Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Авторы признают поддержку научных платформ i3S «Биоинтерфейсы и нанотехнологии» и «Гистология и электронная микроскопия», входящих в национальную инфраструктуру Португальской платформы биовизуализации (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Мы также благодарим профессора Х. А. Гонсалеса-Рейеса (Университет Кордовы, Испания) за помощь в оптимизации протокола окрашивания ультратонких участков для TEM, а также доктора Сесилию Дюрайш и доктора Ану Риту Пинту (Университет Порту, Португалия) за анализ отслеживания наночастиц.
Эта работа финансировалась Национальным научным фондом США (OCE-2049004 для SJB), фондами Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) через Оперную программу конкурентоспособности и интернационализации COMPETE 2020 (POCI), Португалия, 2020 год, и португальскими фондами через Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior в рамках проекта POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia также широко признан за стипендию PhD SFRH / BD / 130478 / 2017 (SL) и грант FCT Investigator IF / 00256 / 2015 (PO). М.К.М.-М. была поддержана Индивидуальной стипендией Марии Склодовской-Кюри (группа по реинтеграции) в рамках Рамочной программы Horizon 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой сферические структуры диаметром ~20-400 нм, высвобождаемые практически всеми организмами в окружающуюих среду 1,2,3. Везикулы ограничены липидным бислоем и не могут воспроизводить себя. У грамотрицательных бактерий считается, что эти структуры в первую очередь возникают в результате «блеббинга» небольших порций от внешней мембраны. Тем не менее, другие процессы, включая жгутиковое движение, лизис клеток и секрецию как внутреннего, так и наружного мембранного материала, могут производить везикулы, а также 4,5. EV могут содержать различные биомолекулы, включая липиды, растворимые и мембранные белки, нуклеиновые кислоты и метаболиты, и могут транспортировать этот материал между клетками 4,5,6. Учитывая эти особенности, электромобили изучаются, чтобы понять их возможную роль в широком спектре биологических процессов, включая клеточную связь, образование биопленки, горизонтальный перенос генов, динамику фаг-хозяин и обмен питательными веществами 4,6.
Цианобактерии представляют собой большую и разнообразную группу грамотрицательных бактерий, включая одноклеточные и нитевидные организмы. Они представляют интерес со многих точек зрения, включая понимание их физиологии и разнообразия 7,8, критических функций экосистем, которые они выполняют 9,10, и их полезности для биотехнологии11,12. Цианобактерии встречаются в самых разных местах обитания, либо в виде свободноживущих организмов в морской, пресноводной и наземной средах, либо в симбиотических ассоциациях со мхами, папоротниками, растениями или в лишайниках и губках13. Они служат важнейшими первичными производителями в водных экосистемах, производя кислород и органический углерод посредством кислородного фотосинтеза 9,10, а некоторые способны также фиксировать атмосферный азот7. Морские и пресноводные цианобактерии, включая Prochlorococcus, Synechococcus и Synechocystis, производят EV в лабораторных условиях 14,15,16, а цианобактериальные везикулы также можно найти в естественной среде14,17. Биологические и экологические функции цианобактериальных везикул неизвестны, но дальнейшие исследования в этой области, вероятно, дадут новое понимание вопросов физиологии цианобактерий, дифференциации, коммуникационных стратегий, эволюции и трофических взаимодействий. Кроме того, способность цианобактериальных EV переносить различные категории биомолекул может иметь коммерческое применение 18,19.
Настоящий протокол описывает методы выделения и характеристики везикул из цианобактериальных культур и полевых образцов для обеспечения и поощрения более широкого изучения биологии цианобактериальных внеклеточных пузырьков. В то время как описанный здесь рабочий процесс аналогичен протоколам выделения и характеристики EV от других бактерий, цианобактериальные культуры и полевые образцы обычно содержат более низкие концентрации клеток и пузырьков, чем обычно наблюдаются с системами, связанными с хозяином или патогенными модельными системами 20,21,22. Таким образом, исследования цианобактериальных EV требуют особых соображений и оптимизации для культивирования и выделения пузырьков, которые дополнительно варьируются между штаммами и фонами сред. Поскольку ни один протокол не будет одинаково хорошо работать для всех штаммов, условий роста и последующих приложений, мы предоставляем несколько вариантов и обсуждаем компромиссы, чтобы исследователи могли определить подходы, наиболее подходящие для решения их экспериментальных вопросов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

