Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

लेखकi3S वैज्ञानिक प्लेटफार्मों "Biointerfaces और नैनो टेक्नोलॉजी", और "Histology and Electron Microscopy", Bioimaging के राष्ट्रीय बुनियादी ढांचे पुर्तगाली प्लेटफ़ॉर्म (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) के एक सदस्य के समर्थन को स्वीकार करते हैं। हम टीईएम के लिए अल्ट्रा-थिन सेक्शन स्टेनिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में मदद करने के लिए प्रोफेसर जे ए गोंजालेज-रेयेस (कॉर्डोबा विश्वविद्यालय, स्पेन) और डॉ सेसिलिया ड्यूरेस और डॉ एना रीटा पिंटो (पोर्टो विश्वविद्यालय, पुर्तगाल) को नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए धन्यवाद देते हैं।
इस काम को यूएस नेशनल साइंस फाउंडेशन (OCE-2049004 से SJB तक) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, Fundo Europeu de De De Dessenvolvimento Regional (FEDER) द्वारा Compete 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalization (POCI), पुर्तगाल, 2020 के माध्यम से, और Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino-05 के ढांचे में Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino-01 के ढांचे में 01-05-010000 के ढांचे में। Fundação पैरा एक Ciência e एक Tecnologia भी पीएचडी फैलोशिप SFRH / BD / 130478 / 2017 (SL) के लिए बहुत स्वीकार किया जाता है, और FCT अन्वेषक अनुदान IF / 00256 / 2015 (पीओ)। M.C.M.-M. क्षितिज 2020 फ्रेमवर्क प्रोग्राम (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891) के भीतर एक मैरी Skloodowska-Curie व्यक्तिगत फैलोशिप (Reintegration पैनल) द्वारा समर्थित था।

