Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Die Autoren würdigen die Unterstützung der i3S Scientific Platforms "Biointerfaces and Nanotechnology" und "Histology and Electron Microscopy", einem Mitglied der nationalen Infrastruktur Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Wir danken auch Prof. J. A. Gonzalez-Reyes (Universität Córdoba, Spanien) für die Unterstützung bei der Optimierung des ultradünnen Abschnittsfärbeprotokolls für TEM und Dr. Cecília Durães und Dr. Ana Rita Pinto (Universität Porto, Portugal) für die Nanopartikel-Tracking-Analyse.
Diese Arbeit wurde von der US National Science Foundation (OCE-2049004 an SJB), von Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) Mitteln durch das COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal, 2020, und aus portugiesischen Mitteln durch Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior im Rahmen des Projekts POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO) finanziert. Fundação para a Ciência e a Tecnologia ist auch für das PhD-Stipendium SFRH/BD/130478/2017 (SL) und das FCT Investigator Grant IF/00256/2015 (PO) hoch anerkannt. M.C.M.-M. wurde durch ein Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (Reintegration Panel) innerhalb des Horizon 2020 Rahmenprogramms (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891) unterstützt.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind sphärische Strukturen mit einem Durchmesser zwischen ~ 20-400 nm, die von praktisch allen Organismen in ihre Umgebung freigesetztwerden 1,2,3. Vesikel sind durch eine Lipiddoppelschicht begrenzt und können sich nicht selbst replizieren. Bei gramnegativen Bakterien wird angenommen, dass diese Strukturen hauptsächlich durch "Blöken" kleiner Teile aus der äußeren Membran entstehen. Dennoch können andere Prozesse, einschließlich der Flagellenbewegung, der Zelllyse und der Sekretion von innerem und äußerem Membranmaterial, ebenfallsVesikel produzieren 4,5. EVs können verschiedene Biomoleküle enthalten, einschließlich Lipide, lösliche und Membranproteine, Nukleinsäuren und Metaboliten, und können dieses Material zwischen den Zellentransportieren 4,5,6. Angesichts dieser Merkmale werden EVs untersucht, um ihre mögliche Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen zu verstehen, einschließlich zellulärer Kommunikation, Biofilmbildung, horizontalem Gentransfer, Wirt-Phagen-Dynamik und Nährstoffaustausch 4,6.
Cyanobakterien sind eine große und vielfältige Gruppe von gramnegativen Bakterien, einschließlich einzelliger und fadenförmiger Organismen. Sie sind aus vielen Perspektiven von Interesse, einschließlich des Verständnisses ihrer Physiologie und Vielfalt7,8, der kritischen Ökosystemfunktionen, denen sie dienen 9,10, und ihres Nutzens für die Biotechnologie 11,12. Cyanobakterien kommen in einer Vielzahl von Lebensräumen vor, entweder als frei lebende Organismen in Meeres-, Süßwasser- und terrestrischen Umgebungen oder in symbiotischen Assoziationen mit Moosen, Farnen, Pflanzen oder in Flechten und Schwämmen13. Sie dienen als entscheidende Primärproduzenten in aquatischen Ökosystemen und produzieren Sauerstoff und organischen Kohlenstoff durch sauerstoffhaltige Photosynthese 9,10, und einige sind in der Lage, auch atmosphärischen Stickstoff zu fixieren 7. Marine und Süßwassercyanobakterien, einschließlich Prochlorococcus, Synechococcus und Synechocystis, produzieren EVs unter Laborbedingungen 14,15,16, und Cyanobakterienvesikel können auch in natürlichen Umgebungen gefunden werden 14,17. Die biologischen und ökologischen Funktionen von cyanobakteriellen Vesikeln sind unbekannt, aber weitere Forschungen auf diesem Gebiet werden wahrscheinlich neue Einblicke in Fragen der zyanobakteriellen Physiologie, Differenzierung, Kommunikationsstrategien, Evolution und trophischen Interaktionen liefern. Darüber hinaus kann die Fähigkeit cyanobakterieller EVs, verschiedene Kategorien von Biomolekülen zu tragen, kommerzielle Anwendungen haben18,19.
Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von Vesikeln aus cyanobakteriellen Kulturen und Feldproben, um eine breitere Untersuchung der zyanobakteriellen extrazellulären Vesikelbiologie zu ermöglichen und zu fördern. Während der hier beschriebene Workflow analog zu Protokollen zur Isolierung und Charakterisierung von EVs aus anderen Bakterien ist, enthalten cyanobakterielle Kulturen und Feldproben typischerweise niedrigere Zell- und Vesikelkonzentrationen, als dies bei wirtsassoziierten oder pathogenen Modellsystemen üblicherweise beobachtet wird20,21,22. Daher erfordern Untersuchungen von cyanobakteriellen EVs besondere Überlegungen und Optimierungen für die Kultivierung und Vesikelisolierung, die zwischen Stämmen und Medienhintergründen weiter variieren. Da kein einzelnes Protokoll für alle Stämme, Wachstumsbedingungen und nachgelagerten Anwendungen gleich gut funktioniert, bieten wir mehrere Optionen und diskutieren die damit verbundenen Kompromisse, damit die Forscher die Ansätze bestimmen können, die für die Behandlung ihrer experimentellen Fragen am besten geeignet sind.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

Cyanobakterien sind eine vielfältige Gruppe von photosynthetischen, gramnegativen Bakterien, die eine entscheidende Rolle in globalen Ökosystemen spielen und als wesentliche biotechnologische Modelle dienen. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass sowohl marine als auch Süßwassercyanobakterien extrazelluläre Vesikel produzieren - kleine membrangebundene Strukturen, die von der äußeren Oberfläche der Mikroben freigesetzt werden. Während Vesikel wahrscheinlich zu verschiedenen biologischen Prozessen beitragen, bleiben ihre spezifischen funktionellen Rollen in der Cyanobakterienbiologie weitgehend unbekannt. Um die Forschung in diesem Bereich zu fördern und voranzutreiben, wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung, Konzentration und Reinigung von zyanobakteriellen extrazellulären Vesikeln vorgestellt. Die aktuelle Arbeit diskutiert Methoden, die erfolgreich Vesikel aus großen Kulturen von Prochlorococcus, Synechococcus und Synechocystis isoliert haben. Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Vesikelproben aus diesen Stämmen werden vorgestellt. Ansätze zur Isolierung von Vesikeln aus aquatischen Feldproben werden ebenfalls beschrieben. Schließlich werden auch typische Herausforderungen bei der Reinigung zyanobakterieller Vesikel, methodische Überlegungen für verschiedene nachgelagerte Anwendungen und die Zielkonflikte zwischen den Ansätzen diskutiert.

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den zyanobakteriellen Vesikel-Isolationsprozess und hebt die wichtigsten Aspekte des hier beschriebenen Protokolls hervor. Besonders hervorzuheben sind die Schritte zur Trennung der cyanobakteriellen Biomasse von der Fraktion der kleinen Partikel (Vesikel), die Konzentration der Vesikelprobe und die Isolierung und Reinigung der Vesikel (Abbildung 1, Schritte 2 bis 4), die für die Gewinnung reproduzierbarer Vesikelpräparate entscheidend sind. Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse aus der Isolierung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803. Es wurde gezeigt, dass die äußere Membran dieses Cyanobakteriums Carotinoide31 enthält, die den Proben der Vesikel, die durch direkte Pelletierung durch Ultrazentrifugation gesammelt wurden, eine charakteristische orange Färbung verleihen (Abbildung 2A). Sobald das Vesikelpellet resuspendiert ist, können Vesikel mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht werden, entweder durch negatives Färben von Proben mit Uranylacetat (Abbildung 2B) oder durch Beobachtung ultradünner Schnitte (Abbildung 2C). Die Verteilung und Konzentration der Vesikelgröße kann mithilfe von dynamischer Lichtstreuung (DLS) (Abbildung 2D) und Nanopartikel-Tracking-Analysen (NTA) (Abbildung 2E) beurteilt werden. Mit dem beschriebenen Protokoll wurden