Цианобактерии представляют собой разнообразную группу фотосинтетических грамотрицательных бактерий, которые играют решающую роль в глобальных экосистемах и служат важными биотехнологическими моделями. Недавняя работа продемонстрировала, что как морские, так и пресноводные цианобактерии продуцируют внеклеточные везикулы — небольшие мембранно-связанные структуры, высвобождаемые с внешней поверхности микробов. Хотя везикулы, вероятно, способствуют различным биологическим процессам, их специфическая функциональная роль в цианобактериальной биологии остается в значительной степени неизвестной. Для поощрения и продвижения исследований в этой области представлен подробный протокол для выделения, концентрации и очистки цианобактериальных внеклеточных везикул. В текущей работе обсуждаются методологии, которые успешно изолировали везикулы из крупных культур Prochlorococcus, Synechococcus и Synechocystis. Представлены методы количественной оценки и характеристики образцов везикул из этих штаммов. Описаны также подходы к выделению везикул из образцов водного поля. Наконец, обсуждаются типичные проблемы, возникающие при очистке цианобактериальных пузырьков, методологические соображения для различных последующих применений и компромиссы между подходами.

На рисунке 1 представлен обзор процесса выделения цианобактериальных пузырьков с выделением ключевых аспектов протокола, описанного здесь. Особо следует отметить этапы, детализирующие отделение биомассы цианобактерий от фракции мелких частиц (везикул), концентрацию образца везикул и выделение и очистку везикул (фиг.1, этапы 2-4), которые имеют решающее значение для получения воспроизводимых препаратов везикул. На рисунке 2 представлены репрезентативные результаты выделения и характеристики внеклеточных везикул из цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Было показано, что внешняя мембрана этой цианобактерии содержит каротиноиды31, которые придают характерную оранжевую окраску образцам везикул, собранным путем прямого гранулирования посредством ультрацентрифугирования (рисунок 2A). После того, как гранула везикулы повторно суспендирована, везикулы могут быть исследованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ), либо путем отрицательного окрашивания образцов уранилацетатом (рисунок 2B), либо путем наблюдения ультратонких срезов (рисунок 2C). Распределение и концентрация везикул по размерам могут быть оценены с использованием динамического рассеяния света (DLS) (рисунок 2D) и анализа отслеживания наночастиц (NTA) (рисунок 2E). С помощью описанного протокола обычно ~3,5 ± 1,0 х 108 наночастиц на мл были получены в экспоненциально растущей культуре Synechocystis sp. PCC 6803 при OD730 1,0. Биохимический анализ изолированных EV может быть проведен для дополнения физической характеристики изолированных везикул. В качестве примера, очищенные везикулы Synechocystis sp. PCC 6803 были отделены на SDS-полиакриламидном геле и окрашены для липополисахаридов (LPS; Рисунок 2F). Поскольку ЛПС специфичны для наружной мембраны32, обнаружение ЛПС может подтвердить наличие связанных с мембраной везикул и служить маркером для анализа относительного содержания пузырьков между препаратами из того же штамма33. Проверка относительного содержания низкомолекулярных ИНС с высокой молекулярной массой может указывать на изменения состава везикул между образцами34,35.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> Рисунок 1: Экспериментальные процедуры, используемые для выделения и характеристики цианобактериальных EV. Схематические изображения растущих культур (1) и отделение биомассы цианобактерий от питательной среды (2). Бесклеточные образцы, содержащие везикулы, концентрируют (3), а затем EV выделяют и очищают (4). В зависимости от применения, препараты везикул могут быть охарактеризованы с использованием одной или комбинации просвечивающей электронной микроскопии (TEM), анализа отслеживания наночастиц (NTA), динамического рассеяния света (DLS) и профилирования липополисахарида (LPS) (5). RT, комнатная температура. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативные результаты выделения и характеристики внеклеточного пузырька для цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Фотография внеклеточной пузырьковой гранулы (гранулы EV), полученной после ультрацентрифугирования концентрированной бесклеточной внеклеточной среды из культуры Synechocystis sp. PCC 6803 объемом 600 мл, выращенной до OD730 1,0-1,5. Обратите внимание на типичную оранжевую окраску пузырьковой гранулы, полученной из каротиноидов, обнаруженных во внешней мембране. (В,С) Просвечивающая электронная микроскопия (TEM) фотографии отрицательно окрашенных (B) и ультратонких срезов (C) образцов везикул Synechocystis sp. PCC 6803. Шкала баров: 200 нм и 50 нм соответственно. Образцы визуализировали на просвечивающем электронном микроскопе, работающем на 80 кВ. (D) График типичного динамического рассеяния света (DLS), изображающий распределение объема везикул в зависимости от диаметра везикул (в нм). Цветные линии обозначают данные трех технических реплицированных измерений одного и того же образца. (E) Репрезентативный анализ отслеживания наночастиц (NTA) данных о распределении по размерам внеклеточных везикул Synechocystis (в нм). Черная линия указывает среднее значение трех технических реплик, а красные линии представляют стандартную ошибку среднего значения. (F) Профиль липополисахаридов (ЛПС) был обнаружен после отделения препарата пузырчатых пузырек электрофорезом на 16% (мас./об.) SDS-полиакриламидном геле и окрашивания коммерческим комплектом окрашивания LPS. Низко- и высокомолекулярные ЛПС, соответствующие грубым и гладко-ЛПС формам, соответственно, поддаются обнаружению. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный файл 1: Уравнение для вычисления r. Количество везикул, образующихся на клетку за поколение между двумя точками во время экспоненциального роста (обычно в начале и конце временного хода), определяется с помощью этого уравнения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Настоящий протокол содержит подробные описания выделения, концентрации и характеристики внеклеточных везикул из культур цианобактерий. Также обсуждаются подходы к очистке везикул от культур в различных масштабах, компромиссы между методологиями и соображения по работе с полевыми образцами.