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं (ईवी) गोलाकार संरचनाएं हैं, जो व्यास में ~ 20-400 एनएम के बीच होती हैं, जो लगभग सभी जीवों द्वारा अपने आसपास के वातावरण 1,2,3 में जारी की जाती हैं। पुटिकाओं को लिपिड बाईलेयर द्वारा सीमांकित किया जाता है और वे खुद को दोहरा नहीं सकते हैं। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में, इन संरचनाओं को मुख्य रूप से बाहरी झिल्ली से छोटे भागों के 'ब्लेबिंग' द्वारा उत्पन्न माना जाता है। फिर भी, फ्लैगेलर गति, सेल लाइसिस, और आंतरिक और बाहरी झिल्ली सामग्री दोनों के स्राव सहित अन्य प्रक्रियाएं, पुटिकाओं के साथ-साथ 4,5 का उत्पादन कर सकती हैं। ईवी में लिपिड, घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और मेटाबोलाइट्स सहित विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स हो सकते हैं, और इस सामग्री को कोशिकाओं 4,5,6 के बीच परिवहन कर सकते हैं। इन विशेषताओं को देखते हुए, ईवी का अध्ययन जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में उनकी संभावित भूमिकाओं को समझने के लिए किया जा रहा है, जिसमें सेलुलर संचार, बायोफिल्म गठन, क्षैतिज जीन स्थानांतरण, मेजबान-फेज गतिशीलता और पोषक तत्व विनिमय 4,6 शामिल हैं।
साइनोबैक्टीरिया ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया का एक बड़ा और विविध समूह है, जिसमें एककोशिकीय और फिलामेंटस जीव शामिल हैं। वे कई दृष्टिकोणों से रुचि रखते हैं, जिसमें उनके शरीर विज्ञान और विविधताको समझना शामिल है 7,8, महत्वपूर्ण पारिस्थितिकी तंत्र कार्य जो वे 9,10 की सेवा करते हैं, और जैव प्रौद्योगिकी के लिए उनकी उपयोगिता11,12। साइनोबैक्टीरिया विभिन्न प्रकार के आवासों में पाए जाते हैं, या तो समुद्री, मीठे पानी और स्थलीय वातावरण में मुक्त रहने वाले जीवों के रूप में, या काई, फर्न, पौधों के साथ सहजीवी संघों में, या लाइकेन और स्पंजमें 13। वे जलीय पारिस्थितिक तंत्र में महत्वपूर्ण प्राथमिक उत्पादकों के रूप में कार्य करते हैं, ऑक्सीजनिक प्रकाश संश्लेषण 9,10 के माध्यम से ऑक्सीजन और कार्बनिक कार्बन का उत्पादन करते हैं, और कुछ वायुमंडलीय नाइट्रोजनको ठीक करने में सक्षम हैं। समुद्री और मीठे पानी के साइनोबैक्टीरिया, जिसमें प्रोक्लोरोकोकस, सिनेकोकोकस और सिनेकोसिस्टिस शामिल हैं, प्रयोगशाला की स्थिति में ईवी का उत्पादन करते हैं 14,15,16, और साइनोबैक्टीरियल पुटिकाएं प्राकृतिक वातावरण में भी पाई जा सकती हैं 14,17। साइनोबैक्टीरिया पुटिकाओं के जैविक और पारिस्थितिक कार्य अज्ञात हैं, लेकिन इस क्षेत्र में आगे के शोध से साइनोबैक्टीरियल फिजियोलॉजी, भेदभाव, संचार रणनीतियों, विकास और ट्रॉफिक इंटरैक्शन पर सवालों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने की संभावना है। इसके अलावा, बायोमोलेक्यूल्स की विविध श्रेणियों को ले जाने के लिए साइनोबैक्टीरिया ईवी की क्षमता में वाणिज्यिक अनुप्रयोग18,19 हो सकते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों और क्षेत्र के नमूनों से पुटिकाओं को अलग करने और विशेषता देने के तरीकों का वर्णन करता है ताकि साइनोबैक्टीरियल एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिका जीव विज्ञान की व्यापक परीक्षा को सक्षम और प्रोत्साहित किया जा सके। जबकि यहां वर्णित वर्कफ़्लो अन्य बैक्टीरिया से ईवी को अलग करने और विशेषता देने के लिए प्रोटोकॉल के अनुरूप है, साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों और क्षेत्र के नमूनों में आमतौर पर कम सेल और पुटिका सांद्रता होती है जो आमतौर पर मेजबान से जुड़े या रोगजनक मॉडल सिस्टम 20,21,22 के साथ देखी जाती है। इस प्रकार, साइनोबैक्टीरिया ईवी के अध्ययन के लिए खेती और पुटिका अलगाव के लिए विशेष विचारों और अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जो उपभेदों और मीडिया पृष्ठभूमि के बीच आगे भिन्न होते हैं। चूंकि कोई भी एकल प्रोटोकॉल सभी उपभेदों, विकास की स्थिति और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम नहीं करेगा, इसलिए हम कई विकल्प प्रदान करते हैं और इसमें शामिल ट्रेड-ऑफ पर चर्चा करते हैं ताकि शोधकर्ता अपने प्रयोगात्मक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए सबसे उपयुक्त दृष्टिकोण निर्धारित कर सकें।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

