Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

המחברים מכירים בתמיכת הפלטפורמות המדעיות של i3S "Biointerfaces וננו-טכנולוגיה", ו"היסטולוגיה ומיקרוסקופיית אלקטרונים", חברה בפלטפורמה הפורטוגזית של התשתית הלאומית של הדמיה ביולוגית (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). אנו מודים גם לפרופ' J. A. Gonzalez-Reyes (אוניברסיטת קורדובה, ספרד) על עזרתו לייעל את פרוטוקול צביעת החלק הדק במיוחד עבור TEM, ולד"ר ססיליה דוראייס וד"ר אנה ריטה פינטו (אוניברסיטת פורטו, פורטוגל) על ניתוח המעקב אחר ננו-חלקיקים.
עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע של ארה"ב (OCE-2049004 ל- SJB), על ידי Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) באמצעות התוכנית האופרציונלית של תחרות 2020 לתחרותיות ובינאום (POCI), פורטוגל, 2020, ועל ידי קרנות פורטוגזיות באמצעות Fundação para a Ciência e a Tecnologia /Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior במסגרת הפרויקט POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 ל- PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia מוכר מאוד גם עבור מלגת הדוקטורט SFRH/BD/130478/2017 (SL), ומענק חוקר FCT IF/00256/2015 (PO). מ.כ.מ.-מ. נתמך על ידי מלגת מארי סקלודובסקה-קירי (פאנל שילוב מחדש) במסגרת תוכנית המסגרת של Horizon 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מבנים כדוריים, בקוטר של כ-20-400 ננומטר, המשוחררים על ידי כמעט כל האורגניזמים לסביבתם 1,2,3. שלפוחיות מופרדות על ידי דו-שכבת שומנים שאינן יכולות לשכפל את עצמן. בחיידקים גראם-שליליים, מבנים אלה נחשבים כמתעוררים בעיקר על ידי 'בליטה' של חלקים קטנים מהממברנה החיצונית. ובכל זאת, תהליכים אחרים, כולל תנועת פלגלר, תזה תאית והפרשת חומר הממברנה הפנימית והחיצונית, יכולים לייצר גםהם שלפוחיות 4,5. כלי רכב חשמליים יכולים להכיל ביומולקולות שונות, כולל שומנים, חלבונים מסיסים וממברנה, חומצות גרעין ומטבוליטים, ויכולים להעביר את החומר הזה בין תאים 4,5,6. בהינתן תכונות אלה, כלי רכב חשמליים נחקרים כדי להבין את תפקידם האפשרי במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל תקשורת תאית, היווצרות ביופילם, העברת גנים אופקית, דינמיקה של פאגים-מארחים וחילופי חומרים מזינים 4,6.
ציאנובקטריה הם קבוצה גדולה ומגוונת של חיידקים גראם שליליים, כולל אורגניזמים חד-תאיים ונמרצים. הם מעניינים מנקודות מבט רבות, כולל הבנת הפיזיולוגיה והמגוון שלהם 7,8, פונקציות המערכת האקולוגית הקריטיות שהם משרתים 9,10, והתועלת שלהם לביוטכנולוגיה11,12. ציאנובקטריה נמצאים במגוון רחב של בתי גידול, בין אם כאורגניזמים חופשיים בסביבות ימיות, מים מתוקים ויבשתיים, או בקשרים סימביוטיים עם טחבים, שרכים, צמחים, או בחזזיות וספוגים13. הם משמשים כיצרנים ראשוניים חיוניים במערכות אקולוגיות ימיות, ומייצרים חמצן ופחמן אורגני באמצעות פוטוסינתזה חמצנית 9,10, וחלקם מסוגלים לקבע חנקן אטמוספרי גם7. ציאנובקטריה ימית ומים מתוקים, כולל פרוכלורוקוק, סינכוקוקוס וסינצ'וציסטיס, מייצרים כלי רכב חשמליים בתנאי מעבדה 14,15,16, וניתן למצוא שלפוחית ציאנובקטריאלית גם בסביבות טבעיות 14,17. התפקודים הביולוגיים והאקולוגיים של שלפוחיות ציאנובקטריאליות אינם ידועים, אך מחקר נוסף בתחום זה עשוי לספק תובנות חדשות לשאלות על פיזיולוגיה ציאנובקטריאלית, התמיינות, אסטרטגיות תקשורת, אבולוציה ואינטראקציות טרופיות. בנוסף, היכולת של כלי רכב חשמליים ציאנובקטריאליים לשאת קטגוריות מגוונות של ביומולקולות עשויה להיות בעלת יישומים מסחריים18,19.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לבידוד ואפיון של בועיות מתרביות ציאנובקטריאליות ומדגימות שדה כדי לאפשר ולעודד בחינה רחבה יותר של ביולוגיה של שלפוחית חוץ-תאית ציאנובקטריאלית. בעוד שזרימת העבודה המתוארת כאן מקבילה לפרוטוקולים לבידוד ואפיון של כלי רכב חשמליים מחיידקים אחרים, תרביות ציאנובקטריאליות ודגימות שדה מכילות בדרך כלל ריכוזי תאים ושלפוחית נמוכים יותר ממה שנצפה בדרך כלל במערכות מודל הקשורות למארח או פתוגניות 20,21,22. לפיכך, מחקרים על כלי רכב חשמליים ציאנובקטריאליים דורשים שיקולים ואופטימיזציות מיוחדות לטיפוח ובידוד שלפוחית, המשתנים עוד יותר בין זנים לרקע תקשורתי. מכיוון שאף פרוטוקול יחיד לא יעבוד באותה מידה עבור כל הזנים, תנאי הגדילה והיישומים במורד הזרם, אנו מספקים אפשרויות מרובות ודנים בפשרות הכרוכות בכך, כך שחוקרים יוכלו לקבוע את הגישות המתאימות ביותר להתמודדות עם שאלות הניסוי שלהם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

