Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
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Os autores reconhecem o apoio das plataformas científicas i3S "Biointerfaces e Nanotecnologia", e "Histologia e Microscopia Eletrônica", membro da Plataforma Nacional de Bioimagem (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Agradecemos também ao Prof. J. A. Gonzalez-Reyes (Universidade de Córdoba, Espanha) por ajudar a otimizar o protocolo de coloração de seção ultrafina para o TEM, e a Dra.
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciência dos EUA (OCE-2049004 para a SJB), por fundos do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) através do Programa Operacional compete 2020 para competitividade e internacionalização (POCI), Portugal, 2020, e por recursos portugueses através da Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior no âmbito do projeto POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 para PO). A Fundação para a Ciência e a Tecnologia também é muito reconhecida pela bolsa de doutorado SFRH/BD/130478/2017 (SL) e pela FCT Investigador grant IF/00256/2015 (PO). M.C.M.M. foi apoiado por uma Bolsa Individual Marie Skłodowska-Curie (painel de reintegração) dentro do Horizon 2020 Framework Program (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Vesículas extracelulares (EVs) são estruturas esféricas, variando entre ~20-400 nm de diâmetro, liberadas por praticamente todos os organismos em seu ambiente circundante 1,2,3. Vesículas são delimitadas por um bicamado lipída e não podem se replicar. Em bactérias gram-negativas, acredita-se que essas estruturas surgem principalmente por "blebbing" de pequenas porções da membrana externa. Ainda assim, outros processos, incluindo movimento flagelar, lise celular e secreção de material de membrana interna e externa, podem produzir vesículas, bem como 4,5. Os EVs podem conter várias biomoléculas, incluindo lipídios, proteínas solúveis e membranas, ácidos nucleicos e metabólitos, e podem transportar esse material entre as células 4,5,6. Diante dessas características, os EVs estão sendo estudados para entender seus possíveis papéis em uma ampla gama de processos biológicos, incluindo comunicação celular, formação de biofilmes, transferência horizontal de genes, dinâmica de host-phage e troca de nutrientes 4,6.
As cianobactérias são um grande e diversificado grupo de bactérias Gram-negativas, incluindo organismos unicelulares e filamentosos. Eles são de interesse de muitas perspectivas, incluindo a compreensão de sua fisiologia e diversidade 7,8, as funções críticas do ecossistema que eles atendem 9,10, e sua utilidade para a biotecnologia 11,12. As cianobactérias são encontradas em uma grande variedade de habitats, seja como organismos livres em ambientes marinhos, de água doce e terrestre, ou em associações simbióticas com musgos, samambaias, plantas ou em líquens e esponjas13. Eles servem como produtores primários cruciais em ecossistemas aquáticos, produzindo oxigênio e carbono orgânico através da fotossínteseoxigena 9,10, e alguns são capazes de fixar nitrogênio atmosférico também 7. Cianobactérias marinhas e de água doce, incluindo Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis, produzem EVs em condições laboratoriais 14,15,16, e vesículas cianobacterianas também podem ser encontradas em ambientes naturais 14,17. As funções biológicas e ecológicas das vesículas cianobacterianas são desconhecidas, mas novas pesquisas nessa área provavelmente fornecerão novas percepções sobre questões sobre fisiologia cianobacteriana, diferenciação, estratégias de comunicação, evolução e interações tróficas. Além disso, a capacidade dos EVs cianobacterianos de transportar diversas categorias de biomoléculas pode ter aplicações comerciais18,19.
