Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Les auteurs reconnaissent le soutien des plateformes scientifiques i3S « Biointerfaces et nanotechnologie », et « Histologie et microscopie électronique », membre de l’infrastructure nationale portugaise Plate-forme de bioimagerie (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Nous remercions également le professeur J. A. Gonzalez-Reyes (Université de Córdoba, Espagne) d’avoir aidé à optimiser le protocole de coloration de section ultra-mince pour la TEM, ainsi que le Dr Cecília Durães et le Dr Ana Rita Pinto (Université de Porto, Portugal) pour l’analyse de suivi des nanoparticules.
Ce travail a été financé par la National Science Foundation des États-Unis (OCE-2049004 à SJB), par les fonds Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) par le biais du programme opérationnel COMPETE 2020 pour la compétitivité et l’internationalisation (POCI), Portugal, 2020, et par des fonds portugais par le biais de fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior dans le cadre du projet POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 à PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia est également très reconnu pour la bourse de doctorat SFRH / BD / 130478/2017 (SL) et la subvention fct Investigator IF / 00256/2015 (PO). M.C.M.-M. a été soutenu par une bourse individuelle Marie Skłodowska-Curie (panel de réintégration) dans le cadre du programme-cadre Horizon 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des structures sphériques, allant de ~ 20 à 400 nm de diamètre, libérées par pratiquement tous les organismes dans leur environnementenvironnant 1,2,3. Les vésicules sont délimitées par une bicouche lipidique et ne peuvent pas se répliquer. Chez les bactéries à Gram négatif, on pense que ces structures proviennent principalement du « blebbing » de petites portions de la membrane externe. Pourtant, d’autres processus, y compris le mouvement flagellaire, la lyse cellulaire et la sécrétion de matériau membranaire interne et externe, peuvent également produire des vésicules 4,5. Les VE peuvent contenir diverses biomolécules, y compris des lipides, des protéines solubles et membranaires, des acides nucléiques et des métabolites, et peuvent transporter ce matériau entre les cellules 4,5,6. Compte tenu de ces caractéristiques, les VE sont à l’étude pour comprendre leurs rôles possibles dans un large éventail de processus biologiques, y compris la communication cellulaire, la formation de biofilm, le transfert horizontal de gènes, la dynamique hôte-phage et l’échange de nutriments 4,6.
Les cyanobactéries sont un groupe important et diversifié de bactéries à Gram négatif, y compris les organismes unicellulaires et filamenteux. Ils sont intéressants à bien des égards, y compris la compréhension de leur physiologie et de leur diversité 7,8, les fonctions écosystémiques critiques qu’ils servent 9,10 et leur utilité pour la biotechnologie11,12. Les cyanobactéries se trouvent dans une grande variété d’habitats, soit en tant qu’organismes libres dans les environnements marins, d’eau douce et terrestres, soit en association symbiotique avec des mousses, des fougères, des plantes ou dans des lichens et des éponges13. Ils servent de producteurs primaires cruciaux dans les écosystèmes aquatiques, produisant de l’oxygène et du carbone organique par photosynthèse oxygénée 9,10, et certains sont capables de fixer l’azote atmosphérique ainsique 7. Les cyanobactéries marines et d’eau douce, y compris Prochlorococcus, Synechococcus et Synechocystis, produisent des VE dans des conditions de laboratoire 14,15,16, et des vésicules cyanobactériennes peuvent également être trouvées dans des environnements naturels14,17. Les fonctions biologiques et écologiques des vésicules cyanobactériennes sont inconnues, mais d’autres recherches dans ce domaine sont susceptibles de fournir de nouvelles informations sur les questions sur la physiologie cyanobactérienne, la différenciation, les stratégies de communication, l’évolution et les interactions trophiques. En outre, la capacité des véhicules électriques cyanobactériens à transporter diverses catégories de biomolécules peut avoir des applications commerciales18,19.
Le présent protocole décrit les méthodes d’isolement et de caractérisation des vésicules à partir de cultures cyanobactériennes et d’échantillons de terrain afin de permettre et d’encourager un examen plus large de la biologie des vésicules extracellulaires cyanobactériennes. Bien que le flux de travail décrit ici soit analogue aux protocoles d’isolement et de caractérisation des VE d’autres bactéries, les cultures cyanobactériennes et les échantillons de terrain contiennent généralement des concentrations de cellules et de vésicules plus faibles que celles couramment observées avec les systèmes de modèles associés à l’hôte ou pathogènes 20,21,22. Ainsi, les études sur les VE cyanobactériens nécessitent des considérations et des optimisations particulières pour la culture et l’isolement des vésicules, qui varient davantage entre les souches et les milieux. Comme aucun protocole unique ne fonctionnera aussi bien pour toutes les souches, conditions de croissance et applications en aval, nous proposons de multiples options et discutons des compromis impliqués afin que les chercheurs puissent déterminer les approches les plus appropriées pour répondre à leurs questions expérimentales.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