typischerweise ~3,5 ± 1,0 x 108 Nanopartikel pro ml in einer exponentiell wachsenden Kultur von Synechocystis sp. PCC 6803 bei einem OD730 von 1,0 erhalten. Biochemische Analysen von isolierten EVs können durchgeführt werden, um die physikalische Charakterisierung der isolierten Vesikel zu ergänzen. Als Beispiel wurden gereinigte Synechocystis sp. PCC 6803 Vesikel auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel getrennt und auf Lipopolysaccharide (LPS; Abbildung 2F). Da LPS spezifisch für die äußere Membran32 sind, kann der LPS-Nachweis das Vorhandensein von membrangebundenen Vesikeln validieren und als Marker für die Analyse des relativen Vesikelgehalts zwischen Präparaten desselben Stammes33 dienen. Die Inspektion der relativen Häufigkeit von LPS mit niedrigem vs. hohem Molekulargewicht kann auf Veränderungen in der Vesikelzusammensetzung zwischen Proben34,35 hinweisen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Experimentelle Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von cyanobakteriellen EV. Schematische Darstellung von Anbaukulturen (1) und Trennung von cyanobakterieller Biomasse vom Wachstumsmedium (2). Zellfreie Proben, die Vesikel enthalten, werden konzentriert (3), und dann werden die EVs isoliert und gereinigt (4). Je nach Anwendung können Vesikelpräparate mittels einer oder einer Kombination aus Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), dynamischer Lichtstreuung (DLS) und Lipopolysaccharid-Profiling (LPS) charakterisiert werden (5). RT, Raumtemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der extrazellulären Vesikelisolierung und Charakterisierung für das Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Foto des extrazellulären Vesikelpellets (EVs-Pellet), das nach Ultrazentrifugation des konzentrierten zellfreien extrazellulären Mediums aus einer 600 ml Synechocystis sp. PCC 6803-Kultur erhalten wurde, die zu einem OD730 von 1,0-1,5 gezüchtet wurde. Beachten Sie die typische orange Färbung des Vesikelpellets, die von den Carotinoiden in der äußeren Membran abgeleitet ist. (B,C) Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Aufnahmen von negativ gefärbten (B) und ultradünnen Schnitten (C) von Synechocystis sp. PCC 6803 Vesikelproben. Skalenbalken: 200 nm bzw. 50 nm. Die Proben wurden auf einem Transmissionselektronenmikroskop visualisiert, das mit 80 kV betrieben wurde. (D) Typisches Diagramm der dynamischen Lichtstreuung (DLS), das die Verteilung des Vesikelvolumens als Funktion des Vesikeldurchmessers (in nm) darstellt. Farbige Linien zeigen Daten aus drei technischen Wiederholungsmessungen derselben Probe. (E) Repräsentative Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) Daten der Synechocystis extrazellulären Vesikelgrößenverteilung (in nm). Die schwarze Linie zeigt den Mittelwert von drei technischen Replikaten an, und die roten Linien stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. (F) Das Profil der Lipopolysaccharide (LPS) wurde nach der Trennung der Vesikelpräparation durch Elektrophorese auf einem 16%igen (w/v) SDS-Polyacrylamid-Gel und der Färbung mit einem handelsüblichen LPS-Färbeset nachgewiesen. LPS mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, die rauen bzw. glatten LPS-Formen entsprechen, sind nachweisbar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Zusatzdatei 1: Gleichung zur Berechnung von r. Die Anzahl der Vesikel, die pro Zelle und Generation zwischen zwei Punkten während des exponentiellen Wachstums (typischerweise dem Anfang und dem Ende des Zeitverlaufs) produziert werden, wird mit dieser Gleichung bestimmt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die Isolierung, Konzentration und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus Cyanobakterienkulturen. Ansätze zur Reinigung von Vesikeln aus Kulturen auf verschiedenen Skalen, Kompromisse zwischen den Methoden und Überlegungen zur Arbeit mit Feldproben werden ebenfalls diskutiert.