O presente protocolo descreve métodos para isolar e caracterizar vesículas de culturas cianobacterianas e amostras de campo para permitir e incentivar um exame mais amplo da biologia vesícula extracelular cianobacteriana. Embora o fluxo de trabalho descrito aqui seja análogo a protocolos de isolação e caracterização de EVs de outras bactérias, culturas cianobacterianas e amostras de campo normalmente contêm concentrações de células e vesículas mais baixas do que são comumente observadas com sistemas de modelos associados ao hospedeiro oupatogênicos 20,21,22. Assim, estudos de EVs cianobacterianos exigem considerações e otimizações especiais para cultivo e isolamento vesícula, que variam ainda mais entre cepas e origens midiáticas. Como nenhum protocolo único funcionará igualmente bem para todas as cepas, condições de crescimento e aplicações a jusante, fornecemos múltiplas opções e discutimos as compensações envolvidas para que os pesquisadores possam determinar as abordagens mais apropriadas para abordar suas questões experimentais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

As cianobactérias são um grupo diversificado de bactérias fotossintéticas gram-negativas que desempenham papéis críticos nos ecossistemas globais e servem como modelos essenciais de biotecnologia. Trabalhos recentes demonstraram que tanto as cianobactérias marinhas quanto as de água doce produzem vesículas extracelulares - pequenas estruturas ligadas à membrana liberadas da superfície externa dos micróbios. Embora as vesículas provavelmente contribuam para diversos processos biológicos, seus papéis funcionais específicos na biologia cianobacteriana permanecem amplamente desconhecidos. Para incentivar e avançar a pesquisa nesta área, é apresentado um protocolo detalhado para isolar, concentrar e purificar vesículas extracelulares cianobacterianas. O trabalho atual discute metodologias que isolaram com sucesso vesículas de grandes culturas de Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis. São apresentados métodos para quantificar e caracterizar amostras de vesículas dessas cepas. Abordagens para isolar vesículas de amostras de campo aquático também são descritas. Finalmente, desafios típicos encontrados com a purificação da vesícula cianobacteriana, considerações metodológicas para diferentes aplicações a jusante e as trocas entre abordagens também são discutidas.

A Figura 1 apresenta uma visão geral do processo de isolamento da vesícula cianobacteriana, destacando aspectos-chave do protocolo descrito aqui. Destacam-se os passos que detalham a separação da biomassa cianobacteriana da pequena fração de partículas (vesícula), concentrando a amostra de vesícula e o isolamento e purificação de vesículas (Figura 1, passos 2 a 4), que são fundamentais para a obtenção de preparações reprodutíveis de vesículas. A Figura 2 apresenta resultados representativos do isolamento e caracterização de vesículas extracelulares do cianobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. A membrana externa deste cianobacterium tem sido mostrada para conter carotenoides31, que conferem uma coloração laranja característica às amostras de vesículas coletadas por pelotização direta através da ultracentrifugação (Figura 2A). Uma vez que a pelota vesícula é resuspendida, as vesículas podem ser examinadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), seja por coloração negativa de amostras com acetato de uranyl (Figura 2B) ou pela observação de seções ultrafinas (Figura 2C). A distribuição e concentração do tamanho da vesícula podem ser avaliadas usando análises dinâmicas de dispersão de luz (DLS) (Figura 2D) e análises de rastreamento de nanopartículas (NTA) (Figura 2E). Com o protocolo descrito, tipicamente ~3,5 ± 1,0 x 108 nanopartículas por mL foram obtidas em uma cultura exponencialmente crescente de Synechocystis sp. PCC 6803 em um OD730 de 1,0. Análises bioquímicas de EVs isolados podem ser realizadas para complementar a caracterização física das vesículas isoladas. Como exemplo, as vesículas Synechocystis sp. PCC 6803 foram separadas em um gel de poliacrilamida SDS e manchadas para lipopólise (LPS; Figura 2F). Como os LPS são específicos para a membrana externa32, a detecção de LPS pode validar a presença de vesículas ligadas à membrana e servir como um marcador para analisar o conteúdo relativo de vesícula entre as preparações da mesma cepa33. A inspeção da abundância relativa de LPS de baixo versus alto peso molecular pode indicar alterações na composição da vesícula entre as amostras34,35.