Выделение и характеристика цианобактериальных внеклеточных везикул

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Этот протокол важен, поскольку он не только демонстрирует подходы к очистке везикул от культуры в различных масштабах, компромиссы, различия между методологиями, а также рассмотрение работы с полевыми образцами. Цианобактерии представляют собой уникальные проблемы для отбора проб и анализа пузырьков. Эти методы успешно изолировали и концентрировали везикулы из культуры и из образцов окружающей среды.Чтобы сконцентрировать образцы объемом менее 500 миллилитров, начните с промывки 15-20-миллилитров ультрафильтрационных центробежных концентраторов сверхчистой водой типа 1. Загрузите концентраторы в центрифугу и вращайте при 4 400 х г при четырех градусах Цельсия. Отбросьте прогон и повторите шаг по крайней мере дважды.Загрузите образец супернатанта в концентратор, промытый водой, и вращайте его в тех же условиях. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока образец не будет сконцентрирован до конечного объема от 15 до 30 миллилитров. Чтобы сконцентрировать объем более 500 миллилитров, выполните тангенциальную фильтрацию потока, настроив аппарат, как описано в рукописи.Прикрепите перистальтический насос к впускной линии и установите регулируемые зажимы на ретентационную линию. Продезинфицируйте тангенциальную фильтрацию потока, как описано в рукописи, затем промыть устройство одним литром сверхчистой воды типа 1. Добавьте в резервуар для проб менее 0,2 микрона фильтрата.Медленно увеличивайте скорость насоса и уровни противодавления на ретентатной линии, чтобы увеличить производительность фильтратных линий. Продолжайте проводить тангенциальную фильтрацию потока и заполняйте резервуар питательным наполнителем по мере удаления материала. Прекратите концентрацию образца, как только объем в резервуаре достигнет минимально возможного количества, необходимого для поддержания потока в линию забора без введения пузырьков воздуха.Закройте линию оттока зажимом. Снимите противодавление на ретентативную линию. Рециркулируйте концентрированный супернатант через фильтр в течение 10 минут, уменьшая скорость рециркуляции с 20 до 40 миллилитров в минуту для максимального восстановления.Переместите ретентатную линию в чистый сосуд, извлеките всасывающую линию из образца и соберите концентрированный материал. Извлеките любой оставшийся материал в резервуаре для образцов с помощью пипетки. Отфильтруйте концентрированный супернатант через шприцевой фильтр длиной 0,2 мкм.При необходимости храните конечный концентрат при четырех градусах Цельсия в течение примерно трех недель, прежде чем перейти к очистке пузырьков. Чтобы гранулировать образец концентрированной культуры, поместите его в чистую ультрацентрифужную трубку и добавьте чистую среду или буфер, чтобы убедиться, что трубка заполнена. После центрифугирования удалите супернатант пипеткой.Повторно промыть гранулированный материал свежей питательной средой или промывочным буфером, таким как 1X фосфат-буферный физиологический раствор, и повторить центрифугирование. Повторно суспендируйте конечную гранулу в свежей культуре путем бережного пипетки одним миллилитром и переложите ее в чистый сосуд. Для выполнения ультрацентрифугирования градиента плотности готовят запасы йодиксанола, как описано в рукописи.Смешайте одну часть буфера 4X с тремя частями 60% йодиксанола, чтобы получить 45%-ный раствор йодиксанола. Разбавляют 45% йодиксанола буфером 1X для создания запасов градиентных сред 40, 35, 30, 25, 20, 15 и 10% конечных концентраций йодиксанола. Затем аккуратно наложите равное количество всех этих запасов градиента йодиксанола в ультрацентрифужную трубку, используя весь объем трубки.После центрифугирования соберите фракции по 0,5 миллилитра каждая для приблизительно градиента 4,5 миллилитра путем тщательной пипетки или использования дробного коллектора. Определите плотность каждой фракции, в граммах на миллилитр, используя аналитические весы и калиброванную пипетку. Извлеките образец из пробирки, определите вес и верните образец в пробирку.Разбавьте отдельные фракции чистым буфером в новой трубке с последующей чистой средой или буферной промывкой. Осторожно нанесите пять микролитров пузырька и оставьте на пять минут. Извлеките образец, прикоснувшись краем сетки к куску чистой фильтровальной бумаги.