Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Gli autori riconoscono il sostegno delle piattaforme scientifiche i3S "Biointerfacce e nanotecnologie" e "Istologia e microscopia elettronica", membro dell'infrastruttura nazionale Piattaforma portoghese di bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Ringraziamo anche il Prof. J. A. Gonzalez-Reyes (Università di Córdoba, Spagna) per aver contribuito a ottimizzare il protocollo di colorazione della sezione ultrasottile per TEM, e la Dott.ssa Cecília Durães e la Dott.ssa Ana Rita Pinto (Università di Porto, Portogallo) per l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle.
Questo lavoro è stato finanziato dalla US National Science Foundation (OCE-2049004 to SJB), dal Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) attraverso il COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portogallo, 2020, e da fondi portoghesi attraverso Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior nell'ambito del progetto POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia è anche fortemente riconosciuta per la borsa di dottorato SFRH / BD / 130478/2017 (SL) e la sovvenzione FCT Investigator IF / 00256 / 2015 (PO). M.C.M.-M. è stato sostenuto da una borsa di studio individuale Marie Skłodowska-Curie (gruppo di esperti sul reinserimento) nell'ambito del programma quadro Orizzonte 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Le vescicole extracellulari (EV) sono strutture sferiche, che variano tra ~ 20-400 nm di diametro, rilasciate praticamente da tutti gli organismi nel loro ambiente circostante 1,2,3. Le vescicole sono delimitate da un doppio strato lipidico e non possono replicarsi. Nei batteri Gram-negativi, si pensa che queste strutture sorgano principalmente per "blebbing" di piccole porzioni dalla membrana esterna. Tuttavia, altri processi, tra cui il movimento flagellare, la lisi cellulare e la secrezione di materiale di membrana sia interno che esterno, possono produrre vescicole anche 4,5. Gli EV possono contenere varie biomolecole, tra cui lipidi, proteine solubili e di membrana, acidi nucleici e metaboliti, e possono trasportare questo materiale tra le cellule 4,5,6. Date queste caratteristiche, i veicoli elettrici sono in fase di studio per comprendere i loro possibili ruoli in una vasta gamma di processi biologici, tra cui la comunicazione cellulare, la formazione di biofilm, il trasferimento genico orizzontale, la dinamica ospite-fago e lo scambio di nutrienti 4,6.
I cianobatteri sono un gruppo ampio e diversificato di batteri Gram-negativi, compresi organismi unicellulari e filamentosi. Sono di interesse da molte prospettive, tra cui la comprensione della loro fisiologia e diversità 7,8, le funzioni critiche dell'ecosistema che servono 9,10 e la loro utilità per la biotecnologia11,12. I cianobatteri si trovano in un'ampia varietà di habitat, sia come organismi viventi liberi in ambienti marini, d'acqua dolce e terrestri, sia in associazioni simbiotiche con muschi, felci, piante o in licheni e spugne13. Servono come produttori primari cruciali negli ecosistemi acquatici, producendo ossigeno e carbonio organico attraverso la fotosintesi ossigenata 9,10, e alcuni sono in grado di fissare anche l'azoto atmosferico7. I cianobatteri marini e d'acqua dolce, tra cui Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis, producono veicoli elettrici in condizioni di laboratorio 14,15,16 e le vescicole cianobatteriche si possono trovare anche in ambienti naturali14,17. Le funzioni biologiche ed ecologiche delle vescicole cianobatteriche sono sconosciute, ma è probabile che ulteriori ricerche in questo settore forniscano nuove intuizioni su questioni relative alla fisiologia cianobatterica, alla differenziazione, alle strategie di comunicazione, all'evoluzione e alle interazioni trofiche. Inoltre, la capacità dei veicoli elettrici cianobatterici di trasportare diverse categorie di biomolecole può avere applicazioni commerciali18,19.
Il presente protocollo descrive i metodi per isolare e caratterizzare le vescicole da colture cianobatteriche e campioni di campo per consentire e incoraggiare un esame più ampio della biologia delle vescicole extracellulari cianobatteriche. Mentre il flusso di lavoro qui descritto è analogo ai protocolli per isolare e caratterizzare i veicoli elettrici da altri batteri, le colture cianobatteriche e i campioni di campo contengono in genere concentrazioni di cellule e vescicole inferiori a quelle comunemente osservate con i sistemi modello associati all'ospite o patogeni 20,21,22. Pertanto, gli studi sui veicoli elettrici cianobatterici richiedono considerazioni e ottimizzazioni speciali per la coltivazione e l'isolamento delle vescicole, che variano ulteriormente tra ceppi e background dei mezzi. Poiché nessun singolo protocollo funzionerà ugualmente bene per tutti i ceppi, le condizioni di crescita e le applicazioni a valle, forniamo più opzioni e discutiamo i compromessi coinvolti in modo che i ricercatori possano determinare gli approcci più appropriati per affrontare le loro domande sperimentali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