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> Figura 1: Procedimentos experimentais utilizados para isolamento e caracterização do EV cianobacteriano. Representações esquemáticas de culturas crescentes (1) e separação da biomassa cianobacteriana do meio de crescimento (2). Amostras livres de células contendo vesículas estão concentradas (3), e então os EVs são isolados e purificados (4). Dependendo da aplicação, as preparações vesículas podem ser caracterizadas usando uma ou uma combinação de microscopia eletrônica de transmissão (TEM), análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), dispersão dinâmica de luz (DLS) e perfil de lipopolysaccharide (LPS) (5). RT, temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos do isolamento e caracterização da vesícula extracelular para o cianobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Fotografia da pelota vesícula extracelular (EVs pellet) obtida após a ultracentrifugação do meio extracelular concentrado livre de células a partir de uma cultura de 600 mL Synechocystis sp. PCC 6803 cresceu para um OD730 de 1,0-1,5. Note a coloração laranja típica da pelota vesícula derivada dos carotenoides encontrados na membrana externa. (B,C) Fotografias de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de seções de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de seções de vesículas manchadas negativamente (B) e ultrafina (C) de Synechocystis sp. PCC 6803 amostras de vesículas. Barras de escala: 200 nm e 50 nm, respectivamente. As amostras foram visualizadas em um microscópio eletrônico de transmissão operado a 80 kV. (D) Trama típica de dispersão de luz dinâmica (DLS) representando a distribuição do volume vesícula em função do diâmetro da vesícula (em nm). Linhas coloridas indicam dados de três medidas técnicas de replicação da mesma amostra. (E) Análise de rastreamento de nanopartículas representativas (NTA) da distribuição do tamanho da vesícula extracelular Synechocystis (em nm). A linha preta indica a média de três réplicas técnicas, e as linhas vermelhas representam o erro padrão da média. (F) O perfil lipopolisacarídeo (LPS) foi detectado após separar a preparação da vesícula por eletroforese em um gel de poliacrilamida SDS-poliacrilamida de 16% (w/v) e coloração com um kit comercial de coloração LPS. LPS de baixo e alto peso molecular, correspondentes a formas de LPS ásperos e suaves, respectivamente, são detectáveis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo suplementar 1: Equação para calcular r. O número de vesículas produzidas por célula por geração entre dois pontos durante o crescimento exponencial (tipicamente o início e o fim do curso do tempo) é determinado usando esta equação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>

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Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para isolamento, concentração e caracterização de vesículas extracelulares de culturas cianobacterianas. Abordagens para purificar vesículas de culturas em diferentes escalas, trocas entre metodologias e considerações para o trabalho com amostras de campo também são discutidas.

Isolamento e Caracterização de Vesículas Extracelulares Cianobacterianas

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Este protocolo é significativo, pois não apenas demonstra abordagens para purificar vesículas da cultura em diferentes escalas, trocas, diferenças entre metodologias e também consideração por trabalhar com amostras de campo. A cianobactéria apresenta desafios únicos de amostragem e análise de vesículas. Essas técnicas têm isolado e concentrado com sucesso vesículas da cultura e de amostras ambientais.Para concentrar amostras de menos de 500 mililitros, comece enxaguando os concentradores centrífugas de ultrafiltração de 15 a 20 mililitros com água ultrapurugal tipo 1. Carregue os concentradores na centrífuga e gire a 4.400 x g a quatro graus Celsius. Descarte a corrida e repita o passo pelo menos duas vezes.Carregue a amostra de sobrenante em um concentrador enxaguado com água e gire sob as mesmas condições. Repita esta etapa até que a amostra esteja concentrada em um volume final de 15 a 30 mililitros. Para concentrar um volume de mais de 500 mililitros, realize a filtragem de fluxo tangencial, configurando o aparelho conforme descrito no manuscrito.Conecte uma bomba peristáltica à linha de entrada e coloque grampos ajustáveis na linha de retentate. Higienize a filtragem de fluxo tangencial conforme descrito no manuscrito, em seguida, lave o dispositivo com um litro de água de grau ultrapure tipo 1. Adicione menos de 0,2 mícron no reservatório de amostras.Aumente lentamente a velocidade da bomba e os níveis de pressão nas costas na linha retentate para aumentar a saída das linhas filtradas. Continue a executar a filtragem de fluxo tangencial e reabastecer o reservatório com a cultura supernante à medida que o material é removido. Pare de concentrar a amostra assim que o volume no reservatório atingir a menor quantidade possível para manter o fluxo na linha de admissão sem introduzir bolhas de ar.Feche a linha de saída com um grampo. Remova a pressão traseira na linha de retentate. Recircular o supernanato concentrado através do filtro por 10 minutos, reduzindo a taxa de recirculação de 20 para 40 mililitros por minuto para maximizar a recuperação.Mova a linha de retentate para um vaso limpo, remova a linha de admissão da amostra