Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

De auteurs erkennen de steun van de i3S Scientific Platforms "Biointerfaces and Nanotechnology", en "Histology and Electron Microscopy", een lid van het nationale infrastructuur Portugese Platform voor Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). We bedanken ook Prof. J. A. Gonzalez-Reyes (Universiteit van Córdoba, Spanje) voor het helpen optimaliseren van het ultradunne sectiekleuringsprotocol voor TEM, en Dr. Cecília Durães en Dr. Ana Rita Pinto (Universiteit van Porto, Portugal) voor de analyse van het volgen van nanodeeltjes.
Dit werk werd gefinancierd door de Amerikaanse National Science Foundation (OCE-2049004 aan SJB), door Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) fondsen via het COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal, 2020, en door Portugese fondsen via Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior in het kader van het project POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 aan PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia wordt ook zeer erkend voor de PhD fellowship SFRH / BD / 130478/2017 (SL) en FCT Investigator grant IF / 00256/ 2015 (PO). M.C.M.-M. werd ondersteund door een Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (re-integratiepanel) binnen het Horizon 2020-kaderprogramma (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn bolvormige structuren, variërend tussen ~ 20-400 nm in diameter, vrijgegeven door vrijwel alle organismen in hun omgeving 1,2,3. Blaasjes worden begrensd door een lipide dubbellaag en kunnen zichzelf niet repliceren. Bij Gram-negatieve bacteriën wordt gedacht dat deze structuren voornamelijk ontstaan door het 'blebben' van kleine porties uit het buitenmembraan. Toch kunnen andere processen, waaronder flagellaire beweging, cellyse en afscheiding van zowel binnen- als buitenmembraanmateriaal, ook blaasjes produceren 4,5. EV's kunnen verschillende biomoleculen bevatten, waaronder lipiden, oplosbare en membraaneiwitten, nucleïnezuren en metabolieten, en kunnen dit materiaal tussen cellen transporteren 4,5,6. Gezien deze kenmerken worden EV's bestudeerd om hun mogelijke rol in een breed scala aan biologische processen te begrijpen, waaronder cellulaire communicatie, biofilmvorming, horizontale genoverdracht, gastheer-faagdynamiek en uitwisseling van voedingsstoffen 4,6.
Cyanobacteriën zijn een grote en diverse groep Gram-negatieve bacteriën, waaronder eencellige en filamenteuze organismen. Ze zijn van belang vanuit vele perspectieven, waaronder het begrijpen van hun fysiologie en diversiteit 7,8, de kritieke ecosysteemfuncties die ze dienen 9,10 en hun nut voor biotechnologie11,12. Cyanobacteriën worden aangetroffen in een breed scala aan habitats, hetzij als vrijlevende organismen in mariene, zoetwater- en terrestrische omgevingen, of in symbiotische associaties met mossen, varens, planten of in korstmossen en sponzen13. Ze dienen als cruciale primaire producenten in aquatische ecosystemen, produceren zuurstof en organische koolstof door middel van zuurstofrijke fotosynthese 9,10, en sommige zijn ook in staat om atmosferische stikstof te fixeren7. Mariene en zoetwatercyanobacteriën, waaronder Prochlorococcus, Synechococcus en Synechocystis, produceren EV's onder laboratoriumomstandigheden 14,15,16, en cyanobacteriële blaasjes zijn ook te vinden in natuurlijke omgevingen 14,17. De biologische en ecologische functies van cyanobacteriële blaasjes zijn onbekend, maar verder onderzoek op dit gebied zal waarschijnlijk nieuwe inzichten opleveren in vragen over cyanobacteriële fysiologie, differentiatie, communicatiestrategieën, evolutie en trofische interacties. Bovendien kan het vermogen van cyanobacteriële EV's om verschillende categorieën biomoleculen te dragen commerciële toepassingen hebben18,19.
Het huidige protocol beschrijft methoden voor het isoleren en karakteriseren van blaasjes uit cyanobacteriële culturen en veldmonsters om een breder onderzoek van cyanobacteriële extracellulaire blaasjesbiologie mogelijk te maken en aan te moedigen. Hoewel de hier beschreven workflow analoog is aan protocollen voor het isoleren en karakteriseren van EV's van andere bacteriën, bevatten cyanobacteriële culturen en veldmonsters doorgaans lagere cel- en blaasconcentraties dan gewoonlijk wordt waargenomen bij gastheer-geassocieerde of pathogene modelsystemen 20,21,22. Studies van cyanobacteriële EV's vereisen dus speciale overwegingen en optimalisaties voor teelt en blaasjesisolatie, die verder variëren tussen stammen en media-achtergronden. Omdat geen enkel protocol even goed zal werken voor alle stammen, groeiomstandigheden en downstream-toepassingen, bieden we meerdere opties en bespreken we de afwegingen, zodat onderzoekers de benaderingen kunnen bepalen die het meest geschikt zijn voor het aanpakken van hun experimentele vragen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

