Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

著者らは、i3S科学プラットフォーム「バイオインターフェースとナノテクノロジー」と、国家インフラポルトガルバイオイメージングプラットフォーム(PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122)のメンバーである「組織学と電子顕微鏡」の支持を認めている。また、TEMの超薄切片染色プロトコルの最適化を支援してくれたJ. A. Gonzalez-Reyes教授(スペイン、コルドバ大学)と、ナノ粒子追跡分析に協力してくれたCecília Durães博士とAna Rita Pinto博士(ポルトガルのポルト大学)にも感謝します。
この研究は、米国国立科学財団(OCE-2049004からSJB)、COMPETE 2020 Operacional Program for Competitiveness and Internationalization(POCI)、ポルトガル、2020年、およびFundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência、Tecnologia e Ensino Superior in the project POCI-01-0145-FEDER-029540(PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO)を通じてポルトガルの資金によって資金提供されました。Fundação para a Ciência e a Tecnologiaは、PhDフェローシップSFRH/BD/130478/2017(SL)およびFCT研究者助成金IF/00256/2015(PO)でも高く評価されています。M.C.M.-M.Horizon 2020フレームワークプログラム(H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891)内のMarie Skłodowska-Curie個人フェローシップ(再統合パネル)の支援を受けました。

著者らは利益相反がないと宣言しています。

細胞外小胞(EV)は球状構造で、直径は約20〜400nmの範囲で、事実上すべての生物によって周囲の環境に放出されます1,2,3。小胞は脂質二重層によって区切られており、それ自体を複製することはできません。グラム陰性菌では、これらの構造は主に外膜からの小さな部分の「ブレビング」によって生じると考えられている。それでも、鞭毛運動、細胞溶解、および内膜および外膜材料の両方の分泌を含む他のプロセスも、小胞を産生することができる4,5。EVは、脂質、可溶性および膜タンパク質、核酸、および代謝産物を含む様々な生体分子を含むことができ、細胞間でこの物質を輸送することができる4、5、6。これらの特徴を考慮して、EVは、細胞通信、バイオフィルム形成、水平遺伝子導入、宿主ファージダイナミクス、および栄養交換を含む幅広い生物学的プロセスにおけるそれらの可能な役割を理解するために研究されている4,6。
シアノバクテリアは、単細胞および糸状生物を含むグラム陰性細菌の大規模で多様なグループである。彼らは、生理学と多様性7,8、それらが果たす重要な生態系機能9,10、バイオテクノロジー11,12の有用性を理解するなど、多くの観点から興味深いものです。シアノバクテリアは、海洋、淡水、陸生環境の自由生活生物として、またはコケ、シダ、植物、または地衣類や海綿類との共生関連のいずれかで、多種多様な生息地で発見されています13。彼らは水生生態系における重要な一次生産者として機能し、酸素光合成9,10を通して酸素と有機炭素を生産し、一部は大気中の窒素も固定することができます7。プロクロロコッカス、シネココッカス、シネコシスチスなどの海洋および淡水のシアノバクテリアは、実験室条件下でEVを生産し14,15,16、シアノバクテリア小胞も自然環境14,17で見つけることができます。シアノバクテリア小胞の生物学的および生態学的機能は不明であるが、この分野におけるさらなる研究は、シアノバクテリアの生理学、分化、コミュニケーション戦略、進化、および栄養相互作用に関する疑問に対する新しい洞察を提供する可能性が高い。さらに、多様なカテゴリーの生体分子を運ぶシアノバクテリアEVの能力は、商業的用途を有する可能性がある18,19。
本プロトコールは、シアノバクテリアの細胞外小胞生物学のより広範な研究を可能にし、奨励するために、シアノバクテリア培養物およびフィールドサンプルから小胞を単離および特徴付けるための方法を記載する。ここで説明するワークフローは、他の細菌からEVを単離および特徴付けるためのプロトコルに類似しているが、シアノバクテリア培養物および野外サンプルは、典型的には、宿主関連または病原性モデル系で一般的に観察されるよりも低い細胞および小胞濃度を含む20,21,22。したがって、シアノバクテリアEVの研究には、培養および小胞単離のための特別な考慮事項および最適化が必要であり、これは株および培地の背景によってさらに異なる。単一のプロトコルがすべての菌株、成長条件、および下流のアプリケーションで同等にうまく機能するわけではないため、研究者が実験上の問題に対処するのに最も適したアプローチを決定できるように、複数のオプションを提供し、関連するトレードオフについて議論します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