साइनोबैक्टीरिया प्रकाश संश्लेषक, ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया का एक विविध समूह है जो वैश्विक पारिस्थितिक तंत्र में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और आवश्यक जैव प्रौद्योगिकी मॉडल के रूप में कार्य करता है। हाल के काम से पता चला है कि समुद्री और मीठे पानी के सायनोबैक्टीरिया दोनों बाहरी पुटिकाओं का उत्पादन करते हैं - रोगाणुओं की बाहरी सतह से जारी छोटी झिल्ली-बाध्य संरचनाएं। जबकि पुटिकाएं संभवतः विविध जैविक प्रक्रियाओं में योगदान करती हैं, साइनोबैक्टीरिया जीव विज्ञान में उनकी विशिष्ट कार्यात्मक भूमिकाएं काफी हद तक अज्ञात हैं। इस क्षेत्र में अनुसंधान को प्रोत्साहित करने और आगे बढ़ाने के लिए, साइनोबैक्टीरिया एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं को अलग करने, ध्यान केंद्रित करने और शुद्ध करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। वर्तमान कार्य उन तरीकों पर चर्चा करता है जिन्होंने प्रोक्लोरोकोकस, सिनेकोकोकस और सिनेकोसिस्टिस की बड़ी संस्कृतियों से पुटिकाओं को सफलतापूर्वक अलग कर दिया है। इन उपभेदों से पुटिका के नमूनों को परिमाणित करने और विशेषता देने के लिए विधियां प्रस्तुत की गई हैं। जलीय क्षेत्र के नमूनों से पुटिकाओं को अलग करने के लिए दृष्टिकोण का भी वर्णन किया गया है। अंत में, साइनोबैक्टीरियल पुटिका शुद्धिकरण के साथ सामना की जाने वाली विशिष्ट चुनौतियों, विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पद्धतिगत विचार, और दृष्टिकोणों के बीच व्यापार-बंद पर भी चर्चा की जाती है।