I cianobatteri sono un gruppo eterogeneo di batteri fotosintetici e Gram-negativi che svolgono ruoli critici negli ecosistemi globali e fungono da modelli biotecnologici essenziali. Lavori recenti hanno dimostrato che sia i cianobatteri marini che quelli d'acqua dolce producono vescicole extracellulari - piccole strutture legate alla membrana rilasciate dalla superficie esterna dei microbi. Mentre le vescicole probabilmente contribuiscono a diversi processi biologici, i loro ruoli funzionali specifici nella biologia cianobatterica rimangono in gran parte sconosciuti. Per incoraggiare e far progredire la ricerca in questo settore, viene presentato un protocollo dettagliato per isolare, concentrare e purificare le vescicole extracellulari cianobatteriche. Il lavoro attuale discute le metodologie che hanno isolato con successo le vescicole da grandi colture di Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis. Vengono presentati i metodi per quantificare e caratterizzare i campioni di vescicole di questi ceppi. Vengono inoltre descritti approcci per isolare le vescicole dai campioni di campo acquatico. Infine, vengono discusse anche le sfide tipiche incontrate con la purificazione delle vescicole cianobatteriche, le considerazioni metodologiche per le diverse applicazioni a valle e i compromessi tra gli approcci.

La Figura 1 presenta una panoramica del processo di isolamento delle vescicole cianobatteriche, evidenziando gli aspetti chiave del protocollo qui descritto. Di particolare rilievo sono le fasi che dettagliano la separazione della biomassa cianobatterica dalla frazione di piccole particelle (vescicole), concentrando il campione di vescicole e l'isolamento e la purificazione delle vescicole (Figura 1, fasi da 2 a 4), che sono fondamentali per ottenere preparazioni riproducibili di vescicole. La Figura 2 presenta risultati rappresentativi dell'isolamento e della caratterizzazione delle vescicole extracellulari dal cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803. La membrana esterna di questo cianobatterio ha dimostrato di contenere carotenoidi31, che conferiscono una caratteristica colorazione arancione ai campioni di vescicole raccolti mediante pellettizzazione diretta attraverso ultracentrifugazione (Figura 2A). Una volta che il pellet di vescicole è stato risospeso, le vescicole possono essere esaminate mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM), sia colorando negativamente campioni con acetato di uranile (Figura 2B) o osservando sezioni ultrasottili (Figura 2C). La distribuzione e la concentrazione delle dimensioni delle vescicole possono essere valutate utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS) (Figura 2D) e le analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) (Figura 2E). Con il protocollo descritto, in genere ~ 3,5 ± 1,0 x 108 nanoparticelle per mL sono state ottenute in una coltura in crescita esponenziale di Synechocystis sp. PCC 6803 ad un OD730 di 1,0. Le analisi biochimiche dei veicoli elettrici isolati possono essere eseguite per integrare la caratterizzazione fisica delle vescicole isolate. Ad esempio, le vescicole purificate di Synechocystis sp. PCC 6803 sono state separate su un gel di poliacrilammide SDS e colorate per lipopolisaccaridi (LPS; Figura 2F). Poiché gli LPS sono specifici per la membrana esterna32, il rilevamento LPS può convalidare la presenza di vescicole legate alla membrana e fungere da marcatore per l'analisi del contenuto relativo delle vescicole tra i preparati dello stesso ceppo33. L'ispezione dell'abbondanza relativa di LPS a basso e alto peso molecolare può indicare cambiamenti nella composizione delle vescicole tra i campioni34,35.