Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner støtten fra i3S Scientific Platforms "Biointerfaces and Nanotechnology", og "Histology and Electron Microscopy", et medlem av den nasjonale infrastrukturen portugisisk plattform for bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Vi takker også prof. J. A. Gonzalez-Reyes (University of Córdoba, Spania) for å bidra til å optimalisere den ultratynne seksjonsfargingsprotokollen for TEM, og Dr. Cecília Durães og Dr. Ana Rita Pinto (Universitetet i Porto, Portugal) for nanopartikkelsporingsanalysen.
Dette arbeidet ble finansiert av US National Science Foundation (OCE-2049004 til SJB), av Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) midler gjennom COMPETE 2020 Operacional Program for Competitiveness and Internationalization (POCI), Portugal, 2020, og av portugisiske midler gjennom Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior innenfor rammen av prosjektet POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 til PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia er også sterkt anerkjent for stipendiatskapet SFRH/BD/130478/2017 (SL) og FCT Investigator grant IF/00256/2015 (PO). M.C.M.-M. ble støttet av et Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (Reintegration panel) innenfor Horizon 2020 Framework Programme (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Generelle hensyn Protokollen (figur 1) presenteres som et sett med alternativer for å markere at det ikke finnes noen "one-size-fits-all"-metode for å arbeide med cyanobakterielle ekstracellulære vesikler. Interesserte forskere kan bruke delene av denne protokollen som er kompatible og passende for deres spesielle modellorganisme, eksperimentelle spørsmål / mål og utstyrstilgjengelighet. Alle vesicle isolasjon tilnærminger innebærer avveininger og vil uunngåelig resultere i en viss grad av skjevhet. Mens man bør søke å minimere dette når det er mulig, er det viktigste hensynet å sikre at den detaljerte metodikken som brukes, rapporteres i henhold til passende MISEV (Minimal informasjon for studier av ekstracellulære Vesicles) retningslinjer36.
Kulturvekst Cyanobakterielle kulturer kan lett fås fra en av de mange kultursamlingene som er tilgjengelige over hele verden. Noen få eksempler er Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, Frankrike), Pasteur Culture Collection (Institute Pasteur, Paris, France) og Provasoli-Guillard National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA, Maine, USA). Den cyanobakterielle valgstammen må dyrkes under passende middels og miljømessige forhold, varierende betydelig blant forskjellige stammer. En liste over ofte brukte medier for cyanobakteriell dyrking finner du på kultursamlingsnettsteder eller andre publikasjoner 37,38,39.
Å jobbe med cyanobakterielle ekstracellulære vesicles gir noen unike utfordringer sammenlignet med metodene som rapporteres for mange typiske modelllaboratorium heterotrofer. Cyanobakterielle kulturer har vesikkelkonsentrasjoner av størrelsesordener lavere enn de som finnes i andre mikrober som Escherichia coli 14,16,40. Disse forskjellene, antagelig som følge av lavere celletettheter og/eller vesicle-produksjonsrater, betyr at relativt store kulturer (~1-20 L eller mer) kan være nødvendig for å gi tilstrekkelig materiale til bulkanalyser. Dermed oppfordres forskere til å teste vesicle utbytter fra mindre kulturer for å bestemme hvor mye materiale som vil være nødvendig for å oppnå sine ønskede sluttmål. Viktigheten av å fastslå om mediene som brukes til eksperimentet har en påviselig svevestøvbakgrunn, må også understrekes før du begynner et eksperiment, da dette materialet potensielt kan forvirre vesiclepopulasjonskvartifisering, redusere følsomheten til vesicle konsentrasjon / størrelsesmålinger, eller forurense de endelige vesiclepreparatene.
En annen utfordring for feltet er at ikke alle cyanobakterier vokser godt, eller i det hele tatt, i ren kultur. Inntil gjengitt aksenisk, tolkninger av fysiske vesicle egenskaper, produksjon priser, eller innhold kan ikke nødvendigvis føre til klare konklusjoner om vesikler produsert av noen belastning i samfunnet. Forskere anbefales også å vurdere hvilke andre typer partikler som kan være til stede og potensielt forveksles med vesikler av spesifikke nanopartikkelanalyseverktøy, som ikke nødvendigvis kan diskriminere mellom forskjellige partikkeltyper. For eksempel kan det være viktig å verifisere at belastningen som brukes mangler en prophage, enten via genomsekvensering, induksjonsanalyser eller på andre måter eller ikke frigjør andre typer partikler. Etter vår erfaring er de fleste cyanobakterielle vesiklene <0,2 μm i diameter, men når man ser på en ny stamme eller veksttilstand, bør man bekrefte om bruk av et 0,45 μm porestørrelsesfilter endrer størrelsesfordelingen av rensede partikler.