Isolierung und Charakterisierung von zyanobakteriellen extrazellulären Vesikeln

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es nicht nur Ansätze zur Reinigung von Vesikeln aus Kultur auf verschiedenen Skalen, Kompromisse, Unterschiede zwischen den Methoden und auch die Berücksichtigung der Arbeit mit Feldproben demonstriert. Cyanobakterien stellen einzigartige Herausforderungen bei der Probenahme und Analyse von Vesikeln dar. Diese Techniken haben erfolgreich Vesikel aus Kultur und aus Umweltproben isoliert und konzentriert.Um Proben von weniger als 500 Millilitern zu konzentrieren, beginnen Sie mit dem Spülen der 15 bis 20 Milliliter Ultrafiltrationszentrifugalkonzentratoren mit Reinstwasser Typ 1. Laden Sie die Konzentratoren in die Zentrifuge und drehen Sie sie bei 4.400 x g bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Durchlauf und wiederholen Sie den Schritt mindestens zweimal.Laden Sie die überstehende Probe in einen mit Wasser gespülten Konzentrator und drehen Sie sie unter den gleichen Bedingungen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Probe auf ein endgültiges Volumen von 15 bis 30 Millilitern konzentriert ist. Um ein Volumen von mehr als 500 Millilitern zu konzentrieren, führen Sie eine tangentiale Strömungsfiltration durch, indem Sie die Vorrichtung wie im Manuskript beschrieben einrichten.Befestigen Sie eine Peristaltikpumpe an der Ansaugleitung und platzieren Sie verstellbare Klemmen an der Retentatorleitung. Desinfizieren Sie die tangentiale Strömungsfiltration, wie im Manuskript beschrieben, und spülen Sie das Gerät dann mit einem Liter Reinstwasser Typ 1. Weniger als 0,2 Mikron Filtrat in das Probenreservoir geben.Erhöhen Sie langsam die Pumpendrehzahl und den Gegendruck an der Retentatleitung, um die Leistung der Filtratleitungen zu erhöhen. Fahren Sie mit der tangentialen Strömungsfiltration fort und füllen Sie das Reservoir mit Kulturüberständen auf, während das Material entfernt wird. Stoppen Sie die Konzentration der Probe, sobald das Volumen im Reservoir die geringstmögliche Menge erreicht hat, die erforderlich ist, um den Durchfluss in die Ansaugleitung aufrechtzuerhalten, ohne Luftblasen einzuführen.Schließen Sie die Abflussleitung mit einer Klemme. Entfernen Sie den Gegendruck auf der Retentionslinie. Rezirkulieren Sie den konzentrierten Überstand für 10 Minuten durch den Filter und reduzieren Sie die Rezirkulationsrate von 20 auf 40 Milliliter pro Minute, um die Rückgewinnung zu maximieren.Bewegen Sie die Retentatlinie in ein sauberes Gefäß, entfernen Sie die Ansaugleitung aus der Probe und sammeln Sie das konzentrierte Material. Das verbleibende Material im Probenbehälter wird mit einer Pipette zurückgewonnen. Filtern Sie den konzentrierten Überstand durch einen 0,2 μm Spritzenfilter.Lagern Sie das Endkonzentrat bei Bedarf etwa drei Wochen lang bei vier Grad Celsius, bevor Sie zur Vesikelreinigung übergehen. Um die konzentrierte Kulturprobe zu pelletieren, legen Sie sie in ein sauberes Ultrazentrifugenröhrchen und fügen Sie sauberes Medium oder Puffer hinzu, um sicherzustellen, dass das Röhrchen gefüllt ist. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand mit einer Pipette.Waschen Sie das pelletierte Material mit frischen Nährmedien oder Waschpuffer, wie z.B. 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung und wiederholen Sie die Zentrifugation. Resuspendiert das endgültige Pellet in frischer Kultur durch schonendes Pipettieren mit einer Ein-Milliliter-Pipette und gibt es in ein sauberes Gefäß. Um eine Dichtegradienten-Ultrazentrifugation durchzuführen, bereiten Sie Iodixanol-Bestände wie im Manuskript beschrieben vor.Mischen Sie einen Teil des 4X-Puffers mit drei Teilen von 60% iodixanol-Material, um eine 45% -iodixanol-Lösung herzustellen. Verdünnen Sie 45% Iodixanol mit 1X Puffer, um Vorräte an Gradientenmedien von 40, 35, 30, 25, 20, 15 und 10% Endiodixanol-Konzentrationen zu erhalten. Überlagern Sie dann vorsichtig gleiche Mengen all dieser Iodixanol-Gradientenmaterialien in ein Ultrazentrifugenröhrchen, wobei das gesamte Röhrchenvolumen