Les cyanobactéries sont un groupe diversifié de bactéries photosynthétiques à Gram négatif qui jouent un rôle essentiel dans les écosystèmes mondiaux et servent de modèles biotechnologiques essentiels. Des travaux récents ont démontré que les cyanobactéries marines et d’eau douce produisent des vésicules extracellulaires - de petites structures membranaires libérées par la surface externe des microbes. Bien que les vésicules contribuent probablement à divers processus biologiques, leurs rôles fonctionnels spécifiques en biologie cyanobactérienne restent largement inconnus. Pour encourager et faire progresser la recherche dans ce domaine, un protocole détaillé est présenté pour isoler, concentrer et purifier les vésicules extracellulaires cyanobactériennes. Les travaux actuels portent sur les méthodologies qui ont permis d’isoler avec succès des vésicules de grandes cultures de Prochlorococcus, Synechococcus et Synechocystis. Les méthodes de quantification et de caractérisation des échantillons de vésicules de ces souches sont présentées. Des approches pour isoler les vésicules à partir d’échantillons de terrain aquatique sont également décrites. Enfin, les défis typiques rencontrés avec la purification des vésicules cyanobactériennes, les considérations méthodologiques pour différentes applications en aval et les compromis entre les approches sont également discutés.

La figure 1 présente un aperçu du processus d’isolement des vésicules cyanobactériennes, mettant en évidence les aspects clés du protocole décrit ici. Il convient de noter en particulier les étapes détaillant la séparation de la biomasse cyanobactérienne de la fraction de petites particules (vésicule), la concentration de l’échantillon de vésicule et l’isolement et la purification des vésicules (figure 1, étapes 2 à 4), qui sont essentielles à l’obtention de préparations reproductibles de vésicules. La figure 2 présente les résultats représentatifs de l’isolement et de la caractérisation des vésicules extracellulaires de la cyanobactérie Synechocystis sp. PCC 6803. Il a été démontré que la membrane externe de cette cyanobactérie contient des caroténoïdes31, qui confèrent une coloration orange caractéristique aux échantillons de vésicules prélevés par granulation directe par ultracentrifugation (figure 2A). Une fois la pastille de vésicule remise en suspension, les vésicules peuvent être examinées par microscopie électronique à transmission (TEM), soit en colorant négativement des échantillons avec de l’acétate d’uranyle (figure 2B), soit par observation de coupes ultraminces (figure 2C). La distribution de la taille des vésicules et la concentration peuvent être évaluées à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Figure 2D) et d’analyses de suivi des nanoparticules (NTA) (Figure 2E). Avec le protocole décrit, généralement ~ 3,5 ± 1,0 x 108 nanoparticules par mL ont été obtenues dans une culture en croissance exponentielle de Synechocystis sp. PCC 6803 à un OD730 de 1,0. Des analyses biochimiques des VE isolés peuvent être effectuées pour compléter la caractérisation physique des vésicules isolées. À titre d’exemple, les vésicules purifiées de Synechocystis sp. PCC 6803 ont été séparées sur un gel de SDS-polyacrylamide et colorées pour les lipopolysaccharides (LPS; Figure 2F). Comme les LPS sont spécifiques à la membrane externe32, la détection des LPS peut valider la présence de vésicules liées à la membrane et servir de marqueur pour analyser la teneur relative des vésicules entre les préparations de la même souche33. L’inspection de l’abondance relative du LPS de faible ou de haut poids moléculaire peut indiquer des changements dans la composition des vésicules entre les échantillons34,35.