シアノバクテリアは、光合成のグラム陰性細菌の多様なグループであり、地球生態系において重要な役割を果たし、不可欠なバイオテクノロジーモデルとして機能します。最近の研究は、海洋と淡水の両方のシアノバクテリアが細胞外小胞 - 微生物の外表面から放出された小さな膜結合構造 - を産生することを実証しました。小胞は多様な生物学的プロセスに寄与する可能性が高いが、シアノバクテリア生物学におけるそれらの特定の機能的役割はほとんど知られていない。この分野における研究を奨励し、前進させるために、シアノバクテリアの細胞外小胞を単離、濃縮、および精製するための詳細なプロトコルが提示される。現在の研究は、プロクロロコッカス 、シネココッカス、およびシネコシスチスの大規模培養物から小胞を単離することに成功した方法論について論じ ている。これらの株からの小胞サンプルを定量および特徴付けるための方法が提示される。水生場サンプルから小胞を単離するためのアプローチも記載されている。最後に、シアノバクテリア小胞の精製で直面する典型的な課題、さまざまな下流用途の方法論的考慮事項、およびアプローチ間のトレードオフについても議論します。

図1は、シアノバクテリア小胞単離プロセスの概要を示し、ここで説明するプロトコルの重要な側面を強調しています。特に注目すべきは、小粒子(vesicle)画分からのシアノバクテリアバイオマスの分離、小胞サンプルの濃縮、および小胞の単離および精製(図1、ステップ2〜4)を詳述するステップであり、これらは、小胞の再現性のある調製物を得るために重要である。図2は、シアノバクテリウム・シネコシスチス・エスピーPCC 6803からの細胞外小胞の単離および特徴付けからの代表的な結果を提示する。このシアノバクテリウムの外膜にはカロテノイド31が含まれていることが示されており、超遠心分離による直接ペレット化によって収集された小胞のサンプルに特徴的なオレンジ色の着色を与えます(図2A)。ベシクルペレットが再懸濁されると、ベシクルは透過型電子顕微鏡(TEM)、サンプルを酢酸ウラニルで陰性染色するか(図2B)、または超薄切片の観察(図2C)によって検査することができます。ベシクルのサイズ分布および濃度は、動的光散乱(DLS)(図2D)およびナノ粒子追跡分析(NTA)(図2E)を用いて評価することができる。記載されたプロトコールを用いて、典型的には、1.0のOD730でシネコシスティス・エスピーPCC6803の指数関数的に増殖する培養物において、mL当たり典型的には〜3.5±1.0 x 108個のナノ粒子が得られた。単離されたEVの生化学的分析は、単離された小胞の物理的特性評価を補完するために実施することができる。一例として、精製されたSynechocystis sp. PCC 6803小胞をSDS−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、リポ多糖類(LPS;図2F)。LPSは外膜32に特異的であるため、LPS検出は、膜結合小胞の存在を検証し、同じ株33からの調製物間の相対小胞含量を分析するためのマーカーとして役立つ。低分子量LPS対高分子量LPSの相対存在量の検査は、試料34、35間の小胞組成の変化を示すことができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> 図1:シアノバクテリアのEV単離および特性評価に使用した実験手順。 増殖培養物(1)および増殖培地からのシアノバクテリアバイオマスの分離(2)の概略図。小胞を含む無細胞サンプルを濃縮し(3)、EVを単離精製します(4)。用途に応じて、ベシクル調製物は、透過型電子顕微鏡(TEM)、ナノ粒子追跡分析(NTA)、動的光散乱(DLS)、およびリポ多糖(LPS)プロファイリングの1つまたは組み合わせを用いて特徴付けることができる(5)。RT, 室温. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> 図2:シアノバクテリウム・シネコシスチス・エスピーPCC 6803についての細胞外小胞単離および特性評価の代表的な結果。 (a)600 mL Synechocystis sp. PCC 6803培養物から濃縮無細胞細胞外培地を超遠心した後に得られた細胞外小胞ペレット(EVsペレット)をOD730に増殖させた1.0-1.5の写真。外膜に見られるカロテノイドに由来する小胞ペレットの典型的なオレンジ色の着色に留意されたい。(B,C)Synechocystis sp. PCC 6803小胞サンプルの負染色された(B)および超薄切片(C)の透過型電子顕微鏡(TEM)写真。スケールバー:それぞれ200nmおよび50nm。試料を80kVで操作した透過型電子顕微鏡で可視化した。(d)ベシクル直径(nm単位)の関数としてのベシクル体積の分布を描写する典型的な動的光散乱(DLS)プロット。色付きの線は、同じサンプルの3つのテクニカルレプリケート測定からのデータを示します。(e)シネコシスチス細胞外小胞のサイズ分布(nm単位)の代表的なナノ粒子追跡分析(NTA)データ。黒い線は3つの技術反復の平均を示し、赤い線は平均の標準誤差を表します。(f)リポ多糖(LPS)プロファイルは、16%(w/v)SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって小胞調製物を分離し、市販のLPS染色キットで染色した後に検出された。粗いLPS形態および平滑LPS形態に対応する低分子および高分子LPSは、それぞれ検出可能である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:rを計算する方程式。指数関数的増殖中の2点間(典型的には時間経過の始まりと終わり)の間の世代当たりの細胞当たりに産生される小胞の数は、この式を用いて決定される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