चित्रा 1 साइनोबैक्टीरिया पुटिका अलगाव प्रक्रिया का एक सिंहावलोकन प्रस्तुत करता है, जो यहां वर्णित प्रोटोकॉल के प्रमुख पहलुओं को उजागर करता है। विशेष रूप से ध्यान दें कि छोटे कण (पुटिका) अंश से साइनोबैक्टीरिया बायोमास के अलगाव का विवरण देने वाले चरण हैं, पुटिका नमूने और पुटिका अलगाव और शुद्धिकरण (चित्रा 1, चरण 2 से 4) को केंद्रित करते हैं, जो पुटिकाओं की पुन: प्रस्तुत करने योग्य तैयारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। चित्रा 2 सायनोबैक्टीरियम Synechocystis sp. PCC 6803 से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के अलगाव और लक्षण वर्णन से प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करता है। इस सायनोबैक्टीरियम की बाहरी झिल्ली को कैरोटीनॉयड31 को शामिल करने के लिए दिखाया गया है, जो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (चित्रा 2 ए) के माध्यम से सीधे पैलेटिंग द्वारा एकत्र किए गए पुटिकाओं के नमूनों के लिए एक विशिष्ट नारंगी रंग प्रदान करता है। एक बार पुटिका गोली resuspended है, पुटिकाओं संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) द्वारा जांच की जा सकती है, या तो uranyl एसीटेट (चित्रा 2B) के साथ नकारात्मक धुंधला नमूनों द्वारा या अल्ट्राथिन वर्गों (चित्रा 2C) के अवलोकन द्वारा। पुटिका आकार वितरण और एकाग्रता का मूल्यांकन गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) (चित्रा 2 डी) और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) (चित्रा 2 ई) का उपयोग करके किया जा सकता है। वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, आमतौर पर ~ 3.5 ± 1.0 x 10प्रति एमएल 8 नैनोकणों को Synechocystis sp. PCC 6803 की तेजी से बढ़ती संस्कृति में 1.0 के OD730 पर प्राप्त किया गया था। पृथक ईवी के जैव रासायनिक विश्लेषण को पृथक पुटिकाओं के भौतिक लक्षण वर्णन के पूरक के लिए किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, शुद्ध Synechocystis एसपी पीसीसी 6803 पुटिकाओं को एक एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर अलग किया गया था और लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) के लिए दाग दिया गया था; चित्रा 2F)। चूंकि एलपीएस बाहरी झिल्ली32 के लिए विशिष्ट हैं, इसलिए एलपीएस का पता लगाने से झिल्ली-बाध्य पुटिकाओं की उपस्थिति को मान्य किया जा सकता है और एक ही तनाव33 से तैयारियों के बीच सापेक्ष पुटिका सामग्री का विश्लेषण करने के लिए एक मार्कर के रूप में काम किया जा सकता है। कम बनाम उच्च आणविक भार एलपीएस की सापेक्ष बहुतायत का निरीक्षण34,35 नमूनों के बीच पुटिका संरचना में परिवर्तन का संकेत दे सकता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> चित्रा 1: साइनोबैक्टीरिया ईवी अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं। बढ़ती संस्कृतियों (1) के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और विकास माध्यम (2) से साइनोबैक्टीरिया बायोमास का अलगाव। पुटिकाओं वाले सेल-मुक्त नमूने केंद्रित होते हैं (3), और फिर ईवी को अलग और शुद्ध किया जाता है (4). आवेदन के आधार पर, पुटिका की तैयारी को संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम), नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए), गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस), और लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) प्रोफाइलिंग (5) के एक या संयोजन का उपयोग करके विशेषता दी जा सकती है। आरटी, कमरे का तापमान। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> चित्रा 2: साइनोबैक्टीरियम Synechocystis sp. PCC 6803 के लिए बाह्य कोशिकीय पुटिका अलगाव और लक्षण वर्णन के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) 600 एमएल Synechocystis sp. PCC 6803 संस्कृति से केंद्रित सेल-मुक्त बाह्य कोशिकीय माध्यम के ultracentrifugation के बाद प्राप्त extracellular पुटिका गोली (EVs गोली) की तस्वीर 1.0-1.5 के एक OD730 के लिए उगाया. बाहरी झिल्ली में पाए जाने वाले कैरोटीनॉयड से व्युत्पन्न पुटिका गोली के विशिष्ट नारंगी रंग पर ध्यान दें। (B, C) संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) नकारात्मक रूप से दाग (बी) और Ultrathin वर्गों (सी) Synechocystis एसपी पीसीसी 6803 पुटिका नमूनों की तस्वीरें. स्केल बार: क्रमशः 200 एनएम और 50 एनएम। नमूनों को 80 केवी पर संचालित एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर कल्पना की गई थी। (डी) विशिष्ट गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) प्लॉट पुटिका व्यास (एनएम में) के एक समारोह के रूप में पुटिका आयतन के वितरण को दर्शाता है। रंगीन रेखाएं एक ही नमूने के तीन तकनीकी प्रतिकृति मापों से डेटा इंगित करती हैं। (ई) प्रतिनिधि nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) Synechocystis extracellular पुटिका आकार वितरण (एनएम में) के डेटा। काली रेखा तीन तकनीकी प्रतिकृतियों के माध्य को इंगित करती है, और लाल रेखाएं माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। (एफ) लिपोपॉलीसेकेराइड्स (एलपीएस) प्रोफ़ाइल को 16% (डब्ल्यू / वी) एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा पुटिका की तैयारी को अलग करने और वाणिज्यिक एलपीएस स्टेनिंग किट के साथ धुंधला करने के बाद पता लगाया गया था। कम और उच्च आणविक-वजन वाले एलपीएस, क्रमशः किसी न किसी और चिकनी-एलपीएस रूपों के अनुरूप, पता लगाने योग्य हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
अनुपूरक फ़ाइल 1: r की गणना करने के लिए समीकरण। घातीय विकास के दौरान दो बिंदुओं (आमतौर पर समय पाठ्यक्रम की शुरुआत और अंत) के बीच प्रति पीढ़ी प्रति कोशिका उत्पादित पुटिकाओं की संख्या इस समीकरण का उपयोग करके निर्धारित की जाती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।</a>

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Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

वर्तमान प्रोटोकॉल सायनोबैक्टीरिया संस्कृतियों से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के अलगाव, एकाग्रता और लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत विवरण प्रदान करता है। विभिन्न पैमानों पर संस्कृतियों से पुटिकाओं को शुद्ध करने के लिए दृष्टिकोण, तरीकों के बीच व्यापार-बंद, और क्षेत्र के नमूनों के साथ काम करने के लिए विचारों पर भी चर्चा की जाती है।