Mange aspekter av kulturforhold kan påvirke vesicle produksjon og innholdet41,42. Dermed må de fysiske og kjemiske forholdene som brukes til kulturvekst (inkludert lysbestråling, temperatur og mediesammensetning) dokumenteres og kontrolleres i den grad det er mulig for å sikre reproduserbarhet av resultater. Enhver kjemisk analyse av vesicleinnhold må ta hensyn til bakgrunnssammensetning, spesielt ved gjennomføring av "-omics" stil høygjennomstrømningsanalyser. Dette kan være spesielt kritisk når du bruker udefinerte medier, for eksempel de som er basert på en naturlig sjøvannsbakgrunn eller supplert med gjærekstrakt eller trypton. Å bruke et definert vekstmedium kan være å foretrekke avhengig av de eksperimentelle målene.
Forskere må nøye overvåke kulturvekstdynamikken med jevne mellomrom for å sikre at de vet hvor i vekstfasen en gitt batchkultur er, og ikke bare samle prøver etter en vilkårlig tid. Vesicle-sammensetningen kan variere på tvers av vekstfaser, spesielt mellom eksponentielle og stasjonære faser41,42. For eksempel kan minst en brøkdel av vesikler som er samplet i den stasjonære fasen oppstå fra en annen cellulær mekanisme, for eksempel cellelys, som ikke vil oppstå under eksponentiell vekst. Selv om dette fortsatt kan være av stor biologisk interesse, er det viktig å kjenne prøven. Hvis en cyanobakteriell kultur når ønsket vekstfase på et tidspunkt da det ikke er mulig å fortsette direkte til prøvekonsentrasjon, separere cellene fra <0,2 μm brøkdel umiddelbart (med sentrifugering og / eller direkte 0,2 μm filtrering), og deretter lagre den cellefrie filtratet ved 4 °C anbefales. Materialet kan lagres på denne måten i dager med liten eller ingen merkbar innvirkning på konsentrasjonen eller størrelsesfordelingen av vesikler.
Vesicle rensinger Det hyppige behovet for å isolere vesikler fra betydelige volumkulturer er avgjørende i den cyanobakterielle vesicleisolasjonsarbeidsflyten. Når du arbeider med større mengder materiale, må vesiklene konsentreres før nedstrøms separasjonsarbeidsflyter. Konsentratorer (tangentielle strømningsfiltermembraner eller sentrifugalkolonner) med en nominell molekylvektgrense på 100 kDa anbefales vanligvis, da de tillater separasjon fra løselig materiale med lav molekylvekt samtidig som konsentrasjonstiden holdes rimelig, men 30 kDa-filtre brukes også ofte med suksess. Mens flere ikke-ultracentrifugation-baserte metoder for rensing av vesikler (f.eks. størrelseseksklusjonskromatografi, mikrofluidbaserte systemer, affinitetsfangstteknikker og nedbørsbaserte tilnærminger) blir populære i det ekstracellulære vesicle-feltet, etter vår erfaring, kan disse tilnærmingene resultere i reduserte utbytter og er vanligvis uforenlige med kulturvolumene som trengs.
Forskere må vurdere sammensetningen av jodxanolbakgrunnen og vaske-/resuspensionbufferne som brukes under vesicle rensing for å sikre at de er kompatible med de ønskede nedstrømsapplikasjonene. I mange tilfeller kan den endelige vesicle-prøven brukes på nytt i vekstmedier eller en definert buffer som kan sammenlignes i sammensetning med vekstmediet (f.eks. naturlig vs. kunstig sjøvann). Dette kan imidlertid ikke være mulig med marine cyanobakterielle vesikler, noe som vil kreve ytterligere eksperimentell manipulering for analyse, da høye saltkonsentrasjoner som ligner sjøvannsnivåer kan hemme mange enzymatiske reaksjoner. I slike tilfeller fungerer standard laboratoriebuffere som 0,2 μm filtrert, 1x PBS vanligvis bra for å opprettholde stabiliteten til marine cyanobakterielle vesicles og kan være mer kompatible med nedstrøms eksperimentelle prosesser.
Tetthet gradient rensing kan betraktes som valgfritt avhengig av eksperimentelle mål og kultursammensetning, men anbefales sterkt for å produsere en mer strengt ren og reproduserbar prøve. EV-populasjoner er heterogene og finnes på tvers av en rekke oppdriftstettheter, som ytterligere varierer etter belastning, vekstforhold og andre faktorer 4,5,6. Tetthetene som er oppført ovenfor representerer de som vanligvis finnes for vesikler fra cyanobakterielle kulturer og feltprøver i jodoksanol, men resultatene i andre stammer kan variere. Andre tetthetsgradientmaterialer som sukrose og CsCl kan brukes til vesikler, men de vil migrere til forskjellige oppdriftstettheter i disse bakgrunnene. Ulike gradient media bakgrunner kan bias utvinning av lipid-lukkede virus43 og kan potensielt påvirke utvinning av vesicles fra ulike stammer.