Cyanobacteriën zijn een diverse groep fotosynthetische, Gram-negatieve bacteriën die een cruciale rol spelen in wereldwijde ecosystemen en dienen als essentiële biotechnologische modellen. Recent werk heeft aangetoond dat zowel mariene als zoetwatercyanobacteriën extracellulaire blaasjes produceren - kleine membraangebonden structuren die vrijkomen uit het buitenoppervlak van de microben. Hoewel blaasjes waarschijnlijk bijdragen aan diverse biologische processen, blijven hun specifieke functionele rollen in de cyanobacteriële biologie grotendeels onbekend. Om onderzoek op dit gebied aan te moedigen en te bevorderen, wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het isoleren, concentreren en zuiveren van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes. Het huidige werk bespreekt methodologieën die met succes blaasjes hebben geïsoleerd uit grote culturen van Prochlorococcus, Synechococcus en Synechocystis. Methoden voor het kwantificeren en karakteriseren van blaasjesmonsters van deze stammen worden gepresenteerd. Benaderingen voor het isoleren van blaasjes van aquatische veldmonsters worden ook beschreven. Ten slotte worden ook typische uitdagingen bij de zuivering van cyanobacteriële blaasjes, methodologische overwegingen voor verschillende downstream-toepassingen en de afwegingen tussen benaderingen besproken.