本プロトコールは、シアノバクテリア培養物からの細胞外小胞の単離、濃縮、および特性評価に関する詳細な説明を提供する。異なるスケールの培養物から小胞を精製するためのアプローチ、方法論間のトレードオフ、およびフィールドサンプルを扱うための考慮事項についても議論する。

シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

このプロトコルは、異なるスケールで培養物から小胞を精製するためのアプローチ、トレードオフ、方法論の違い、およびフィールドサンプルを扱うための考慮事項を示すだけでなく、重要である。シアノバクテリアは、ユニークな小胞サンプリングと分析の課題を提示します。これらの技術は、培養物および環境サンプルから小胞を単離および濃縮することに成功している。500ミリリットル未満のサンプルを濃縮するには、15〜20ミリリットルの限外ろ過遠心濃縮器をタイプ1超純水ですすぐことから始めます。濃縮器を遠心分離機に装填し、摂氏4度で4,400 x gで回転させます。実行を破棄し、この手順を少なくとも 2 回繰り返します。上澄みサンプルを水すすぎ濃縮器にロードし、同じ条件でスピンする。サンプルが15〜30ミリリットルの最終容量まで濃縮されるまで、この手順を繰り返します。500ミリリットル以上の体積を濃縮するには、原稿に記載した装置を設置して接線流ろ過を行う。ペリスタルティックポンプを吸気ラインに取り付け、保持ラインに調整可能なクランプを置きます。原稿に記載されているように接線流ろ過を消毒し、1リットルのタイプ1超純水で装置を洗い流します。0.2ミクロン未満の濾液をサンプルリザーバに加える。保持液ラインのポンプ速度と背圧レベルをゆっくりと上げて、濾液ラインからの出力を増やします。引き続き接線流ろ過を実行し、材料が除去されたら培養上清をリザーバに補充します。リザーバ内の体積が気泡を導入せずに吸気ラインへの流れを維持するために必要な最小量に達したら、サンプルの濃縮を停止します。流出ラインをクランプで閉じます。保持液ラインの背圧を取り除きます。濃縮された上清をフィルターを通して10分間再循環させ、再循環速度を毎分20ミリリットルから40ミリリットルに減少させて回収率を最大化します。保持液ラインを清潔な容器に移動し、サンプルから吸気ラインを取り外し、濃縮材料を回収する。ピペットを使用してサンプルリザーバに残っている材料を回収します。濃縮された上清を0.2ミクロンのシリンジフィルターでろ過します。必要に応じて、最終濃縮物を摂氏4度で約3週間保存してから、小胞精製に移行します。濃縮培養サンプルをペレット化するには、それをきれいな超遠心チューブに入れ、クリーンな培地またはバッファーを追加してチューブが満たされていることを確認します。遠心分離後、上清をピペットで取り除く。ペレット状の材料を新鮮な培養培地または1Xリン酸緩衝生理食塩水などの洗浄緩衝液で再洗浄し、遠心分離を繰り返す。1ミリリットルのピペットで穏やかにピペッティングすることによって、最終ペレットを新鮮な培養物に再懸濁し、それをきれいな容器に移す。密度勾配超遠心分離を行うには、原稿に記載されているようにヨウジキサノールストックを調製する。4X緩衝液の1部を60%ヨージキサノールストックの3部と混合して、45%ヨウジキサノール溶液を作る。45%イオジキサノールを1Xバッファーで希釈して、40、35、30、25、20、15および10%の最終イオジキサノール濃度のグラジエント培地のストックを作成します。次いで、これら全てのイオジキサノール勾配ストックの等量を超遠心管に注意深く重ね合わせ、管全体の容積を利用する。遠心分離後、慎重にピペッティングするか、フラクションコレクターを使用して、それぞれ0.5ミリリットルの画分を約4.5ミリリットルの勾配で収集します。各フラクションの密度を、ミリリットルあたりのグラム数で、分析天秤および較正ピペットを使用して決定する。チューブからサンプルを取り出し、重量を決定し、サンプルをチューブに戻します。