सायनोबैक्टीरिया एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स का अलगाव और लक्षण वर्णन

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह न केवल विभिन्न पैमानों पर संस्कृति से पुटिकाओं को शुद्ध करने के लिए दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है, व्यापार बंद, तरीकों के बीच अंतर और क्षेत्र के नमूनों के साथ काम करने के लिए भी विचार करता है। साइनोबैक्टीरिया अद्वितीय पुटिका नमूनाकरण और विश्लेषण चुनौतियों को प्रस्तुत करता है। इन तकनीकों ने संस्कृति से और पर्यावरणीय नमूनों से पुटिकाओं को सफलतापूर्वक अलग और केंद्रित किया है।500 मिलीलीटर से कम के नमूनों को केंद्रित करने के लिए, टाइप 1 अल्ट्राप्योर ग्रेड पानी के साथ 15 से 20 मिलीलीटर अल्ट्राफिलिटरेशन केन्द्रापसारक सांद्रक को धोने के साथ शुरू करें। सेंट्रीफ्यूज में सांद्रकों को लोड करें और चार डिग्री सेल्सियस पर 4, 400 x g पर स्पिन करें। रन थ्रू को छोड़ दें और चरण को कम से कम दो बार दोहराएं।एक पानी कुल्ला सांद्रक में supernatant नमूना लोड और एक ही शर्तों के तहत स्पिन. इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि नमूना 15 से 30 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा पर केंद्रित न हो जाए। 500 मिलीलीटर से अधिक की मात्रा को केंद्रित करने के लिए, पांडुलिपि में वर्णित उपकरण की स्थापना करके स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन करें।सेवन लाइन के लिए एक peristaltic पंप संलग्न करें और retentate लाइन पर समायोज्य clamps जगह. पांडुलिपि में वर्णित स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन को साफ करें, फिर डिवाइस को टाइप 1 अल्ट्राप्योर ग्रेड पानी के एक लीटर के साथ फ्लश करें। नमूना जलाशय में 0.2 माइक्रोन फिल्टर से कम जोड़ें।धीरे-धीरे फिल्टर लाइनों से आउटपुट बढ़ाने के लिए retentate लाइन पर पंप की गति और वापस दबाव के स्तर में वृद्धि। स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन चलाने के लिए जारी रखें और संस्कृति supernatant के साथ जलाशय को फिर से भरना के रूप में सामग्री हटा दिया जाता है. एक बार जलाशय में मात्रा हवा के बुलबुले शुरू किए बिना सेवन लाइन में प्रवाह को बनाए रखने के लिए आवश्यक सबसे कम संभव राशि तक पहुंचने के बाद नमूने को ध्यान केंद्रित करना बंद कर दें।एक क्लैंप के साथ बहिर्वाह रेखा को बंद करें। retentate लाइन पर वापस दबाव निकालें। 10 मिनट के लिए फ़िल्टर के माध्यम से केंद्रित supernatant recirculate, वसूली को अधिकतम करने के लिए प्रति मिनट 20 से 40 milliliters प्रति मिनट से recirculation दर को कम.एक साफ पोत में retentate लाइन ले जाएँ, नमूने से सेवन लाइन को हटाने और केंद्रित सामग्री इकट्ठा. एक पिपेट का उपयोग करके नमूना जलाशय में किसी भी शेष सामग्री को पुनर्प्राप्त करें। एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से केंद्रित supernatant फ़िल्टर।यदि आवश्यक हो, तो पुटिका शुद्धिकरण पर जाने से पहले लगभग तीन सप्ताह के लिए अंतिम ध्यान को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। गोली केंद्रित संस्कृति नमूना यह एक साफ ultracentrifuge ट्यूब में जगह है और यह सुनिश्चित करने के लिए कि ट्यूब भरा हुआ है स्वच्छ मीडिया या बफर जोड़ने के लिए। centrifugation के बाद, एक पिपेट के साथ supernatant निकालें।