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> Figure 1 : Procédures expérimentales utilisées pour l’isolement et la caractérisation des cyanobactéries EV. Représentations schématiques des cultures en croissance (1) et séparation de la biomasse cyanobactérienne du milieu de croissance (2). Les échantillons sans cellules contenant des vésicules sont concentrés (3), puis les VE sont isolés et purifiés (4). Selon l’application, les préparations de vésicules peuvent être caractérisées à l’aide d’une ou d’une combinaison de microscopie électronique à transmission (TEM), d’analyse de suivi des nanoparticules (NTA), de diffusion dynamique de la lumière (DLS) et de profilage des lipopolysaccharides (LPS) (5). RT, température ambiante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> Figure 2 : Résultats représentatifs de l’isolement et de la caractérisation des vésicules extracellulaires pour la cyanobactérie Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Photographie de la pastille de vésicule extracellulaire (pastille DE VE) obtenue après ultracentrifugation du milieu extracellulaire concentré sans cellule à partir d’une culture de 600 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 cultivée jusqu’à une OD730 de 1,0-1,5. Notez la coloration orange typique de la pastille de vésicule dérivée des caroténoïdes présents dans la membrane externe. (B,C) Photographies par microscopie électronique à transmission (TEM) de sections colorées négativement (B) et ultraminces (C) d’échantillons de vésicules de Synechocystis sp. PCC 6803. Barres d’échelle: 200 nm et 50 nm, respectivement. Les échantillons ont été visualisés sur un microscope électronique à transmission fonctionnant à 80 kV. (D) Diagramme typique de diffusion dynamique de la lumière (DLS) illustrant la distribution du volume de la vésicule en fonction du diamètre de la vésicule (en nm). Les lignes colorées indiquent les données de trois mesures techniques répliquées du même échantillon. (E) Données représentatives d’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) de la distribution de la taille des vésicules extracellulaires de Synechocystis (en nm). La ligne noire indique la moyenne de trois répétitions techniques, et les lignes rouges représentent l’erreur-type de la moyenne. (F) Le profil des lipopolysaccharides (LPS) a été détecté après avoir séparé la préparation des vésicules par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide SDS à 16 % (p/v) et la coloration avec un kit de coloration LPS commercial. Les LPS de faible et de haut poids moléculaire, correspondant respectivement à des formes de LPS rugueuses et lisses, sont détectables. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Équation pour calculer r. Le nombre de vésicules produites par cellule et par génération entre deux points au cours de la croissance exponentielle (généralement le début et la fin du cours du temps) est déterminé à l’aide de cette équation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Le présent protocole fournit des descriptions détaillées pour l’isolement, la concentration et la caractérisation des vésicules extracellulaires provenant de cultures cyanobactériennes. Les approches pour purifier les vésicules de cultures à différentes échelles, les compromis entre les méthodologies et les considérations pour travailler avec des échantillons de terrain sont également discutés.