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> Figura 1: Procedure sperimentali utilizzate per l'isolamento e la caratterizzazione cianobatterica dei veicoli elettrici. Rappresentazioni schematiche di colture in crescita (1) e separazione della biomassa cianobatterica dal mezzo di crescita (2). I campioni privi di cellule contenenti vescicole sono concentrati (3), quindi i veicoli elettrici vengono isolati e purificati (4). A seconda dell'applicazione, i preparati di vescicole possono essere caratterizzati utilizzando una o una combinazione di microscopia elettronica a trasmissione (TEM), analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), diffusione dinamica della luce (DLS) e profilazione del lipopolisaccaride (LPS) (5). RT, temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> Figura 2: Risultati rappresentativi dell'isolamento delle vescicole extracellulari e della caratterizzazione per il cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Fotografia del pellet di vescicole extracellulari (EVs pellet) ottenuto dopo ultracentrifugazione del mezzo extracellulare concentrato privo di cellule da una coltura di Synechocystis sp. PCC 6803 da 600 mL coltivata a un OD730 di 1,0-1,5. Si noti la tipica colorazione arancione del pellet di vescicole derivato dai carotenoidi presenti nella membrana esterna. (B,C) Fotografie al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) di sezioni macchiate negativamente (B) e ultrasottili (C) di campioni di vescicole PCC 6803. Barre di scala: 200 nm e 50 nm, rispettivamente. I campioni sono stati visualizzati su un microscopio elettronico a trasmissione azionato a 80 kV. (D) Tipico diagramma a diffusione dinamica della luce (DLS) raffigurante la distribuzione del volume delle vescicole in funzione del diametro delle vescicole (in nm). Le linee colorate indicano i dati di tre misurazioni tecniche di replica dello stesso campione. (E) Dati rappresentativi di analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) della distribuzione extracellulare delle dimensioni delle vescicole di Synechocystis (in nm). La linea nera indica la media di tre repliche tecniche e le linee rosse rappresentano l'errore standard della media. (F) Il profilo dei lipopolisaccaridi (LPS) è stato rilevato dopo aver separato la preparazione della vescicola mediante elettroforesi su un gel SDS-poliacrilammide al 16% (p/v) e la colorazione con un kit di colorazione LPS commerciale. Sono rilevabili LPS a basso e alto peso molecolare, corrispondenti rispettivamente a forme LPS ruvide e lisce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: Equazione per calcolare r. Il numero di vescicole prodotte per cellula per generazione tra due punti durante la crescita esponenziale (tipicamente l'inizio e la fine del corso del tempo) è determinato usando questa equazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Il presente protocollo fornisce descrizioni dettagliate per l'isolamento, la concentrazione e la caratterizzazione di vescicole extracellulari da colture cianobatteriche. Vengono inoltre discussi gli approcci per purificare le vescicole da colture a diverse scale, i compromessi tra le metodologie e le considerazioni per lavorare con i campioni sul campo.