Vesicle kan gå tapt på flere punkter gjennom vesicle isolasjon, og gradient rensing prosessen beskrevet her, redusere utbyttet og øke mengden startmateriale som trengs for å oppnå en gitt endelig vesicle utbytte for nedstrøms applikasjoner. Spesiell forsiktighet bør utvises ved arbeid med vesicle pellets etter ultracentrifugation. Mens noen cyanobakterielle vesikler kan ha karotenoider eller andre forbindelser som kan gi vesikkelprøver en viss mengde pigmentering (figur 2), avhengig av belastningen eller mengden materiale, forventes det ikke nødvendigvis å kunne visualisere vesiles pellet direkte. Vær oppmerksom på hvor pellets forventes å bli gitt typen sentrifugerotor som brukes. Når det er mulig, foreslås rensede vesicleprøver å bli undersøkt av elektronmikroskopi for å verifisere sammensetningen av det endelige materialet som er gjenvunnet.
Virkningen av lagringsforholdene på vesicles og innholdet forblir et åpent spørsmål. Selv om det er funnet at lagringen ikke har en bemerkelsesverdig effekt på cyanobakteriell vesicle størrelse eller konsentrasjon14, kan funksjonaliteten til isolerte vesiclepreparater endres over tid44. Mens fryse-/tinesykluser bør unngås når det er mulig, synes effekten av å fryse prøver på generelle vesicle-tall og størrelser å være minimal. Man bør være klar over potensialet for fryse-tine sykluser for å påvirke sammensetningen av vesicle innhold, for eksempel lengden på vesicle-assosierte nukleinsyrer eller stabiliteten av proteiner.
Vesicles fra field samples Dagens metoder for å isolere ekstracellulære vesikler fra naturlige vannmiljøer er konseptuelt og operasjonelt lik de som er beskrevet her for store volumkulturer. Likevel kan de kreve enda større mengder materiale. Slike feltprøver kan innebære innsamling, filtrering og konsentrasjon av hundrevis til tusenvis av liter vann for å oppnå tilstrekkelig materiale til analyse. Avhengig av turbiditeten til prøven som brukes, kan det være nødvendig med inkorporering av ett eller flere forfiltreringstrinn før 0,2 μm-filteret. Den spesifikke TFF-enheten som brukes, bør være egnet for arbeid med så store volumer på rimelig tid (ideelt sett i timerekkefølgen) og uten å legge for mye press på prøven. I praksis innebærer dette ofte å bruke et mye større totalt overflateareal enn det som kan brukes på kulturbaserte prøver, samt rør med større diameter for å lette økte strømningshastigheter. Dette økte filteroverflatearealet vil sannsynligvis føre til en marginal økning i partikkeltap sammenlignet med mindre TFF-ordninger og et større sluttvolum av konsentrat; Disse bekymringene må imidlertid balanseres med hensyn til total saksbehandlingstid. For situasjoner som et utvidet oseanografisk cruise der prøver ikke vil komme tilbake til et laboratorium i mange dager etter prøvetaking, anbefaler vi å utføre innledende filtrerings- og TFF-trinn på 0,2 μm i feltet. Dette mindre volumet av konsentrert materiale kan deretter lagres ved 4 °C eller -80 °C om bord (avhengig av tilgjengelighet og nedstrøms analytiske hensyn) til det returneres til laboratoriet for endelig behandling.
Isolasjon og separasjon av ekstracellulære vesikler fra andre små partikler, både organiske og uorganiske, kan være utfordrende, og metoder for å skille forskjellige partikler er ennå ikke perfekte. For eksempel kan jodxanol tetthet gradienter ikke lett skille alle klasser av vesicles og virus tilstede i en gitt prøve. Ettersom typer forvirrende partikler, og deres fysiske egenskaper, vil variere mellom prøvetakingssteder, er det for tiden umulig å gi en protokoll som robust vil partisjonere alle klasser av små akvatiske partikler. Prøving og feiling er avgjørende, og eksperimentering med jodloksanolområdet som brukes i gradient- og ultracentrifugationforholdene, vil være nødvendig for å maksimere separasjonen; En samling mindre volum, mer fint løst tetthet brøker kan også være nødvendig. Avhengig av konteksten kan bruk av CsCl-graderinger i stedet for jodloksanol bidra til å skille miljøpartikler45. Likevel kan endringen i osmotiske forhold føre til skjevheter i de endelige gjenvunne produktene, som diskutert ovenfor.