genutzt wird.Nach der Zentrifugation werden die Fraktionen von jeweils 0,5 Millilitern für einen Gradienten von etwa 4,5 Millilitern durch sorgfältiges Pipettieren oder Verwenden eines Fraktionssammlers gesammelt. Bestimmen Sie die Dichte jeder Fraktion in Gramm pro Milliliter mit einer Analysenwaage und einer kalibrierten Pipette. Entfernen Sie die Probe aus dem Röhrchen, bestimmen Sie das Gewicht und bringen Sie die Probe zurück in das Röhrchen.Verdünnen Sie einzelne Fraktionen mit sauberem Puffer in einem neuen Röhrchen, gefolgt von einer sauberen Medien- oder Pufferwäsche. Tragen Sie vorsichtig fünf Mikroliter Vesikel auf und lassen Sie es fünf Minuten einwirken. Entfernen Sie die Probe, indem Sie den Rand eines Gitters mit einem Stück sauberem Filterpapier berühren.Pippen Sie 20 bis 50 Mikroliter 2% Uranylacetat auf eine flache Oberfläche, die mit Kunststofffolie bedeckt ist. Legen Sie dann das Gitter zwei Minuten lang schwebend darauf. Entfernen Sie Uranylacetat mit Filterpapier und lassen Sie es kurz auf einem Tropfen Reinstwasser schwimmen, um es zu waschen.Füllen Sie die Kammer mit Reinstwasser mit einer sauberen Spritze und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen entstehen. Klicken Sie auf "Kamera starten" und visualisieren Sie den optimalen Bereich der Kammer um den Daumenabdruck. Schieben Sie die Schieberegler für Bildschirmverstärkung und Kameraebene in Richtung Maximum und verringern Sie sie dann auf die niedrigste Stufe, um die dunkelsten Partikel zu sehen.Passen Sie den Fokus nach Bedarf an, um sicherzustellen, dass die Partikel im gesamten Sichtfeld ungefähr gleich sichtbar sind, und waschen Sie weiter mit ultrasauberem Wasser, bis die Kammer sauber ist. Geben Sie die Vesikelprobe mit einer Ein-Milliliter-Spritze in die Kammer und bestätigen Sie die Aufnahmeeinstellungen. Wählen Sie "Standardmessung" aus der Dropdown-Box SOP und ändern Sie die Einstellungen, um mindestens drei technische Replikate von jeweils 60-Sekunden-Videos zu sammeln.Drücken Sie create'and run script' und folgen Sie den Anweisungen und drücken Sie ungefähr 100 Mikroliter Probe in die Kammer zwischen den Replikaten. Bestimmen Sie die Partikelparameter, indem Sie auf Analyse klicken, das Experiment öffnen und die Beispieldatei laden. Wählen Sie "Ausgewählte Dateien verarbeiten" und warten Sie, bis die Analyse abgeschlossen ist.Die Isolierung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC6803 zeigte, dass die äußere Membran Carotinoide enthält, die den durch direkte Pelletierung durch Ultrazentrifugation entnommenen Vesikelproben eine charakteristische orange Färbung verleihen. Das resuspendierte Vesikelpellet wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie entweder durch negative Färbung von Proben mit Uranylacetat oder durch Beobachtung ultradünner Schnitte untersucht.Die Vesikelgrößenverteilung und -konzentration wurden mit Hilfe von dynamischer Lichtstreuung und Nanopartikel-Tracking-Analysen bewertet. Gereinigte Synechocystis sp. PCC6803 Vesikel wurden auf einem Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gel getrennt und auf Lipopolysaccharide gefärbt.Proben sollten vor und nach der konzentrierten Vesikelprobe entnommen werden, um sicherzustellen, dass die tangentiale Strömungsfiltration funktioniert und sich die Vesikel konzentrieren. Dann müssen Sie beide Proben mit der Nanopartikel-Tracking-Analyse messen. Zukünftige Anstrengungen sind erforderlich, um diese Methode mit anderen Ansätzen wie der Größenausschlusschromatographie oder der asymmetrischen Feldflussfraktionierung zu kombinieren, um die Unterscheidung und Isolierung kleiner Partikel aus Kultur- und Umweltproben zu verbessern.Diese Technik ist hilfreich, um die Cyanobakterienvesikel und die spezifischen funktionellen Rollen dieser Vesikel in der Cyanobakterienbiologie zu untersuchen.

Research

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Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Isolierung und Charakterisierung intakter Phycobilisomen in Cyanobakterien

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...