個々の画分を新しいチューブ内のクリーンなバッファーで希釈し、その後、クリーンな培地またはバッファー洗浄を行います。5マイクロリットルの小胞を慎重に塗布し、5分間放置する。グリッドの端をきれいなろ紙に触れてサンプルを取り出します。20~50マイクロリットルの酢酸ウラニルをプラスチックフィルムで覆われた平らな面にピペットで取り出します。次に、その上に浮かぶグリッドを2分間置きます。ろ紙を使って酢酸ウラニルを取り除き、超純水一滴に短時間浮かべて洗浄します。清潔なシリンジを使用してチャンバーを超純水で満たし、気泡がないことを確認します。スタートカメラをクリックし、拇印の周りのチャンバーの最適な領域を視覚化します。画面ゲインとカメラレベルのスライダを最大に向かってスライドさせ、次に最も低いレベルまで下げて、最も暗いパーティクルを表示します。必要に応じてフォーカスを調整して、粒子が視野全体でほぼ均等に見えるようにし、チャンバーがきれいになるまで超きれいな水で洗浄を続けます。1ミリリットルのシリンジを用いて小胞サンプルをチャンバーに加え、取得設定を確認する。[SOP]ドロップダウンボックスから[標準測定]を選択し、設定を変更して、それぞれ60秒のビデオの少なくとも3つの技術複製を収集します。「作成」を押してスクリプトを実行し、プロンプトに従って、複製の間に約 100 マイクロリットルのサンプルをチャンバーに押し込みます。「分析」をクリックして粒子パラメータを決定し、実験を開き、サンプルファイルをロードします。選択したファイルを処理」を選択し、分析が完了するのを待ちます。シアノバクテリウム・シネコシスチス属PCC6803からの細胞外小胞の単離および特性評価は、外膜がカロチノイドを含み、超遠心による直接ペレット化によって収集された小胞サンプルに特徴的なオレンジ色の着色を与えることを示した。再懸濁された小胞ペレットを、サンプルを酢酸ウラニルで陰性染色するか、または超薄切片を観察することによって、透過型電子顕微鏡によって検査した。ベシクルのサイズ分布および濃度は、動的光散乱およびナノ粒子追跡分析を用いて評価した。精製されたSynechocystis sp. PCC6803小胞をドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル上で分離し、リポ多糖について染色した。サンプルは、接線流ろ過が機能し、ベシクルが濃縮されていることを確認するために、濃縮ベシクルサンプルの前後に採取する必要があります。次に、ナノ粒子追跡分析を使用して両方のサンプルを測定する必要があります。この方法をサイズ排除クロマトグラフィーや不斉フィールドフロー分画などの他のアプローチと融合させ、培養サンプルや環境サンプルからの小粒子の識別と単離を改善するための将来の努力が必要です。この技術は、シアノバクテリアの小胞と、シアノバクテリアの生物学におけるこれらの小胞の特定の機能的役割を研究するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

モデルシアノバクテリア種のマークとマーカーレス変異体の生成

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

マウスの主な腎尿細管上皮細胞の分離と性質、高スループットの細胞フラックスの解析

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

細胞外小胞体のカエノールハブディティス・エレガンスの精製と分析

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

細胞外小胞の定量とサイズ決定のためのナノ粒子追跡解析

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

ダニ Ex Vivo 唾液腺培養物および細胞外小胞からのマイクロRNAの単離

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...