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires cyanobactériennes

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Ce protocole est important car il démontre non seulement des approches pour purifier les vésicules de la culture à différentes échelles, des compromis, des différences entre les méthodologies et aussi la prise en compte du travail avec des échantillons de terrain. Les cyanobactéries présentent des défis uniques en matière d’échantillonnage et d’analyse des vésicules. Ces techniques ont réussi à isoler et à concentrer des vésicules issues de cultures et d’échantillons environnementaux.Pour concentrer des échantillons de moins de 500 millilitres, commencez par rincer les concentrateurs centrifuges à ultrafiltration de 15 à 20 millilitres avec de l’eau de qualité ultrapure de type 1. Chargez les concentrateurs dans la centrifugeuse et faites tourner à 4 400 x g à quatre degrés Celsius. Jetez le run through et répétez l’étape au moins deux fois.Chargez l’échantillon de surnageant dans un concentrateur rincé à l’eau et tournez-le dans les mêmes conditions. Répétez cette étape jusqu’à ce que l’échantillon soit concentré sur un volume final de 15 à 30 millilitres. Pour concentrer un volume de plus de 500 millilitres, effectuez une filtration tangentielle en installant l’appareil comme décrit dans le manuscrit.Fixez une pompe péristaltique à la ligne d’admission et placez des pinces réglables sur la ligne de rétentat. Désinfectez la filtration à flux tangentiel comme décrit dans le manuscrit, puis rincez l’appareil avec un litre d’eau ultrapure de type 1. Ajouter moins de 0,2 micron de filtrat dans le réservoir d’échantillon.Augmentez lentement la vitesse de la pompe et les niveaux de contre-pression sur la conduite de rétentat pour augmenter le rendement des conduites de filtrat. Continuez à faire fonctionner la filtration à flux tangentiel et remplissez le réservoir avec un surnageant de culture au fur et à mesure que le matériau est retiré. Arrêtez de concentrer l’échantillon une fois que le volume dans le réservoir atteint la quantité la plus faible possible nécessaire pour maintenir le débit dans la conduite d’admission sans introduire de bulles d’air.Fermez la ligne de sortie avec une pince. Retirez la contre-pression sur la ligne de rétentat. Recirculez le surnageant concentré à travers le filtre pendant 10 minutes, réduisant ainsi le taux de recirculation de 20 à 40 millilitres par minute pour maximiser la récupération.Déplacez la ligne de rétentat dans un récipient propre, retirez la ligne d’admission de l’échantillon et prélevez le matériau concentré. Récupérez tout matériau restant dans le réservoir d’échantillon à l’aide d’une pipette. Filtrer le surnageant concentré à travers un filtre à seringue de 0,2 micron.Si nécessaire, conservez le concentré final à quatre degrés Celsius pendant environ trois semaines avant de passer à la purification des vésicules. Pour granuler l’échantillon de culture concentré, placez-le dans un tube ultracentrifuge propre et ajoutez un milieu propre ou un tampon pour vous assurer que le tube est rempli. Après centrifugation, retirer le surnageant avec une pipette.Lavez à nouveau le matériau granulé avec un milieu de culture frais ou un tampon de lavage, tel qu’une solution saline tamponnée au phosphate 1X et répétez la centrifugation. Remettre en suspension le granulé final en culture fraîche par pipetage doux avec une pipette d’un millilitre et le transférer dans un récipient propre. Pour effectuer l’ultracentrifugation du gradient de densité, préparez des stocks d’iodixanol comme décrit dans le manuscrit.Mélanger une partie du tampon 4X avec trois parties de bouillon d’iodixanol à 60% pour obtenir une solution d’iodixanol à 45%. Diluer 45% d’iodixanol avec un tampon 1X pour créer des stocks de milieux de gradient de concentrations finales d’iodixanol de 40, 35, 30, 20, 15 et 10%. Ensuite, superposez soigneusement des quantités égales de toutes ces souches de gradient d’iodixanol dans un tube ultracentrifuge, en utilisant tout le volume du tube.Après centrifugation, recueillir les fractions de 0,5 millilitre chacune pour un gradient d’environ 4,5 millilitres en pipetant soigneusement ou en utilisant un collecteur de fractions. Déterminer la densité de chaque fraction, en grammes par millilitre, à l’aide d’une balance analytique et d’une pipette étalonnée. Retirez l’échantillon du tube, déterminez le poids et retournez l’échantillon dans le tube.Diluer les fractions individuelles avec un tampon propre dans un nouveau tube suivi