Vesicle karakterisering Nanopartikkelanalyseinstrumenter er ennå ikke rutinemessig tilgjengelige i mikrobiologiske laboratorieinnstillinger, men blir stadig mer tilgjengelige. Alle metoder har fordeler og ulemper, og vi gjør ingen spesifikk godkjenning av en plattform som bedre enn alle andre for cyanobakterielt vesiclearbeid; Faktisk har alle spesielle avveininger angående kostnader, oppløsning, brukervennlighet, deteksjonsgrenser, kompatibilitet med forskjellige vekstmedier / bufferbakgrunner og datareroduserbarhet. I tillegg til instrumenter basert på nanopartikkelsporingsanalyse beskrevet ovenfor, kan andre tilnærminger, inkludert nanostrømcytometri, mikrofluid resistiv pulssensor og justerbar resistiv pulsmåling, brukes46,47. Brukere bør være forsiktige med å lære detaljene i deres tilgjengelige instrumentering og verifisere at det fungerer bra med systemet deres, da vi har opplevd vanskeligheter når de bruker noen plattformer med sjøvannsbaserte medier. Vi oppfordrer feltet til å bevege seg mot kvantitativ karakterisering av vesicle størrelse, konsentrasjoner og produksjonsratene. Måling av vesiclekonsentrasjoner på en grunnleggende partikkel per ml-basis, og ikke når det gjelder proteininnhold eller andre beregninger, vil tillate integrering av vesikler i mer kvantitative rammer og muliggjøre intercomparisons mellom stammer og forhold. Videre innsats for å forbedre evnen til å kalibrere konsentrasjonsmålinger for < 100nm partikler er nødvendig.
Det faktum at vesicle produksjonshastighetsmålinger gjøres direkte fra 0,2 μm filtrert kultur supernatant for å minimere partikkeltap, vil være forbundet med andre rensetrinn beskrevet ovenfor. Dette betyr imidlertid at tilnærmingen ikke nødvendigvis diskriminerer mellom faktiske ekstracellulære vesikler og andre små partikler som finnes i kulturene. Bare telling av partikler innenfor bestemte størrelsesområder (f.eks. 50-250 nm diameter) kan bidra til å utelukke noen outliers, men visuell bekreftelse på at pelleted <0.2 μm kulturinnhold synes å være membranbundne vesikler (ved TEM eller andre tilnærminger) er nødvendig for å kunne spesifikt hevde at man måler produksjonen av vesikler i motsetning til produksjon av vesicle-lignende partikler.
En viktig faktor i vesicle karakterisering er å sikre at vesicle prøven blir analysert i riktig lineær følsomhetsområde av nanopartikkel analyse enhet. Når en prøve er for konsentrert, er det enkelt å fortynne det materialet med en ren buffer og analysere det på nytt. På den annen side kan den relativt lave celle- og/eller vesicletettheten til noen cyanobakterielle kulturer noen ganger gi vesiclepreparater som er under noen instrumenters deteksjonsgrenser. I tilfeller der dette skjer med bulk vesicle rensing, kan man vurdere å vokse større volumkulturer, re-pelleting og resuspending det endelige materialet i et mindre volum, eller vurdere om det er et skritt i isolasjonsprosessen der overdreven tap oppstår og kan reduseres. Ved måling av vesicle produksjonshastigheter er rettelsene ikke nødvendigvis så enkle. Prøver kan konsentreres om nødvendig, men den første bør se om justeringer i mediet kan føre til høyere celletetthet eller om tilstrekkelig konsentrerte prøver kan oppnås fra senere tidspunkter i eksponentiell fase der konsentrasjonene vil være høyere.
Begrensninger Som med alle protokoller har vesicleisolasjon ved hjelp av disse tilnærmingene klare begrensninger. Disse tilnærmingene er ikke avhengige av deres garanti for at en helt ren forberedelse av vesicles vil bli isolert. Både kulturer og feltprøver kan inneholde andre materialer, som migrerer på samme måte som vesikler i tetthetsgradienter. Likevel er disse typer ekstra rensemetoder i det minste avgjørende for å sikre strenghet og reproduserbarhet av vesicleanalyse. Mens vi beskriver vesicle isolasjon tilnærminger i sammenheng med cyanobakterier, kulturer av mange andre mikrober vil også inneholde vesikler ved relativt lave konsentrasjoner, og prosedyrene beskrevet her bør være generelt anvendelige. Det forventes at disse metodene ikke vil fungere som en permanent protokoll, men i stedet som et utgangspunkt for å anspore fremtidige fremskritt i arbeidet med ekstracellulære vesicles fra forskjellige mikrober. Fremtidig innsats er nødvendig for å fusjonere disse metodene med andre tilnærminger som størrelseseksklusjonskolonner eller asymmetrisk feltflytfraksjonering for å forbedre diskriminering og separasjon av ulike kategorier av små partikler fra kulturer og miljøprøver. Vi håper også at disse teknikkene kan fortsette å utvikle seg sammen med forbedringer i nanopartikkelkarakteriseringsteknologier for å forbedre evnen til å undersøke heterogenitet innen vesiclepopulasjoner, deres innhold og deres eksakte funksjonelle roller i miljøet.

Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er sfæriske strukturer, som varierer mellom ~ 20-400 nm i diameter, utgitt av nesten alle organismer i deres omkringliggende miljø 1,2,3. Vesicles er avgrenset av en lipid bilayer og kan ikke gjenskape seg selv. I Gram-negative bakterier antas disse strukturene først og fremst å oppstå ved å "blebbe" av små porsjoner fra den ytre membranen. Likevel kan andre prosesser, inkludert flagellarbevegelse, cellelys og sekresjon av både indre og ytre membranmateriale, produsere vesicles samt 4,5. Elbiler kan inneholde ulike biomolekyler, inkludert lipider, løselige og membranproteiner, nukleinsyrer og metabolitter, og kan transportere dette materialet mellom cellene 4,5,6. Gitt disse funksjonene studeres elbiler for å forstå deres mulige roller i et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert cellulær kommunikasjon, biofilmdannelse, horisontal genoverføring, vertsfasingsdynamikk og næringsutveksling 4,6.
Cyanobakterier er en stor og mangfoldig gruppe Gram-negative bakterier, inkludert encellede og filamentøse organismer. De er av interesse fra mange perspektiver, inkludert å forstå deres fysiologi og mangfold 7,8, de kritiske økosystemfunksjonene de betjener 9,10, og deres nytte for bioteknologi11,12. Cyanobakterier finnes i et bredt spekter av habitater, enten som frittlevende organismer i marine, ferskvann og terrestriske miljøer, eller i symbiotiske assosiasjoner med moser, bregner, planter eller i lav og svamper13. De fungerer som avgjørende primærprodusenter i akvatiske økosystemer, produserer oksygen og organisk karbon gjennom oksygenisk fotosyntese 9,10, og noen er i stand til å fikse atmosfærisk nitrogen også7. Marine og ferskvann cyanobakterier, inkludert Prochlorococcus, Synechococcus og Synechocystis, produserer elbiler under laboratorieforhold 14,15,16, og cyanobakterielle vesikler finnes også i naturlige miljøer 14,17. De biologiske og økologiske funksjonene til cyanobakterielle vesikler er ukjente, men videre forskning på dette området vil sannsynligvis gi ny innsikt i spørsmål om cyanobakteriell fysiologi, differensiering, kommunikasjonsstrategier, evolusjon og trofiske interaksjoner. I tillegg kan cyanobakterielle elbilers evne til å bære ulike kategorier av biomolekyler ha kommersielle applikasjoner18,19.
Den nåværende protokollen beskriver metoder for å isolere og karakterisere vesikler fra cyanobakterielle kulturer og feltprøver for å muliggjøre og oppmuntre til en bredere undersøkelse av cyanobakteriell ekstracellulær vesiclebiologi. Mens arbeidsflyten beskrevet her er analog med protokoller for isolering og karakterisering av elbiler fra andre bakterier, inneholder cyanobakterielle kulturer og feltprøver vanligvis lavere celle- og vesiclekonsentrasjoner enn det som ofte observeres med vertsrelaterte eller patogene modellsystemer 20,21,22. Studier av cyanobakterielle elbiler krever derfor spesielle hensyn og optimaliseringer for dyrking og vesicleisolasjon, som varierer videre mellom stammer og mediebakgrunn. Siden ingen enkeltprotokoll vil fungere like bra for alle stammer, vekstforhold og nedstrømsapplikasjoner, tilbyr vi flere alternativer og diskuterer avveiningene som er involvert, slik at forskerne kan bestemme tilnærmingene som passer best for å løse deres eksperimentelle spørsmål.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

Cyanobakterier er en mangfoldig gruppe fotosyntetiske, Gram-negative bakterier som spiller kritiske roller i globale økosystemer og fungerer som essensielle bioteknologiske modeller. Nyere arbeid har vist at både marine og ferskvann cyanobakterier produserer ekstracellulære vesikler - små membranbundne strukturer frigjort fra mikroberens ytre overflate. Mens vesikler sannsynligvis bidrar til ulike biologiske prosesser, forblir deres spesifikke funksjonelle roller i cyanobakteriell biologi stort sett ukjente. For å oppmuntre til og fremme forskning på dette området, presenteres en detaljert protokoll for å isolere, konsentrere og rense cyanobakterielle ekstracellulære vesikler. Det nåværende arbeidet diskuterer metoder som med hell har isolert vesicles fra store kulturer av Prochlorococcus, Synechococcus og Synechocystis. Metoder for kvantifisering og karakterisering av vesicleprøver fra disse stammene presenteres. Tilnærminger for isolering av vesicles fra akvatiske feltprøver er også beskrevet. Til slutt diskuteres også typiske utfordringer med cyanobakteriell vesiclerensing, metodologiske hensyn for ulike nedstrømsapplikasjoner, og avveiningene mellom tilnærminger.