Figuur 1 geeft een overzicht van het cyanobacteriële blaasjesisolatieproces, waarbij de belangrijkste aspecten van het hier beschreven protocol worden benadrukt. Van bijzonder belang zijn de stappen die de scheiding van cyanobacteriële biomassa van de fractie van kleine deeltjes (blaasjes), het concentreren van het blaasjemonster en de isolatie en zuivering van de blaasjes beschrijven (figuur 1, stappen 2 tot en met 4), die van cruciaal belang zijn voor het verkrijgen van reproduceerbare preparaten van blaasjes. Figuur 2 toont representatieve resultaten van de isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes van de cyanobacterie Synechocystis sp. PCC 6803. Van het buitenmembraan van deze cyanobacterie is aangetoond dat het carotenoïden31 bevat, die een karakteristieke oranje kleuring verlenen aan blaasjesmonsters die zijn verzameld door directe pelleting door ultracentrifugatie (figuur 2A). Zodra de blaaspellet opnieuw is gesuspendeerd, kunnen blaasjes worden onderzocht door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), hetzij door monsters negatief te kleuren met uranylacetaat (figuur 2B) of door observatie van ultradunne secties (figuur 2C). De grootteverdeling en -concentratie van blaasjes kunnen worden beoordeeld met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS) (figuur 2D) en nanodeeltjesvolganalyses (NTA) (figuur 2E). Met het beschreven protocol werden typisch ~3,5 ± 1,0 x 108 nanodeeltjes per ml verkregen in een exponentieel groeiende cultuur van Synechocystis sp. PCC 6803 bij een OD730 van 1,0. Biochemische analyses van geïsoleerde EV's kunnen worden uitgevoerd om de fysieke karakterisering van de geïsoleerde blaasjes aan te vullen. Als voorbeeld werden gezuiverde Synechocystis sp. PCC 6803 blaasjes gescheiden op een SDS-polyacrylamide gel en gekleurd voor lipopolysacchariden (LPS; Figuur 2F). Aangezien LPS specifiek zijn voor het buitenmembraan32, kan LPS-detectie de aanwezigheid van membraangebonden blaasjes valideren en dienen als een marker voor het analyseren van het relatieve blaasjegehalte tussen preparaten van dezelfde stam33. Inspectie van de relatieve abundantie van LPS met een laag versus hoog molecuulgewicht kan wijzen op veranderingen in de samenstelling van de blaasjes tussen monsters34,35.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> Figuur 1: Experimentele procedures die worden gebruikt voor cyanobacteriële EV-isolatie en -karakterisering. Schematische representaties van groeiculturen (1) en scheiding van cyanobacteriële biomassa uit het groeimedium (2). Celvrije monsters met blaasjes worden geconcentreerd (3) en vervolgens worden de EV's geïsoleerd en gezuiverd (4). Afhankelijk van de toepassing kunnen blaasjespreparaten worden gekarakteriseerd met behulp van een of een combinatie van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), nanodeeltjesvolganalyse (NTA), dynamische lichtverstrooiing (DLS) en lipopolysaccharide (LPS) profilering (5). RT, kamertemperatuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> Figuur 2: Representatieve resultaten van de extracellulaire vesikelisolatie en karakterisering voor de cyanobacterie Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Foto van de extracellulaire blaaskelkorrel (EV-pellet) verkregen na ultracentrifugatie van het geconcentreerde celvrije extracellulaire medium uit een Synechocystis sp. PCC 6803-cultuur van 600 ml, gekweekt tot een OD730 van 1,0-1,5. Let op de typische oranje kleuring van de blaasjeskorrel afgeleid van de carotenoïden in het buitenmembraan. (B,C) Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) foto's van negatief gekleurde (B) en ultradunne secties (C) van Synechocystis sp. PCC 6803 blaasjesmonsters. Schaalbalken: respectievelijk 200 nm en 50 nm. Monsters werden gevisualiseerd op een transmissie-elektronenmicroscoop die werkte op 80 kV. (D) Typische dynamische lichtverstrooiing (DLS) plot die de verdeling van het blaasjevolume weergeeft als functie van de blaasdiameter (in nm). Gekleurde lijnen geven gegevens aan van drie technische replicaatmetingen van hetzelfde monster. (E) Representatieve nanodeeltjes tracking analyse (NTA) gegevens van Synechocystis extracellulaire vesikel grootteverdeling (in nm). De zwarte lijn geeft het gemiddelde van drie technische replicaties aan en de rode lijnen vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. (F) Lipopolysacchariden (LPS) profiel werd gedetecteerd na het scheiden van het blaasjepreparaat door elektroforese op een 16% (w / v) SDS-polyacrylamide-gel en kleuring met een commerciële LPS-kleuringskit. LPS met een laag en hoog molecuulgewicht, overeenkomend met respectievelijk ruwe en gladde LPS-vormen, zijn detecteerbaar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullend dossier 1: Vergelijking om r te berekenen. Het aantal blaasjes dat per cel per generatie tussen twee punten wordt geproduceerd tijdens exponentiële groei (meestal het begin en einde van het tijdsverloop) wordt bepaald met behulp van deze vergelijking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Het huidige protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor isolatie, concentratie en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit cyanobacteriële culturen. Benaderingen voor het zuiveren van blaasjes uit culturen op verschillende schalen, afwegingen tussen methodologieën en overwegingen voor het werken met veldmonsters worden ook besproken.