Пипетка выводит от 20 до 50 микролитров 2% уранилацетата на плоскую поверхность, покрытую полиэтиленовой пленкой. Затем поместите сетку, плавающую поверх нее, в течение двух минут. Удалите уранилацетат с помощью фильтровальной бумаги и ненадолго поплывите на капле сверхчистой воды для мытья.Наполните камеру сверхчистой водой с помощью чистого шприца и убедитесь, что пузырьки воздуха не образуются. Нажмите на «Запустить камеру» и визуализируйте оптимальную область камеры вокруг отпечатка пальца. Сдвиньте ползунки усиления экрана и уровня камеры к максимуму, а затем опустите до самого низкого уровня, чтобы увидеть самые тусклые частицы.Отрегулируйте фокус по мере необходимости, чтобы частицы были примерно одинаково видны в поле зрения, и продолжайте промывать ультрачистой водой до тех пор, пока камера не станет чистой. Добавьте образец пузырьков в камеру с помощью одного миллилитра шприца и подтвердите настройки сбора. Выберите стандартное измерение в раскрывающемся списке СОП и измените настройки, чтобы собрать по крайней мере три технические реплики видео по 60 секунд каждая.Нажмите create'and run script', следуйте подсказкам и поместите приблизительно 100 микролитров образца в камеру между репликами. Определите параметры частиц, щелкнув по анализу 'и открыть эксперимент' и загрузив файл образца. Выберите обработать выбранные файлы' и дождитесь завершения анализа.Выделение и характеристика внеклеточных везикул из цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 показали, что внешняя мембрана содержит каротиноиды, которые придают характерную оранжевую окраску образцам везикул, собранным путем прямого гранулирования посредством ультрацентрифугирования. Повторно суспендированную пузырчатую гранулу исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии либо путем отрицательного окрашивания образцов уранилацетатом, либо путем наблюдения за ультратонкими срезами.Распределение и концентрация везикул по размерам оценивались с использованием динамического рассеяния света и анализа отслеживания наночастиц. Очищенные везикулы Synechocystis sp. PCC6803 разделяли на додецилсульфатно-полиакриламидном геле и окрашивали для липополисахаридов.Образцы должны быть взяты до и после концентрированного образца пузырьков, чтобы убедиться, что тангенциальная фильтрация потока работает и везикулы концентрируются. Затем вам нужно измерить оба образца с помощью анализа отслеживания наночастиц. В будущем потребуются усилия по объединению этого метода с другими подходами, такими, как хроматография с исключением размеров или асимметричное фракционирование полевых потоков для улучшения дискриминации и выделения мелких частиц из образцов культуры и окружающей среды.Этот метод полезен для изучения везикул цианобактерий и конкретных функциональных ролей этих везикул в биологии цианобактерий.

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Генерация маркированы и безмаркерных Мутанты в модельных видов цианобактерий

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Изоляция, характеристики и высокую пропускную способность внеклеточного Flux анализ мышь первичной почечной трубчатых эпителиальных клеток

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Гранулярных анализ внеклеточного Vesicles из клеток кондиционером СМИ потока

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Очищение и анализ Caenorhabditis elegans Внеклеточные Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Анализ отслеживания наночастиц для количественной оценки и определения размера внеклеточных везикул

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия внеклеточных везикул в трех измерениях

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Масштабируемое выделение и очистка внеклеточных везикул от кишечной палочки и других бактерий

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Выделение и характеристика интактной фикобилисомы в цианобактериях

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Выделение микроРНК из клещей Ex vivo Культуры слюнных желез и внеклеточных везикул

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...