Figur 1 presenterer en oversikt over den cyanobakterielle vesicleisolasjonsprosessen, og fremhever viktige aspekter ved protokollen som er beskrevet her. Spesielt oppmerksom er trinnene som beskriver separasjon av cyanobakteriell biomasse fra den lille partikkelfraksjonen (vesicle), som konsentrerer vesicleprøven og vesicleisolasjon og rensing (figur 1, trinn 2 til 4), som er avgjørende for å oppnå reproduserbare preparater av vesikler. Figur 2 presenterer representative resultater fra isolering og karakterisering av ekstracellulære vesikler fra cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803. Den ytre membranen i denne cyanobakterien har vist seg å inneholde karotenoider31, som gir en karakteristisk oransje farge til vesikles prøver samlet inn ved direkte pelleting gjennom ultracentrifugation (figur 2A). Når vesiclepellet er resuspendert, kan vesikler undersøkes ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM), enten ved å fargeprøver med uranylacetat negativt (figur 2B) eller ved observasjon av ultratynne seksjoner (figur 2C). Vesicle størrelsesfordeling og konsentrasjon kan vurderes ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS) (figur 2D) og nanopartikkelsporingsanalyser (NTA) (figur 2E). Med den beskrevne protokollen ble vanligvis ~ 3,5 ± 1,0 x 108 nanopartikler per ml oppnådd i en eksponentielt voksende kultur av Synechocystis sp. PCC 6803 ved en OD730 av 1,0. Biokjemiske analyser av isolerte elbiler kan utføres for å utfylle den fysiske karakteriseringen av de isolerte vesikler. Som et eksempel ble rensede Synechocystis sp. PCC 6803 vesicles skilt på en SDS-polyakrylamidgel og farget for lipopolysakkarider (LPS; Figur 2F). Siden LPS er spesifikke for den ytre membranen32, kan LPS-deteksjon validere tilstedeværelsen av membranbundne vesikler og tjene som en markør for å analysere relativt vesicleinnhold mellom preparater fra samme stamme33. Inspeksjon av den relative overfloden av lav vs. høy molekylvekt LPS kan indikere endringer i vesiclesammensetning mellom prøver 34,35.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> Figur 1: Eksperimentelle prosedyrer som brukes for cyanobakteriell EV-isolasjon og karakterisering. Skjematiske representasjoner av voksende kulturer (1) og separasjon av cyanobakteriell biomasse fra vekstmediet (2). Cellefrie prøver som inneholder vesikler er konsentrert (3), og deretter isoleres og renses elbilene (4). Avhengig av bruksområdet kan vesiclepreparater karakteriseres ved hjelp av en eller en kombinasjon av transmisjonselektronmikroskopi (TEM), nanopartikkelsporingsanalyse (NTA), dynamisk lysspredning (DLS) og lipopolysakkarid (LPS) profilering (5). RT, romtemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> Figur 2: Representative resultater av den ekstracellulære vesicleisolasjonen og karakteriseringen for cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Fotografi av den ekstracellulære vesicle pellet (EVs pellet) oppnådd etter ultracentrifugation av konsentrert cellefri ekstracellulær medium fra en 600 ml Synechocystis sp. PCC 6803 kultur vokst til en OD730 av 1,0-1,5. Legg merke til den typiske oransje fargen på vesicle pellet avledet fra karotenoidene som finnes i den ytre membranen. (B,C) Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) fotografier av negativt fargede (B) og ultratynne seksjoner (C) av Synechocystis sp. PCC 6803 vesicle prøver. Vektstenger: henholdsvis 200 nm og 50 nm. Prøver ble visualisert på et transmisjonselektronmikroskop operert ved 80 kV. (D) Typisk DLS-plott (Dynamic Light Scattering) som viser fordelingen av vesiclevolum som en funksjon av vesicle diameter (i nm). Fargede linjer angir data fra tre tekniske replikeringsmålinger av samme prøve. (E) Representative nanopartikkelsporingsanalysedata (NTA) av Synechocystis ekstracellulær vesicle størrelsesfordeling (i nm). Den svarte linjen angir gjennomsnittet av tre tekniske replikeringer, og de røde linjene representerer standardfeilen for gjennomsnittet. (F) Lipopolysakkarider (LPS)-profil ble påvist etter å ha separert vesiclepreparatet ved elektroforese på en 16% (w / v) SDS-polyakrylamidgel og farging med et kommersielt LPS-fargesett. Lav- og høymolekylær LPS, tilsvarende henholdsvis grov- og glatt-LPS-former, kan påvises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggsfil 1: Formel for å beregne r. Antall vesikler produsert per celle per generasjon mellom to punkter under eksponentiell vekst (vanligvis begynnelsen og slutten av tidsforløpet) bestemmes ved hjelp av denne ligningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Den nåværende protokollen gir detaljerte beskrivelser for isolasjon, konsentrasjon og karakterisering av ekstracellulære vesikler fra cyanobakterielle kulturer. Tilnærminger for rensing av vesikler fra kulturer i ulike skalaer, avveininger blant metoder og hensyn til arbeid med feltprøver diskuteres også.