d’un milieu propre ou d’un lavage tampon. Appliquez soigneusement cinq microlitres de vésicule et laissez-la reposer pendant cinq minutes. Retirez l’échantillon en touchant le bord d’une grille à un morceau de papier filtre propre.Pipeter 20 à 50 microlitres d’acétate d’uranyle à 2% sur une surface plane recouverte d’un film plastique. Placez ensuite la grille flottant dessus pendant deux minutes. Retirez l’acétate d’uranyle à l’aide de papier filtre et flottez brièvement sur une goutte d’eau ultrapure pour le laver.Remplissez la chambre d’eau ultrapure à l’aide d’une seringue propre et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air. Cliquez sur démarrer la caméra et visualisez la région optimale de la chambre autour de l’empreinte du pouce. Faites glisser les curseurs de gain d’écran et de niveau de caméra vers le maximum, puis diminuez jusqu’au niveau le plus bas pour voir les particules les plus faibles.Ajustez la mise au point si nécessaire pour vous assurer que les particules sont à peu près également visibles dans le champ de vision et continuez à laver avec de l’eau ultra propre jusqu’à ce que la chambre soit propre. Ajouter l’échantillon de vésicule à la chambre à l’aide d’une seringue d’un millilitre et confirmer les paramètres d’acquisition. Sélectionnez mesure standard dans la liste déroulante SOP et modifiez les paramètres pour collecter au moins trois répliques techniques de vidéos de 60 secondes chacune.Appuyez sur create 'and run script' et suivez les instructions et poussez environ 100 microlitres d’échantillon dans la chambre entre les réplications. Déterminez les paramètres des particules en cliquant sur analyse et ouvrez l’expérience et chargez le fichier d’échantillon. Sélectionnez traiter les fichiers sélectionnés et attendez la fin de l’analyse.L’isolement et la caractérisation des vésicules extracellulaires de la cyanobactérie Synechocystis sp. PCC6803, ont montré que la membrane externe contient des carotinoïdes, qui confèrent une coloration orange caractéristique aux échantillons de vésicules prélevés par granulation directe par ultracentrifugation. La pastille de vésicule remise en suspension a été examinée par microscopie électronique à transmission, soit en colorant négativement des échantillons avec de l’acétate d’uranyle, soit en observant des sections ultraminces.La distribution de la taille et la concentration des vésicules ont été évaluées à l’aide d’analyses de diffusion dynamique de la lumière et de suivi des nanoparticules. Les vésicules purifiées de Synechocystis sp. PCC6803 ont été séparées sur un gel de dodécysulfate de sodium-polyacrylamide et colorées pour les lipopolysaccharides.Des échantillons doivent être prélevés avant et après l’échantillon de vésicules concentrées pour s’assurer que la filtration à flux tangentiel fonctionne et que les vésicules se concentrent. Ensuite, vous devez mesurer les deux échantillons à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules. Des efforts futurs sont nécessaires pour fusionner cette méthode avec d’autres approches telles que la chromatographie d’exclusion de taille ou le fractionnement asymétrique en flux de champ afin d’améliorer la discrimination et l’isolement des petites particules des échantillons de culture et environnementaux.Cette technique est utile pour étudier les vésicules de cyanobactéries et les rôles fonctionnels spécifiques de ces vésicules en biologie cyanobactérienne.

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Analyse de Flux extracellulaire isolement, caractérisation et un débit élevé de souris primaire tubulaire les cellules épithéliales rénales

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification et analyse de Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Analyse de suivi des nanoparticules pour la quantification et la détermination de la taille des vésicules extracellulaires

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Microscopie à reconstruction optique stochastique directe de vésicules extracellulaires en trois dimensions

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Isolement et purification évolutifs de vésicules extracellulaires à partir d’Escherichia coli et d’autres bactéries

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Isolement et caractérisation du phycobilisome intact chez les cyanobactéries

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolement de microARN à partir de cultures de glandes salivaires ex vivo et de vésicules extracellulaires

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...