Isolatie en karakterisering van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Dit protocol is belangrijk omdat het niet alleen benaderingen demonstreert voor het zuiveren van blaasjes uit cultuur op verschillende schalen, afwegingen, verschillen tussen methodologieën en ook aandacht voor het werken met veldmonsters. Cyanobacteriën bieden unieke uitdagingen voor het bemonsteren en analyseren van blaasjes. Deze technieken hebben met succes blaasjes geïsoleerd en geconcentreerd uit cultuur en uit omgevingsmonsters.Om monsters van minder dan 500 milliliter te concentreren, begint u met het spoelen van de 15 tot 20 milliliter ultrafiltratie centrifugaalconcentrators met type 1 ultrapure grade water. Laad de concentrators in de centrifuge en draai bij 4.400 x g bij vier graden Celsius. Gooi de doorloop weg en herhaal de stap minstens twee keer.Laad het bovennatuurlijke monster in een in water gespoelde concentrator en draai onder dezelfde omstandigheden. Herhaal deze stap totdat het monster is geconcentreerd tot een eindvolume van 15 tot 30 milliliter. Om een volume van meer dan 500 milliliter te concentreren, voert u tangentiële stromingsfiltratie uit door het apparaat in te stellen zoals beschreven in het manuscript.Bevestig een peristaltische pomp aan de inlaatleiding en plaats verstelbare klemmen op de retentaatlijn. Ontsmet de tangentiële stromingsfiltratie zoals beschreven in het manuscript en spoel het apparaat vervolgens door met een liter type 1 ultrapuur water. Voeg minder dan 0,2 micron filtraat toe aan het monsterreservoir.Verhoog langzaam de pompsnelheid en tegendrukniveaus op de retentaatleiding om de output van de filtraatleidingen te verhogen. Blijf de tangentiële stromingsfiltratie uitvoeren en vul het reservoir opnieuw met cultuursupernatant terwijl het materiaal wordt verwijderd. Stop met het concentreren van het monster zodra het volume in het reservoir de laagst mogelijke hoeveelheid bereikt die nodig is om de stroom in de inlaatleiding te behouden zonder luchtbellen in te brengen.Sluit de uitstroomlijn met een klem. Verwijder de tegendruk op de retentate lijn. Recirculeer het geconcentreerde supernatant gedurende 10 minuten door het filter, waardoor de recirculatiesnelheid wordt verlaagd van 20 tot 40 milliliter per minuut om het herstel te maximaliseren.Verplaats de retentaatlijn in een schoon vat, verwijder de inlaatleiding uit het monster en verzamel het geconcentreerde materiaal. Win eventueel achtergebleven materiaal in het monsterreservoir terug met behulp van een pipet. Filtreer het geconcentreerde supernatant door een spuitfilter van 0,2 micron.Bewaar indien nodig het laatste concentraat ongeveer drie weken bij vier graden Celsius voordat u overgaat op blaasjeszuivering. Om het geconcentreerde kweekmonster te pelleteren, plaatst u het in een schone ultracentrifugebuis en voegt u schone media of buffer toe om ervoor te zorgen dat de buis wordt gevuld. Verwijder na het centrifugeren het supernatant met een pipet.Was het gepelletiseerde materiaal opnieuw met verse kweekmedia of wasbuffer, zoals 1X fosfaat-gebufferde zoutoplossing en herhaal de centrifugatie. Resuspenseer de uiteindelijke pellet in verse cultuur door voorzichtig te pipetteren met een pipet van één milliliter en breng deze over in een schoon vat. Om dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie uit te voeren, bereidt u iodixanol-aandelen zoals beschreven in het manuscript.Meng een deel van de 4X-buffer met drie delen van 60% iodixanol-bouillon om een 45% iodixanol-oplossing te maken. Verdun 45% iodixanol met 1X buffer om voorraden gradiëntmedia van 40, 35, 30, 25, 20, 15 en 10% uiteindelijke iodixanolconcentraties te creëren. Leg vervolgens zorgvuldig gelijke hoeveelheden van al deze iodixanol-gradiëntvoorraden in een ultracentrifugebuis, waarbij het volledige buisvolume wordt gebruikt.Verzamel na het centrifugeren de fracties van elk 0,5 milliliter voor een gradiënt van ongeveer 4,5 milliliter door zorgvuldig te pipetteren of een fractiecollector te gebruiken. Bepaal de dichtheid van elke fractie, in gram per milliliter, met behulp van een analytische balans en gekalibreerde pipet. Verwijder het monster uit de buis, bepaal het gewicht