ציאנובקטריה הם קבוצה מגוונת של חיידקים פוטוסינתטיים, גראם-שליליים, הממלאים תפקידים קריטיים במערכות אקולוגיות גלובליות ומשמשים כמודלים ביו-טכנולוגיים חיוניים. עבודות אחרונות הראו כי הן ציאנובקטריה ימית והן ציאנובקטריה של מים מתוקים מייצרים שלפוחיות חוץ-תאיות - מבנים קטנים הקשורים לממברנה המשתחררים מפני השטח החיצוניים של המיקרובים. בעוד שהבועיות ככל הנראה תורמות לתהליכים ביולוגיים מגוונים, התפקידים התפקודיים הספציפיים שלהן בביולוגיה הציאנובקטריאלית עדיין אינם ידועים במידה רבה. כדי לעודד ולקדם את המחקר בתחום זה, מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד, ריכוז וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות ציאנובקטריאליות. העבודה הנוכחית דנה במתודולוגיות שבודדו בהצלחה שלפוחיות מתרבויות גדולות של פרוכלורוקוק, סינכוקוק וסינצ'וציסטיס. מוצגות שיטות לכימות ואפיון דגימות שלפוחית מזנים אלה. כמו כן מתוארות גישות לבידוד שלפוחיות מדגימות שדה ימי. לבסוף, נדונים גם אתגרים אופייניים שנתקלים בהם עם טיהור שלפוחית ציאנובקטריאלית, שיקולים מתודולוגיים ליישומים שונים במורד הזרם והפשרות בין הגישות.