Isolamento e caratterizzazione delle vescicole extracellulari cianobatteriche

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Questo protocollo è significativo in quanto non solo dimostra approcci per purificare le vescicole dalla cultura a diverse scale, compromessi, differenze tra le metodologie e anche considerazione per lavorare con campioni di campo. I cianobatteri presentano sfide uniche per il campionamento e l'analisi delle vescicole. Queste tecniche hanno isolato e concentrato con successo le vescicole dalla coltura e da campioni ambientali.Per concentrare campioni inferiori a 500 millilitri, iniziare con il risciacquo dei concentratori centrifughi di ultrafiltrazione da 15 a 20 millilitri con acqua di grado ultrapuro di tipo 1. Caricare i concentratori nella centrifuga e ruotare a 4.400 x g a quattro gradi Celsius. Scartare la corsa e ripetere il passaggio almeno due volte.Caricare il campione di surnatante in un concentratore risciacquato con acqua e girare nelle stesse condizioni. Ripetere questo passaggio fino a quando il campione non è concentrato in un volume finale da 15 a 30 millilitri. Per concentrare un volume di oltre 500 millilitri, eseguire la filtrazione a flusso tangenziale impostando l'apparecchio come descritto nel manoscritto.Collegare una pompa peristaltica alla linea di aspirazione e posizionare morsetti regolabili sulla linea di retentato. Disinfettare la filtrazione a flusso tangenziale come descritto nel manoscritto, quindi lavare il dispositivo con un litro di acqua di tipo 1 di grado ultrapuro. Aggiungere meno di 0,2 micron di filtrato nel serbatoio del campione.Aumentare lentamente la velocità della pompa e i livelli di contropressione sulla linea di retentato per aumentare la produzione dalle linee di filtrato. Continuare a eseguire la filtrazione a flusso tangenziale e riempire il serbatoio con il surnatante di coltura mentre il materiale viene rimosso. Interrompere la concentrazione del campione una volta che il volume nel serbatoio raggiunge la quantità più bassa possibile necessaria per mantenere il flusso nella linea di aspirazione senza introdurre bolle d'aria.Chiudere la linea di deflusso con un morsetto. Rimuovere la contropressione sulla linea di retentate. Ricircolare il surnatante concentrato attraverso il filtro per 10 minuti, riducendo la velocità di ricircolo da 20 a 40 millilitri al minuto per massimizzare il recupero.Spostare la linea di ritenzione in un recipiente pulito, rimuovere la linea di aspirazione dal campione e raccogliere il materiale concentrato. Recuperare il materiale rimanente nel serbatoio del campione utilizzando una pipetta. Filtrare il surnatante concentrato attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron.Se necessario, conservare il concentrato finale a quattro gradi Celsius per circa tre settimane prima di passare alla purificazione delle vescicole. Per pellettizzare il campione di coltura concentrato, metterlo in un tubo ultracentrifuga pulito e aggiungere un mezzo pulito o un tampone per garantire che il tubo sia riempito. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante con una pipetta.Lavare nuovamente il materiale pellettato con terreni di coltura freschi o tampone di lavaggio, come 1X soluzione salina tamponata con fosfato e ripetere la centrifugazione. Risospendare il pellet finale in coltura fresca mediante un pipettaggio delicato con una pipetta da un millilitro e trasferirlo in un recipiente pulito. Per eseguire l'ultracentrifugazione del gradiente di densità, preparare le scorte di iodixanolo come descritto nel manoscritto.Mescolare una parte del tampone 4X con tre parti di stock di iodixanolo al 60% per ottenere una soluzione di iodixanolo al 45%. Diluire il 45% di iodixanolo con tampone 1X per creare scorte di mezzi gradienti di 40, 35, 30, 25, 20, 15 e 10% concentrazioni finali di iodixanolo. Quindi, sovrapporre con attenzione quantità uguali di tutti questi stock di gradiente di iodixanolo in un tubo ultracentrifuga, utilizzando l'intero volume del tubo.Dopo la centrifugazione, raccogliere le frazioni di 0,5 millilitri ciascuna per circa un gradiente di 4,5 millilitri mediante pipettaggio accurato o utilizzando un collettore di frazioni. Determinare la densità di ciascuna frazione, in grammi per millilitro, utilizzando una bilancia analitica e una