en breng het monster terug naar de buis.Verdun afzonderlijke fracties met een schone buffer in een nieuwe buis, gevolgd door een schone media- of bufferwas. Breng voorzichtig vijf microliter blaasjes aan en laat het vijf minuten zitten. Verwijder het monster door de rand van een raster aan te raken op een stuk schoon filtreerpapier.Pipetteer 20 tot 50 microliter 2% uranylacetaat op een plat oppervlak bedekt met plastic film. Plaats vervolgens het rooster er twee minuten op drijvend. Verwijder uranylacetaat met filterpapier en drijf kort op een druppel ultrapuur water om te wassen.Vul de kamer met ultrapuur water met een schone spuit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Klik op start camera'en visualiseer het optimale gebied van de kamer rond de vingerafdruk. Schuif de schuifregelaars van de schermversterking en het cameraniveau naar het maximum en verlaag vervolgens naar het laagste niveau om de zwakste deeltjes te zien.Pas de focus indien nodig aan om ervoor te zorgen dat deeltjes ongeveer even zichtbaar zijn over het gezichtsveld en blijf wassen met ultraschoon water totdat de kamer schoon is. Voeg het blaasjemonster toe aan de kamer met een spuit van één milliliter en bevestig de acquisitie-instellingen. Selecteer standaardmeting'in de Vervolgkeuzelijst SOP en wijzig de instellingen om ten minste drie technische replica's van elk 60 seconden video's te verzamelen.Druk op create 'and run script' en volg de aanwijzingen en duw ongeveer 100 microliter monster in de kamer tussen de replicaties. Bepaal de deeltjesparameters door op analyse 'en open experiment' te klikken en het monsterbestand te laden. Selecteer geselecteerde bestanden verwerken' en wacht tot de analyse is voltooid.De isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes van de cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803, toonde aan dat het buitenmembraan carotinoïden bevat, die een karakteristieke oranje kleuring verlenen aan blaasjesmonsters verzameld door directe pelleting door ultracentrifugatie. De geresuspendeerde blaasjeskorrel werd onderzocht door transmissie-elektronenmicroscopie door monsters negatief te kleuren met uranylacetaat of door ultradunne secties te observeren.De grootteverdeling en -concentratie van vesikels werden beoordeeld met behulp van dynamische lichtverstrooiing en nanodeeltjesvolganalyses. Gezuiverde Synechocystis sp. PCC6803 blaasjes werden gescheiden op een natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel en gekleurd voor lipopolysacchariden.Monsters moeten voor en na het geconcentreerde blaasjesmonster worden genomen om ervoor te zorgen dat de tangentiële stroomfiltratie werkt en de blaasjes geconcentreerd raken. Vervolgens moet u beide monsters meten met behulp van de nanodeeltjesvolganalyse. Toekomstige inspanningen zijn nodig om deze methode samen te voegen met andere benaderingen zoals de grootte-uitsluitingschromatografie of asymmetrische veldstroomfractionering om de discriminatie en isolatie van kleine deeltjes uit cultuur- en milieumonsters te verbeteren.Deze techniek is nuttig om de cyanobacteriën blaasjes en de specifieke functionele rollen van deze blaasjes in cyanobacteriële biologie te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Generatie van Marked en markerless Mutanten in Model cyanobacteriën Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolatie, karakterisering en High Throughput extracellulaire Flux-analyse van muis primaire renale tubulaire epitheliale cellen

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Cytometrische analyse van extracellulaire blaasjes van cel-geconditioneerd Media stromen

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanodeeltjes tracking analyse voor de kwantificering en groottebepaling van extracellulaire blaasjes

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie van extracellulaire blaasjes in drie dimensies

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Isolatie en karakterisering van intact fycobilisoom in cyanobacteriën

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolatie van microRNA's van Tick Ex Vivo Speekselklierculturen en Extracellulaire Blaasjes

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...