Isolasjon og karakterisering av cyanobakterielle ekstracellulære vesikler

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Denne protokollen er viktig, da den ikke bare demonstrerer tilnærminger for rensing av vesikler fra kultur i forskjellige skalaer, avveininger, forskjeller mellom metoder og også vurdering for å jobbe med feltprøver. Cyanobakterier byr på unike vesicle-prøvetakings- og analyseutfordringer. Disse teknikkene har vellykket isolert og konsentrert vesicles fra kultur og fra miljøprøver.For å konsentrere prøver på mindre enn 500 milliliter, start med å skylle 15 til 20 milliliter ultrafiltrering sentrifugalkonsentratorer med type 1 ultrarent vann. Legg konsentratorene inn i sentrifugen og spinn ved 4400 x g ved fire grader Celsius. Kast løpet gjennom og gjenta trinnet minst to ganger.Legg den supernatante prøven i en vannskylt konsentrator og spinn under de samme forholdene. Gjenta dette trinnet til prøven er konsentrert til et endelig volum på 15 til 30 milliliter. For å konsentrere et volum på mer enn 500 milliliter, utfør tangentiell strømningsfiltrering ved å sette opp apparatet som beskrevet i manuskriptet.Fest en peristaltisk pumpe til inntakslinjen og plasser justerbare klemmer på retentate-linjen. Desinfiser tangentielle strømningsfiltrering som beskrevet i manuskriptet, og skyll deretter enheten med en liter type 1 ultrarent vann. Tilsett mindre enn 0,2 mikron filtrat i prøvereservoaret.Øk pumpehastigheten og ryggtrykknivået sakte på retentatlinjen for å øke produksjonen fra filtratlinjene. Fortsett å kjøre tangentiell strømningsfiltrering og fyll reservoaret med kultur supernatant når materialet fjernes. Slutt å konsentrere prøven når volumet i reservoaret når lavest mulig mengde som trengs for å opprettholde strømmen inn i inntakslinjen uten å introdusere luftbobler.Lukk utløpslinjen med en klemme. Fjern baktrykket på retentate-linjen. Resirkuler den konsentrerte supernatanten gjennom filteret i 10 minutter, og reduser resirkuleringshastigheten fra 20 til 40 milliliter per minutt for å maksimere utvinningen.Flytt retentate-linjen inn i et rent kar, fjern inntakslinjen fra prøven og samle det konsentrerte materialet. Utvinn eventuelt gjenværende materiale i prøvereservoaret ved hjelp av en pipette. Filtrer det konsentrerte supernatantet gjennom et 0,2 mikron sprøytefilter.Om nødvendig, lagre det endelige konsentratet ved fire grader Celsius i omtrent tre uker før du går over til vesicle rensing. For å pellet den konsentrerte kulturprøven plasser den i et rent ultrasenterrør og legg til rene medier eller buffer for å sikre at røret er fylt. Etter sentrifugering, fjern supernatanten med en pipette.Gjenvask det pelleterte materialet med ferske kulturmedier eller vaskebuffer, for eksempel 1X fosfatbufret saltvann og gjenta sentrifugeringen. Resuspend den endelige pellet i frisk kultur ved skånsom pipettering med en milliliter pipette og overføre den til et rent kar. For å utføre tetthet gradient ultracentrifugation, forberede jodloksanol aksjer som beskrevet i manuskriptet.Bland en del av 4X bufferen med tre deler av 60% iodixanol lager for å lage en 45% jodisololøsning. Fortynn 45% iodixanol med 1X buffer for å skape lagre av gradientmedier på 40, 35, 30, 25, 20, 15 og 10% endelige iodiksanolkonsentrasjoner. Deretter legger du forsiktig over like store mengder av alle disse jodisolgradientene i et ultracentrifuge-rør, ved hjelp av hele rørvolumet.Etter sentrifugering samler du fraksjonene på 0,5 milliliter hver for omtrent en 4,5 milliliter gradient ved forsiktig pipettering eller ved hjelp av en fraksjonssamler. Bestem tettheten av hver brøkdel, i gram per milliliter, ved hjelp av en analytisk balanse og kalibrert pipette. Fjern prøven fra røret, bestem vekten og returner prøven til røret.Fortynn individuelle fraksjoner med ren buffer i et nytt rør etterfulgt av et rent medium eller buffervask. Påfør forsiktig fem mikroliter vesicle og la den sitte i fem minutter. Fjern prøven ved å berøre kanten av et rutenett til et stykke rent