איור 1 מציג סקירה כללית של תהליך בידוד השלפוחית הציאנובקטריאלית, ומדגיש היבטים מרכזיים של הפרוטוקול המתואר כאן. יש לציין במיוחד את השלבים המפרטים את ההפרדה של ביומסה ציאנובקטריאלית מחלק החלקיק הקטן (שלפוחית), תוך ריכוז דגימת השלפוחית ובידוד וטיהור השלפוחית (איור 1, שלבים 2 עד 4), שהם קריטיים להשגת תכשירים הניתנים לשחזור של שלפוחית. איור 2 מציג תוצאות מייצגות מהבידוד והאפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות מהציאנובקטריום Synechocystis sp. PCC 6803. הממברנה החיצונית של ציאנובקטריום זה הוכחה כמכילה קרוטנואידים31, המעניקים צבע כתום אופייני לדגימות של בועיות שנאספו על ידי כדור ישיר דרך אולטרה-צנטריפוגציה (איור 2A). ברגע שכדור השלפוחית עובר החייאה, ניתן לבחון את הבועיות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), בין אם על ידי צביעה שלילית של דגימות עם אורניל אצטט (איור 2B) או על ידי תצפית על מקטעי אולטרה-טימין (איור 2C). ניתן להעריך את התפלגות וריכוז גודל השלפוחית באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) (איור 2D) וניתוחי מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) (איור 2E). עם הפרוטוקול המתואר, בדרך כלל ~ 3.5 ± 1.0 x 108 ננו-חלקיקים למ"ל התקבלו בתרבית גדלה באופן אקספוננציאלי של Synechocystis sp. PCC 6803 ב OD730 של 1.0. ניתוחים ביוכימיים של כלי רכב חשמליים מבודדים יכולים להתבצע כדי להשלים את האפיון הפיזיקלי של הבועיות המבודדות. לדוגמה, בועיות Synechocystis sp. PCC 6803 מטוהרות הופרדו על ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד והוכתמו עבור ליפופוליסכרידים (LPS; איור 2F). מכיוון ש-LPS הם ספציפיים לממברנה החיצונית32, זיהוי LPS יכול לאמת את נוכחותם של בועיות הקשורות לממברנה ולשמש סמן לניתוח תכולת שלפוחית יחסית בין תכשירים מאותו זן33. בדיקה של השפע היחסי של משקל מולקולרי נמוך לעומת גבוה LPS יכולה להצביע על שינויים בהרכב השלפוחית בין דגימות34,35.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> איור 1: הליכים ניסיוניים המשמשים לבידוד ואפיון של ר"ח ציאנובקטריאלי. ייצוגים סכמטיים של תרביות גידול (1) והפרדת ביומסה ציאנובקטריאלית ממדיום הגידול (2). דגימות נטולות תאים המכילות שלפוחיות מרוכזות (3), ואז כלי הרכב החשמליים מבודדים ומטוהרים (4). בהתאם ליישום, ניתן לאפיין תכשירי שלפוחית באמצעות אחד או שילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM), ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA), פיזור אור דינמי (DLS) ופרופיל ליפופוליסכריד (LPS) (5). RT, טמפרטורת החדר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> איור 2: תוצאות מייצגות של בידוד השלפוחית החוץ-תאית ואפיון עבור הציאנובקטריום Synechocystis sp. PCC 6803. (A) תצלום של גלולת השלפוחית החוץ-תאית (גלולת רכב חשמלי) שהתקבלה לאחר אולטרה-צנטריפוגציה של המדיום החוץ-תאי המרוכז נטול התאים מתרבית Synechocystis sp. PCC 6803 בגודל 600 מ"ל שגדלה ל-OD730 של 1.0-1.5. שימו לב לצבע הכתום הטיפוסי של גלולת השלפוחית שמקורה בקרוטנואידים שנמצאו בקרום החיצוני. (ב,ג) צילומי מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) של מקטעים מוכתמים שלילית (B) ואולטרה-טווין (C) של דגימות שלפוחית Synechocystis sp. PCC 6803. סרגלי קנה מידה: 200 ננומטר ו-50 ננומטר, בהתאמה. דגימות הודגמו על מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת המופעל במהירות של 80 קילו-וולט. (D) תרשים טיפוסי של פיזור אור דינמי (DLS) המתאר את התפלגות נפח השלפוחית כפונקציה של קוטר השלפוחית (ב- nm). קווים צבעוניים מציינים נתונים משלוש מדידות שכפול טכניות של אותה דגימה. (E) נתוני ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים מייצגים (NTA) של התפלגות גודל השלפוחית החוץ-תאית של Synechocystis (ב-nm). הקו השחור מציין את הממוצע של שלושה שכפולים טכניים, והקווים האדומים מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע. (F) פרופיל ליפופוליסכרידים (LPS) זוהה לאחר הפרדת הכנת השלפוחית על ידי אלקטרופורזה על ג'ל SDS-polyacrylamide של 16% (w/v) וצביעה באמצעות ערכת צביעה מסחרית של LPS. ניתן לזהות LPS במשקל מולקולרי נמוך וגבוה, המתאים לצורות LPS גסות וחלקות, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
קובץ משלים 1: משוואה לחישוב r. מספר הבועיות המיוצרות לכל תא לדור בין שתי נקודות במהלך הגדילה האקספוננציאלית (בדרך כלל ההתחלה והסוף של מסלול הזמן) נקבע באמצעות משוואה זו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאורים מדוקדקים לבידוד, ריכוז ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות מתרביות ציאנובקטריאליות. כמו כן נדונו גישות לטיהור בועיות מתרבויות בקני מידה שונים, פשרות בין מתודולוגיות ושיקולים לעבודה עם דוגמאות שטח.

בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות ציאנובקטריאליות

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שהוא לא רק מדגים גישות לטיהור שלפוחית מתרבות בקני מידה שונים, פשרות, הבדלים בין מתודולוגיות וגם התחשבות בעבודה עם דוגמאות שדה. ציאנובקטריה מציגה אתגרי דגימת שלפוחית וניתוח ייחודיים. טכניקות אלה בודדו וריכזו בהצלחה שלפוחיות מתרבות ומדגימות סביבתיות.כדי לרכז דגימות של פחות מ -500 מיליליטר, התחל עם שטיפה של 15 עד 20 מחוללי אולטרה-סינון צנטריפוגליים מסוג 1 עם מים בדרגה אולטרה-פורית מסוג 1. טען את הריכוזים לצנטריפוגה וסובב ב 4, 400 x g בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הריצה ולחזור על הצעד לפחות פעמיים.טענו את דגימת ה-supernatant לתוך רכז שטוף מים וסובבו באותם תנאים. חזור על שלב זה עד שהדגימה מרוכזת לנפח סופי של 15 עד 30 מיליליטר. כדי לרכז נפח של יותר מ-500 מיליליטר, בצע סינון זרימה משיק על ידי הגדרת המנגנון כמתואר בכתב היד.חברו משאבה פריסטלטית לקו הכניסה והניחו מהדקים מתכווננים על קו הכניסה החוזרת. יש לטהר את סינון הזרימה המשיק כפי שמתואר בכתב היד, ולאחר מכן לשטוף את המכשיר לליטר אחד של מים בדרגה אולטרה-פורית מסוג 1. הוסף פחות מ 0.2 מיקרון תפיח למאגר הדגימה.הגדל באיטיות את מהירות המשאבה ואת רמות הלחץ בחזרה על קו הכניסה החוזרת כדי להגדיל את התפוקה מקווי התסיסה. המשך להפעיל את סינון הזרימה המשיק ולמלא מחדש את המאגר בתרבית סופרנאטית עם הסרת החומר. הפסיקו לרכז את הדגימה ברגע שהנפח במאגר מגיע לכמות הנמוכה ביותר האפשרית הדרושה כדי לשמור על זרימה לקו הכניסה מבלי להכניס בועות אוויר.סגור את קו הזרימה באמצעות מהדק. הסר את הלחץ האחורי על קו הכניסה החוזרת. שחזרו את הסופרנאטנט המרוכז דרך המסנן למשך 10 דקות, והפחיתו את קצב הסירקולציה מ-20 ל-40 מיליליטר לדקה כדי למקסם את ההתאוששות.הזז את קו הכניסה מחדש לכלי נקי, הסר את קו הצריכה מהדגימה ואסוף את החומר המרוכז. שחזרו כל חומר שנותר במאגר הדגימה באמצעות פיפטה. סנן את חומר העל המרוכז דרך מסנן מזרקים של 0.2 מיקרון.במידת הצורך, אחסנו את התרכיז הסופי בארבע מעלות צלזיוס למשך כשלושה שבועות לפני המעבר לטיהור שלפוחית. כדי לכדור את דגימת התרבית המרוכזת מניחים אותה בצינור אולטרה-צנטריפוג' נקי ומוסיפים מדיה נקייה או חיץ כדי להבטיח שהצינור מלא. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט עם פיפטה.יש לשטוף מחדש את החומר הנגוע בטכניקת תרבית טרייה או במאגר שטיפה, כגון 1X מלוחים עם תמיסת פוספטים, ולחזור על הצנטריפוגה. בצעו החייאה של הכדור הסופי בתרבות טרייה על ידי צנרת עדינה עם פיפטה של מיליליטר אחד והעבירו אותו לכלי נקי. כדי לבצע אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, הכינו את מניות יודיקסנול כמתואר בכתב היד.ערבבו חלק אחד של מאגר ה-4X עם שלושה חלקים של מלאי יודיקסנול של 60% כדי ליצור פתרון של 45% יודיקסנול. דילול 45% יודיקסנול עם מאגר 1X כדי ליצור מלאי של מדיה הדרגתית של 40, 35, 30, 25, 20, 15 ו-10% ריכוזי יודיקסנול סופיים. לאחר מכן, שכבו בזהירות כמויות שוות של כל מלאי השיפוע של יודיקסנול לתוך צינור ultracentrifuge, תוך ניצול כל נפח הצינור.לאחר צנטריפוגה, אספו את השברים של 0.5 מיליליטר כל אחד עבור שיפוע של כ-4.5 מיליליטר על ידי צנרת קפדנית או שימוש במלקט שברים. קבע את הצפיפות של כל שבר, בגרמים למיליליטר, באמצעות איזון אנליטי ופיפטה מכוילת. הסר את הדגימה מהצינור, קבע את המשקל והחזיר את הדגימה לצינור.