ताजा संस्कृति मीडिया या धोने बफर, जैसे 1X फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा के साथ छर्रेदार सामग्री को फिर से धोएं और सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं। एक मिलीलीटर पिपेट के साथ कोमल पिपेटिंग द्वारा ताजा संस्कृति में अंतिम गोली को फिर से निलंबित करें और इसे एक साफ पोत में स्थानांतरित करें। घनत्व ढाल ultracentrifugation प्रदर्शन करने के लिए, पांडुलिपि में वर्णित के रूप में iodixanol स्टॉक तैयार करें।45% आयोडिक्सनॉल समाधान बनाने के लिए 60% आयोडिक्सनॉल स्टॉक के तीन भागों के साथ 4X बफर के एक हिस्से को मिलाएं। 40, 35, 30, 25, 20, 15 और 10% अंतिम आयोडिक्सनॉल सांद्रता के ग्रेडिएंट मीडिया के स्टॉक बनाने के लिए 1X बफर के साथ 45% iodixanol पतला करें। फिर, ध्यान से इन सभी iodixanol ढाल शेयरों की बराबर मात्रा में एक ultracentrifuge ट्यूब में ओवरले, पूरे ट्यूब की मात्रा का उपयोग कर.centrifugation के बाद, ध्यान से pipetting या एक अंश कलेक्टर का उपयोग करके लगभग एक 4.5 मिलीलीटर ढाल के लिए प्रत्येक 0.5 मिलीलीटर के अंश ों को इकट्ठा करें। प्रत्येक अंश का घनत्व निर्धारित करें, ग्राम प्रति मिलीलीटर में, एक विश्लेषणात्मक संतुलन और कैलिब्रेटेड पिपेट का उपयोग करके। ट्यूब से नमूना निकालें, वजन निर्धारित करें और नमूना को ट्यूब पर वापस कर दें।एक नई ट्यूब में साफ बफर के साथ अलग-अलग अंशों को पतला करें, जिसके बाद एक साफ मीडिया या बफर वॉश होता है। ध्यान से पुटिका के पांच माइक्रोलीटर लागू करें और इसे पांच मिनट के लिए बैठने दें। साफ फिल्टर कागज के एक टुकड़े के लिए एक ग्रिड के किनारे को छूकर नमूना निकालें।प्लास्टिक फिल्म द्वारा कवर की गई एक सपाट सतह पर 2% यूरेनिल एसीटेट के 20 से 50 माइक्रोलीटर पिपेट। फिर इसके ऊपर तैरते हुए ग्रिड को दो मिनट के लिए रखें। फिल्टर पेपर का उपयोग करके यूरेनिल एसीटेट को हटा दें और धोने के लिए अल्ट्राप्योर पानी की एक बूंद पर संक्षेप में फ्लोट करें।एक साफ सिरिंज का उपयोग कर अल्ट्राप्योर पानी के साथ कक्ष को भरें और कोई हवा के बुलबुले सुनिश्चित करें। स्टार्ट कैमरा पर क्लिक करें 'और थंबप्रिंट के चारों ओर कक्ष के इष्टतम क्षेत्र की कल्पना करें। स्क्रीन लाभ 'और कैमरा स्तर'स्लाइडर अधिकतम की ओर स्लाइड करें, फिर सबसे मंद कणों को देखने के लिए निम्नतम स्तर तक कम करें।यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक के रूप में फोकस को समायोजित करें कि कण लगभग समान रूप से दृश्य के क्षेत्र में दिखाई देते हैं और जब तक कक्ष साफ नहीं हो जाता है तब तक अल्ट्रा साफ पानी से धोना जारी रखें। एक मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके कक्ष में पुटिका नमूना जोड़ें और अधिग्रहण सेटिंग्स की पुष्टि करें। एसओपी ड्रॉप डाउन बॉक्स से मानक माप का चयन करें और प्रत्येक 60 सेकंड के वीडियो की कम से कम तीन तकनीकी प्रतिकृतियों को इकट्ठा करने के लिए सेटिंग्स बदलें।प्रेस बनाएँ 'और स्क्रिप्ट चलाएँ' और संकेतों का पालन करें और प्रतिकृतियों के बीच कक्ष में नमूना के लगभग 100 microliters धक्का. विश्लेषण पर क्लिक करके कण पैरामीटर निर्धारित करें 'और प्रयोग खोलें' और नमूना फ़ाइल लोड करें। प्रक्रिया चयनित फ़ाइलों का चयन करें'और विश्लेषण के पूरा होने की प्रतीक्षा करें.