filterpapir.Pipette ut 20 til 50 mikroliter av 2% uranylacetat på en flat overflate dekket av plastfilm. Plasser deretter rutenettet flytende på toppen av det i to minutter. Fjern uranylacetat ved hjelp av filterpapir og flyt kort på en dråpe ultrapure vann for å vaske.Fyll kammeret med ultrarent vann med en ren sprøyte og sørg for at det ikke blir luftbobler. Klikk på startkameraet'og visualiser det optimale området av kammeret rundt avtrykket. Skyv skjermforsterkningen og kameranivåets glidebrytere mot maksimum, og reduser deretter til det laveste nivået for å se de dimmeste partiklene.Juster fokuset etter behov for å sikre at partiklene er omtrent like synlige på tvers av synsfeltet og fortsett å vaske med ultra rent vann til kammeret er rent. Tilsett vesicle-prøven i kammeret ved hjelp av en en milliliter sprøyte og bekreft oppkjøpsinnstillingene. Velg standardmåling fra ROP-rullegardinlisten, og endre innstillingene for å samle inn minst tre tekniske replikeringer av 60 sekunders videoer hver.Trykk på create'and run script'og følg instruksjonene og skyv omtrent 100 mikrolitere av prøven inn i kammeret mellom replikeringer. Bestem partikkelparametrene ved å klikke på analyse'og åpne eksperimentet'og last inn eksempelfilen. Velg behandle valgte filer' og vent til analysen er fullført.Isolasjonen og karakteriseringen av ekstracellulære vesikler fra cyanobakterien Synechocystis sp. PCC6803 viste at den ytre membranen inneholder karotinoider, som gir en karakteristisk oransje fargelegging til vesicleprøver samlet inn ved direkte pelletering gjennom ultracentrifugation. Den resuspenderte vesicle pellet ble undersøkt ved transmisjonselektronmikroskopi enten ved å fargeprøver med uranylacetat negativt eller ved å observere ultratynne seksjoner.Vesicle størrelsesfordeling og konsentrasjon ble vurdert ved hjelp av dynamisk lysspredning og nanopartikkelsporingsanalyser. Rensede Synechocystis sp. PCC6803 vesicles ble separert på en natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel og farget for lipopolysakkarider.Prøver bør tas før og etter den konsentrerte vesicle-prøven for å sikre at tangentiell strømningsfiltrering fungerer og vesikler blir konsentrert. Deretter må du måle begge prøvene ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalysen. Fremtidig innsats er nødvendig for å fusjonere denne metoden med andre tilnærminger som størrelsesekskluderingskromatografi eller asymmetrisk feltflytfraksjonering for å forbedre diskriminering og isolering av små partikler fra kultur- og miljøprøver.Denne teknikken er nyttig for å studere cyanobakteriene vesikler og de spesifikke funksjonelle rollene til disse vesikler i cyanobakteriell biologi.

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker for analyse av Ekstracellulær Blemmer ved hjelp av flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Generering av merkede og Markerless Mutanter i Modell cyanobacterial Arter

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolering og karakterisering høy gjennomstrømning ekstracellulære Flux analyse av musen primære nyre rørformede epitelceller

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow Cytometric analyse av ekstracellulære blemmer fra celle-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensing og analyse av Caenorhabditis elegans Ekstracellulære vesikler

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikkelsporingsanalyse for kvantifisering og størrelsesbestemmelse av ekstracellulære vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Direkte stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi av ekstracellulære vesicles i tre dimensjoner

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolasjon og rensing av ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Isolasjon og karakterisering av intakt fykobilisom i cyanobakterier

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolering av mikroRNA fra Tick Ex Vivo spyttkjertelkulturer og ekstracellulære vesikler

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...