pipetta calibrata. Rimuovere il campione dalla provetta, determinare il peso e restituire il campione alla provetta.Diluire le singole frazioni con tampone pulito in un nuovo tubo seguito da un mezzo pulito o da un lavaggio tampone. Applicare con attenzione cinque microlitri di vescicola e lasciarlo riposare per cinque minuti. Rimuovere il campione toccando il bordo di una griglia su un pezzo di carta da filtro pulita.Pipettare da 20 a 50 microlitri di acetato di uranile al 2% su una superficie piana coperta da film plastico. Quindi posizionare la griglia che galleggia sopra di essa per due minuti. Rimuovere l'acetato di uranile usando carta da filtro e galleggiare brevemente su una goccia di acqua ultrapura per lavare.Riempire la camera con acqua ultrapura usando una siringa pulita e assicurarsi che non ci siano bolle d'aria. Fare clic su start camera' e visualizzare la regione ottimale della camera attorno all'impronta digitale. Fai scorrere i cursori del guadagno dello schermo e del livello della fotocamera verso il massimo, quindi diminuisci al livello più basso per vedere le particelle più deboli.Regolare la messa a fuoco secondo necessità per garantire che le particelle siano approssimativamente ugualmente visibili in tutto il campo visivo e continuare il lavaggio con acqua ultra pulita fino a quando la camera non è pulita. Aggiungere il campione di vescicola alla camera utilizzando una siringa da un millilitro e confermare le impostazioni di acquisizione. Seleziona la misurazione standard dalla casella a discesa SOP e modifica le impostazioni per raccogliere almeno tre repliche tecniche di video di 60 secondi ciascuna.Premere create'and run script' e seguire le istruzioni e spingere circa 100 microlitri di campione nella camera tra le repliche. Determinare i parametri delle particelle facendo clic su analisi 'e apri esperimento' e caricare il file di esempio. Selezionare elabora i file selezionati e attendere il completamento dell'analisi.L'isolamento e la caratterizzazione delle vescicole extracellulari dal cianobatterio Synechocystis sp. PCC6803, ha dimostrato che la membrana esterna contiene carotinoidi, che conferiscono una caratteristica colorazione arancione ai campioni di vescicole raccolti mediante pellettizzazione diretta attraverso ultracentrifugazione. Il pellet di vescicole risospese è stato esaminato al microscopio elettronico a trasmissione o colorando negativamente campioni con acetato di uranile o osservando sezioni ultrasottili.La distribuzione e la concentrazione delle dimensioni delle vescicole sono state valutate utilizzando la diffusione dinamica della luce e le analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Le vescicole purificate di Synechocystis sp. PCC6803 sono state separate su un gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide e colorate per i lipopolisaccaridi.I campioni devono essere prelevati prima e dopo il campione di vescicole concentrato per garantire che la filtrazione a flusso tangenziale funzioni e che le vescicole si concentrino. Quindi è necessario misurare entrambi i campioni utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Sono necessari sforzi futuri per fondere questo metodo con altri approcci come la cromatografia ad esclusione dimensionale o il frazionamento asimmetrico del flusso di campo per migliorare la discriminazione e l'isolamento di piccole particelle da campioni di coltura e ambientali.Questa tecnica è utile per studiare le vescicole di cianobatteri e i ruoli funzionali specifici di queste vescicole nella biologia cianobatterica.

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Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purificazione e analisi di Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Analisi di tracciamento delle nanoparticelle per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni delle vescicole extracellulari

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta di vescicole extracellulari in tre dimensioni

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Isolamento e caratterizzazione del ficobilisoma intatto nei cianobatteri

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolamento di microRNA da colture di ghiandole salivari Tick Ex Vivo e vescicole extracellulari

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...