सायनोबैक्टीरियम Synechocystis sp. PCC6803 से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के अलगाव और लक्षण वर्णन से पता चला है कि बाहरी झिल्ली में कैरोटीनोइड्स होते हैं, जो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से सीधे छर्रे लगाकर एकत्र किए गए पुटिका नमूनों के लिए एक विशेषता नारंगी रंग प्रदान करते हैं। पुन: निलंबित पुटिका गोली संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा या तो uranyl एसीटेट के साथ नकारात्मक धुंधला नमूनों द्वारा या अल्ट्राथिन वर्गों का निरीक्षण करके जांच की गई थी।पुटिका आकार वितरण और एकाग्रता का मूल्यांकन गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था। शुद्ध Synechocystis एसपी PCC6803 पुटिकाओं को एक सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर अलग किया गया था और लिपोपॉलीसेकेराइड के लिए दाग दिया गया था।नमूनों को केंद्रित पुटिका नमूने से पहले और बाद में लिया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन काम कर रहा है और पुटिकाएं केंद्रित हो रही हैं। फिर आपको नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण का उपयोग करके दोनों नमूनों को मापने की आवश्यकता है। संस्कृति और पर्यावरणीय नमूनों से छोटे कणों के भेदभाव और अलगाव में सुधार करने के लिए आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी या असममित क्षेत्र-प्रवाह फ्रैक्शनेशन जैसे अन्य दृष्टिकोणों के साथ इस विधि को विलय करने के लिए भविष्य के प्रयासों की आवश्यकता होती है।यह तकनीक साइनोबैक्टीरिया पुटिकाओं और साइनोबैक्टीरिया जीव विज्ञान में इन पुटिकाओं की विशिष्ट कार्यात्मक भूमिकाओं का अध्ययन करने में सहायक है।

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

फ्लो का प्रयोग कोशिकी vesicles के विश्लेषण के लिए तकनीक

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

मॉडल cyanobacterial प्रजाति में चिह्नित और markerless म्यूटेंट की पीढ़ी

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

अलगाव, लक्षण वर्णन, और माउस प्राथमिक गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के उच्च प्रवाह Extracellular फ्लक्स विश्लेषण

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

कोशिका-वातानुकूलित मीडिया से Extracellular बुलबुले के प्रवाह Cytometric विश्लेषण

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

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कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एक्सिटेलर वेसिकल्स का शुद्धिकरण और विश्लेषण

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स के क्वांटिफिकेशन और आकार निर्धारण के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

तीन आयामों में एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स की डायरेक्ट स्टोचस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

एस्चेरिचिया कोलाई और अन्य बैक्टीरिया से बाह्य पुटिकाओं का स्केलेबल अलगाव और शुद्धिकरण

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

सायनोबैक्टीरिया में बरकरार Phycobilisome के अलगाव और लक्षण वर्णन

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

टिक पूर्व विवो लार ग्रंथि संस्कृतियों और बाह्य पुटिकाओं से माइक्रोआरएनए का अलगाव

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...