进行特殊考虑和优化，这在菌株和培养基背景之间进一步变化。由于没有一种方案适用于所有菌株，生长条件和下游应用，因此我们提供多种选择并讨论所涉及的权衡，以便研究人员可以确定最适合解决其实验问题的方法。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

蓝藻是一组多样化的光合革兰氏阴性细菌，在全球生态系统中发挥着关键作用，并作为重要的生物技术模型。最近的研究表明，海洋和淡水蓝藻都产生细胞外囊泡 - 从微生物外表面释放的小膜结合结构。虽然囊泡可能有助于多样化的生物过程，但它们在蓝藻生物学中的特定功能作用在很大程度上仍然是未知的。为了鼓励和推进该领域的研究，提出了用于分离，浓缩和纯化蓝藻细胞外囊泡的详细方案。目前的工作讨论了从 原绿球菌，Synechococcus和 Synechocystis的大培养物中成功分离出囊泡的方法。介绍了用于定量和表征这些菌株的囊泡样品的方法。还介绍了从水生田间样品中分离囊泡的方法。最后，还讨论了蓝藻囊泡纯化遇到的典型挑战，不同下游应用的方法学考虑因素以及方法之间的权衡。

图1概述了蓝藻囊泡分离过程，突出显示了此处描述的方案的关键方面。特别值得注意的是详细描述从小颗粒（囊泡）部分分离蓝藻生物质，浓缩囊泡样品以及囊泡分离和纯化的步骤（图1，步骤2至4），这对于获得可重复的囊泡制剂至关重要。图2显示了从蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803中分离和表征细胞外囊泡的代表性结果。这种蓝藻的外膜已被证明含有类胡萝卜素31，其赋予通过超速离心直接造粒收集的囊泡样品的特征橙色（图2A）。一旦囊泡沉淀被重悬，可以通过透射电子显微镜（TEM）检查囊泡，方法是用乙酸铀酰对样品进行负染色（图2B）或通过观察超薄切片（图2C）。可以使用动态光散射（DLS）（图2D）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）评估囊泡尺寸分布和浓度（图2E）。使用所描述的方案，通常在1.0的OD 730的指数生长的Synechocystis sp. PCC6803中获得〜3.5±1.0 x 10 8纳米颗粒/ mL。可以对分离的EV进行生化分析，以补充分离的囊泡的物理表征。例如，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离纯化的Synechocystis sp. PCC 6803囊泡并染色为脂多糖（LPS;图 2F）。由于LPS是外膜32特异性的，LPS检测可以验证膜结合囊泡的存在，并用作分析来自同一菌株33的制剂之间相对囊泡含量的标志物。检查低分子量与高分子量LPS的相对丰度可以表明样品34，35之间囊泡组成的变化。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> 图1：用于蓝藻EV分离和表征的实验程序。 生长培养物（1）和从生长培养基中分离蓝藻生物量（2）的示意图。浓缩含有囊泡的无细胞样品（3），然后分离并纯化EV（4）。根据应用的不同，可以使用透射电子显微镜（TEM），纳米颗粒跟踪分析（NTA），动态光散射（DLS）和脂多糖（LPS）分析（5）的一种或多种组合来表征囊泡制剂。室温，室温。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> 图2：蓝藻集胞藻属PCC 6803的细胞外囊泡分离和表征的代表性结果 。 （A）从600 mL Synechocystis sp. PCC 6803培养物中超速离心浓缩的无细胞细胞外培养基至1.0-1.5的OD730后获得的细胞外囊泡沉淀（EVs沉淀）的照片。注意来自外膜中发现的类胡萝卜素的囊泡颗粒的典型橙色。（乙、丙）集胞藻属PCC 6803囊泡样品的负染色（B）和超薄切片（C）的透射电子显微镜（TEM）照片。比例尺：分别为 200 nm 和 50 nm。在80 kV下操作的透射电子显微镜上观察样品。（D）典型的动态光散射（DLS）图，描绘了囊泡体积的分布作为囊泡直径（以nm为单位）的函数。彩色线条表示来自同一样品的三次技术重复测量的数据。（E）细胞外囊泡尺寸分布的代表性纳米颗粒跟踪分析（NTA）数据（nm）。黑线表示三个技术重复的平均值，红线表示平均值的标准误差。（F）脂多糖（LPS）谱是在16%（w / v）SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离囊泡制剂并用商业LPS染色试剂盒染色后检测到的。低分子量和高分子量LPS，分别对应于粗糙和光滑LPS形式，是可检测的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
补充文件1：计算r的方程。在指数增长期间（通常是时间过程的开始和结束）期间，每个细胞每一代在两点之间产生的囊泡数量是使用此方程确定的。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

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Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