e colete o material concentrado. Recupere qualquer material restante no reservatório de amostras usando uma pipeta. Filtre o supernante concentrado através de um filtro de seringa de 0,2 mícingo.Se necessário, armazene o concentrado final a quatro graus Celsius por aproximadamente três semanas antes de passar para a purificação vesícula. Para pelotar a amostra de cultura concentrada coloque-a em um tubo de ultracentrifuuagem limpo e adicione mídia limpa ou tampão para garantir que o tubo esteja cheio. Após a centrifugação, remova o sobrenatante com uma pipeta.Redesenhe o material pelleted com mídia de cultura fresca ou tampão de lavagem, como salina tamponada com fosfato 1X e repita a centrifugação. Resuspend a última pelota em cultura fresca por pipetação suave com uma pipeta de um mililitro e transferi-la para um vaso limpo. Para realizar a ultracentrifugação de gradiente de densidade, prepare os estoques de iodixanol como descrito no manuscrito.Misture uma parte do buffer 4X com três partes de estoque de 60% iodixanol para fazer uma solução de 45% de iodixanol. Diluir 45% iodixanol com buffer 1X para criar estoques de mídia gradiente de 40, 35, 30, 25, 20, 15 e 10% de concentrações iodixanol finais. Em seguida, sobreponha cuidadosamente quantidades iguais de todos esses estoques de gradiente iodixanol em um tubo ultracentrífuga, utilizando todo o volume do tubo.Após a centrifugação, colete as frações de 0,5 mililitros cada para aproximadamente um gradiente de 4,5 mililitros, tubondo cuidadosamente ou usando um coletor de frações. Determine a densidade de cada fração, em gramas por mililitro, utilizando um equilíbrio analítico e pipeta calibrada. Retire a amostra do tubo, determine o peso e devolva a amostra ao tubo.Diluir frações individuais com tampão limpo em um novo tubo seguido de uma mídia limpa ou lavagem de buffer. Aplique cuidadosamente cinco microliters de vesícula e deixe descansar por cinco minutos. Remova a amostra tocando a borda de uma grade em um pedaço de papel filtro limpo.Pipeta de 20 a 50 microlitres de acetato de 2% de urânyl em uma superfície plana coberta por filme plástico. Em seguida, coloque a grade flutuando em cima dela por dois minutos. Remova o acetato deuranyl usando papel filtro e flutue brevemente em uma gota de água ultrauso para lavar.Encha a câmara com água ultrauso usando uma seringa limpa e garanta que não haja bolhas de ar. Clique na câmera inicial e visualize a região ideal da câmara ao redor da impressão digital. Deslize os controles deslizantes do nível de captura e do nível da câmera para o máximo, em seguida, diminua para o nível mais baixo para ver as partículas mais fracas.Ajuste o foco conforme necessário para garantir que as partículas sejam aproximadamente igualmente visíveis em todo o campo de visão e continue a lavar com água ultra limpa até que a câmara esteja limpa. Adicione a amostra de vesícula à câmara usando uma seringa de um mililitro e confirme as configurações de aquisição. Selecione a medição padrão da caixa de soltar SOP e altere as configurações para coletar pelo menos três réplicas técnicas de vídeos de 60 segundos cada.Pressione criar e executar script' e siga as instruções e empurre aproximadamente 100 microliters de amostra para dentro da câmara entre as réplicas. Determine os parâmetros de partículas clicando em análise e experimento aberto e carregue o arquivo amostral. Selecione arquivos selecionados no processo e aguarde que a análise seja concluída.O isolamento e caracterização de vesículas extracelulares do cianobacterium Synechocystis sp. PCC6803, mostrou que a membrana externa contém carotinóides, que conferem uma coloração laranja característica às amostras de vesícula coletadas por pelotização direta através da ultracentrifugação. A pelota vesícula resuspended foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão, seja por manchas negativas de amostras com acetato de uranyl ou pela observação de seções ultrafinas.A distribuição e concentração do tamanho da vesícula foram avaliadas por meio de análises dinâmicas de dispersão de luz e rastreamento de nanopartículas. As vesículas Synechocystis sp. PCC6803 foram separadas em um gel de sulfato-poliacrilamida de sódio e manchadas para lipopólise.As amostras devem ser colhidas antes e depois da amostra concentrada de vesícula para garantir que a filtragem de fluxo tangencial esteja funcionando e as vesículas estejam se concentrando. Então você precisa medir ambas as amostras usando a análise de rastreamento de nanopartículas. Esforços futuros são necessários para fundir esse método com outras abordagens, como a cromatografia de exclusão de tamanho ou fracionamento assimétrico de fluxo de campo para melhorar a discriminação e o isolamento de pequenas partículas da cultura e amostras ambientais.Esta técnica é útil para estudar as vesículas das cianobactérias e os papéis funcionais específicos dessas vesículas na biologia cianobacteriana.

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