דיללו שברים בודדים עם חיץ נקי בצינור חדש ולאחר מכן שטיפת מדיה נקייה או חיץ. בזהירות להחיל חמישה microliters של שלפוחית ולתת לו לשבת במשך חמש דקות. הסר את הדגימה על-ידי נגיעה בקצה הרשת בפיסת נייר סינון נקייה.פיפטה הוציאה 20 עד 50 מיקרוליטרים של 2% אורניל אצטט על משטח שטוח המכוסה בסרט פלסטיק. לאחר מכן הניחו את הרשת המרחפת מעליה למשך שתי דקות. מוציאים אורניל אצטט באמצעות נייר סינון וצפים לזמן קצר על טיפת מים אולטרה-פורים לשטיפה.מלאו את התא במים אולטרה-פוריים באמצעות מזרק נקי והבטיחו שאין בועות אוויר. לחץ על הפעל את המצלמה' ודמיין את האזור האופטימלי של החדר סביב טביעת האגודל. החלק את המחוונים של רווח המסך ורמת המצלמה לכיוון המרבי, ואז הקטן לרמה הנמוכה ביותר כדי לראות את החלקיקים העמומים ביותר.התאם את המיקוד לפי הצורך כדי להבטיח שהחלקיקים נראים בערך באותה מידה על פני שדה הראייה והמשך לשטוף במים נקיים במיוחד עד שהתא נקי. הוסף את דגימת השלפוחית לתא באמצעות מזרק מיליליטר אחד ואישר את הגדרות הרכישה. בחר מדידה רגילה'מהתיבה הנפתחת SOP ושנה את ההגדרות כדי לאסוף לפחות שלושה שכפולים טכניים של סרטוני וידאו של 60 שניות כל אחד.לחץ על צור והפעל סקריפט', עקוב אחר ההנחיות ודחף כ-100 מיקרוליטרים של דגימה לתוך התא בין שכפולים. קבעו את הפרמטרים של החלקיקים על ידי לחיצה על ניתוח 'וניסוי פתוח' וטענו את קובץ הדגימה. בחר תהליך קבצים נבחרים 'והמתן להשלמת הניתוח.הבידוד והאפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות מהציאנובקטריום Synechocystis sp. PCC6803, הראו כי הממברנה החיצונית מכילה קרוטינואידים, המעניקים צבע כתום אופייני לדגימות שלפוחית שנאספו על ידי גלולה ישירה באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה. גלולת השלפוחית המחודשת נבדקה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים של העברה על ידי צביעה שלילית של דגימות עם אורניל אצטט או על ידי תצפית על מקטעי אולטרה-טיין.התפלגות גודל השלפוחית והריכוז הוערכו באמצעות ניתוחי פיזור אור דינמיים ומעקב אחר ננו-חלקיקים. בועיות Synechocystis sp. PCC6803 מטוהרות הופרדו על ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד והוכתמו עבור ליפופוליסכרידים.יש לקחת דגימות לפני ואחרי דגימת השלפוחית המרוכזת כדי להבטיח שסינון הזרימה המשיק עובד והבועיות מרוכזות. אז אתה צריך למדוד את שתי הדגימות באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. נדרשים מאמצים עתידיים למזג שיטה זו עם גישות אחרות כגון כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל או פיצול אסימטרי של זרימת שדה כדי לשפר את האפליה והבידוד של חלקיקים קטנים מדגימות תרביות וסביבה.טכניקה זו מסייעת לחקור את שלפוחית הציאנובקטריה ואת התפקידים התפקודיים הספציפיים של בועיות אלה בביולוגיה ציאנובקטריאלית.

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

ניתוח השטף חוץ-תאי בידוד, אפיון, תפוקה גבוהה של העכבר הראשי כליות צינורי בתאי אפיתל

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

מיקרוסקופיה ישירה לשחזור אופטי סטוכאסטי של שלשלות חוץ-תאיות בשלושה ממדים

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...