本方案为从蓝藻培养物中分离、浓缩和表征细胞外囊泡提供了详细的描述。还讨论了从不同尺度的培养物中纯化囊泡的方法，方法之间的权衡以及使用现场样品的注意事项。

蓝藻细胞外囊泡的分离和表征

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

该协议具有重要意义，因为它不仅展示了从不同规模的培养物中纯化囊泡的方法，权衡，方法之间的差异以及处理现场样品的考虑因素。蓝藻存在独特的囊泡采样和分析挑战。这些技术已经成功地从培养物和环境样品中分离和浓缩了囊泡。要浓缩少于500毫升的样品，请首先用1型超纯水冲洗15至20毫升超滤离心浓缩器。将浓缩器装入离心机中，并在4摄氏度下以4， 400 x g 的速度旋转。放弃运行并重复该步骤至少两次。将上清液样品装入水冲洗的浓缩器中，并在相同条件下旋转。重复此步骤，直到样品浓缩至15至30毫升的最终体积。要浓缩超过500毫升的体积，请通过设置手稿中描述的设备来执行切向流过滤。将蠕动泵连接到进气管路，并在截留管路上放置可调节的夹具。按照手稿中所述对切向流过滤进行消毒，然后用一升1型超纯级水冲洗设备。将小于0.2微米的滤液加入样品储液槽中。缓慢提高截留管路上的泵速和背压水平，以增加滤液管路的产量。继续运行切向流过滤，并在除去材料时用培养上清液重新填充储液槽。一旦储液槽中的体积达到保持流入进气管路所需的尽可能低的量，就停止浓缩样品，而不会引入气泡。用夹具关闭流出线。消除截留管路上的背压。通过过滤器再循环浓缩的上清液10分钟，将再循环速率从每分钟20毫升降低到40毫升，以最大限度地提高回收率。将截留管路移动到干净的容器中，从样品中取出进气管路并收集浓缩的材料。使用移液器回收样品储液槽中的任何剩余材料。通过0.2微米注射器过滤器过滤浓缩的上清液。如果需要，将最终浓缩物在四摄氏度下储存约三周，然后再进行囊泡纯化。要沉淀浓缩的培养样品，请将其置于干净的超速离心管中，并加入干净的培养基或缓冲液以确保管被填充。离心后，用移液管除去上清液。用新鲜培养基或洗涤缓冲液（例如1X磷酸盐缓冲盐水）重新洗涤沉淀的材料，并重复离心。用一毫升移液器轻柔移液，将最终沉淀重悬于新鲜培养物中，并将其转移到干净的容器中。为了进行密度梯度超速离心，如手稿中所述制备碘克沙醇储液。将4X缓冲液的一部分与三份60%碘克沙醇储备液混合，制成45%碘克沙醇溶液。用1X缓冲液稀释45%碘克沙醇，以产生最终碘克沙醇浓度为40，35，30，25，20，15和10%的梯度介质的储备。然后，小心地将等量的所有这些碘克沙醇梯度储液覆盖到超速离心管中，利用整个管体积。离心后，通过仔细移液或使用馏分收集器，收集0.5毫升的馏分，以获得约4.5毫升梯度。使用分析天平和校准的移液器确定每种馏分的密度，以克/毫升为单位。从试管中取出样品，确定重量并将样品放回试管中。在新管中用干净的缓冲液稀释单个馏分，然后用干净的培养基或缓冲液洗涤。小心地涂抹五微升的囊泡，让它静置五分钟。通过将网格的边缘触摸到一块干净的滤纸上来取出样品。将20至50微升的2%醋酸铀酰移出到由塑料薄膜覆盖的平坦表面上。然后将网格漂浮在其顶部两分钟。使用滤纸去除醋酸铀酰，并短暂漂浮在一滴超纯水上进行洗涤。使用干净的注射器用超纯水填充腔室，并确保没有气泡。单击启动相机'，并可视化指纹周围腔室的最佳区域。将屏幕增益和相机级别滑块滑向最大值，然后降低到最低级别以查看最暗的粒子。根据需要调整焦点，以确保颗粒在整个视野中大致相等，并继续用超干净的水洗涤，直到腔室清洁。使用一毫升注射器将囊泡样品添加到腔室中，并确认采集设置。从SOP下拉框中选择标准测量，并更改设置以收集至少三个技术重复，每个复制60秒的视频。按“创建并运行脚本”并按照提示将大约100微升样品推入重复之间的腔室中。通过单击分析并确定颗粒参数，然后打开实验并加载样品文件。选择处理所选文件并等待分析完成。从蓝藻Synechostis sp. PCC6803中分离和表征细胞外囊泡表明，外膜含有类胡萝卜素，其赋予通过超速离心直接造粒收集的囊泡样品特征性橙色着色。通过透射电子显微镜检查重悬的囊泡沉淀，方法是用乙酸铀酰对样品进行负染色或观察超薄切片。使用动态光散射和纳米颗粒跟踪分析评估囊泡尺寸分布和浓度。在十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶上分离纯化的Synecycystis sp. PCC6803囊泡并染色为脂多糖。应在浓缩囊泡样品之前和之后取样，以确保切向流过滤工作并且囊泡被浓缩。然后，您需要使用纳米颗粒跟踪分析来测量两个样品。今后需要努力将这种方法与其他方法（如尺寸排阻色谱或不对称场流分馏）合并，以改善从培养物和环境样品中区分和分离小颗粒的方法。该技术有助于研究蓝藻囊泡以及这些囊泡在蓝藻生物学中的特定功能作用。

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

对于外小泡的使用流式细胞仪分析技术

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

科研

生物学

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

在型号蓝藻种类标记和无标记突变体的产生

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

小鼠原发性肾管上皮细胞的分离、鉴定及高通量的细胞外流量分析

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

细胞调理介质细胞外囊泡的流式细胞学分析

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

卡诺尔哈布炎细胞外囊泡的纯化与分析

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

细胞外囊泡的量化和尺寸测定纳米粒子跟踪分析

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

三维细胞外囊泡的直接随机光学重建显微镜

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

蓝藻中完整藻胆体的分离与表征

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...