Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
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Los autores reconocen el apoyo de las Plataformas Científicas i3S "Biointerfaces y Nanotecnología", y "Histología y Microscopía Electrónica", miembro de la plataforma nacional de infraestructura portuguesa de bioimagen (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). También agradecemos al Prof. J. A. González-Reyes (Universidad de Córdoba, España) por ayudar a optimizar el protocolo de tinción de sección ultradelgada para TEM, y a la Dra. Cecília Durães y la Dra. Ana Rita Pinto (Universidad de Oporto, Portugal) por el análisis de seguimiento de nanopartículas.
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (OCE-2049004 a SJB), por fondos del Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) a través del Programa Operativo COMPETE 2020 para la Competitividad y la Internacionalización (POCI), Portugal, 2020, y por fondos portugueses a través de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior en el marco del proyecto POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 a PO). La Fundação para a Ciência e a Tecnologia también es muy reconocida por la beca de doctorado SFRH / BD / 130478 / 2017 (SL) y la beca DE INVESTIGADOR FCT IF / 00256 / 2015 (PO). M.C.M.-M. contó con el apoyo de una beca individual Marie Skłodowska-Curie (panel de reintegración) dentro del Programa Marco Horizonte 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Las vesículas extracelulares (EV) son estructuras esféricas, que oscilan entre ~ 20-400 nm de diámetro, liberadas por prácticamente todos los organismos en su entorno circundante 1,2,3. Las vesículas están delimitadas por una bicapa lipídica y no pueden replicarse a sí mismas. En las bacterias Gram-negativas, se cree que estas estructuras surgen principalmente por "sangrado" de pequeñas porciones de la membrana externa. Aún así, otros procesos, incluido el movimiento flagelar, la lisis celular y la secreción de material de membrana interna y externa, también pueden producir vesículas 4,5. Los EV pueden contener varias biomoléculas, incluyendo lípidos, proteínas solubles y de membrana, ácidos nucleicos y metabolitos, y pueden transportar este material entre las células 4,5,6. Dadas estas características, los EV se están estudiando para comprender sus posibles funciones en una amplia gama de procesos biológicos, incluida la comunicación celular, la formación de biopelículas, la transferencia horizontal de genes, la dinámica huésped-fago y el intercambio de nutrientes 4,6.
Las cianobacterias son un grupo grande y diverso de bacterias Gram-negativas, incluyendo organismos unicelulares y filamentosos. Son de interés desde muchas perspectivas, incluida la comprensión de su fisiología y diversidad 7,8, las funciones críticas de los ecosistemas a las que sirven 9,10 y su utilidad para la biotecnología11,12. Las cianobacterias se encuentran en una amplia variedad de hábitats, ya sea como organismos de vida libre en ambientes marinos, de agua dulce y terrestres, o en asociaciones simbióticas con musgos, helechos, plantas o en líquenes y esponjas13. Sirven como productores primarios cruciales en los ecosistemas acuáticos, produciendo oxígeno y carbono orgánico a través de la fotosíntesisoxigénica 9,10, y algunos son capaces de fijar nitrógeno atmosférico también7. Las cianobacterias marinas y de agua dulce, incluyendo Prochlorococcus, Synechococcus y Synechocystis, producen EV en condiciones de laboratorio 14,15,16, y las vesículas de cianobacterias también se pueden encontrar en ambientes naturales14,17. Las funciones biológicas y ecológicas de las vesículas de cianobacterias son desconocidas, pero es probable que la investigación adicional en esta área proporcione nuevos conocimientos sobre la fisiología de las cianobacterias, la diferenciación, las estrategias de comunicación, la evolución y las interacciones tróficas. Además, la capacidad de los vehículos eléctricos cianobacterianos para transportar diversas categorías de biomoléculas puede tener aplicaciones comerciales18,19.
El presente protocolo describe métodos para aislar y caracterizar vesículas de cultivos de cianobacterias y muestras de campo para permitir y fomentar un examen más amplio de la biología de las vesículas extracelulares de cianobacterias. Si bien el flujo de trabajo descrito aquí es análogo a los protocolos para aislar y caracterizar los EV de otras bacterias, los cultivos de cianobacterias y las muestras de campo generalmente contienen concentraciones de células y vesículas más bajas que las que se observan comúnmente con los sistemas modelos patógenos o asociados al huésped 20,21,22. Por lo tanto, los estudios de EV cianobacterianos requieren consideraciones y optimizaciones especiales para el cultivo y el aislamiento de vesículas, que varían aún más entre cepas y fondos de medios. Como ningún protocolo funcionará igual de bien para todas las cepas, condiciones de crecimiento y aplicaciones posteriores, proporcionamos múltiples opciones y discutimos las compensaciones involucradas para que los investigadores puedan determinar los enfoques más apropiados para abordar sus preguntas experimentales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

Las cianobacterias son un grupo diverso de bacterias fotosintéticas y gramnegativas que desempeñan un papel crítico en los ecosistemas globales y sirven como modelos biotecnológicos esenciales. Trabajos recientes han demostrado que tanto las cianobacterias marinas como las de agua dulce producen vesículas extracelulares, pequeñas estructuras unidas a la membrana liberadas de la superficie externa de los microbios. Si bien las vesículas probablemente contribuyen a diversos procesos biológicos, sus funciones funcionales específicas en la biología de las cianobacterias siguen siendo en gran parte desconocidas. Para fomentar y avanzar en la investigación en esta área, se presenta un protocolo detallado para aislar, concentrar y purificar las vesículas extracelulares de cianobacterias. El trabajo actual discute metodologías que han aislado con éxito vesículas de grandes cultivos de Prochlorococcus, Synechococcus y Synechocystis. Se presentan métodos para cuantificar y caracterizar muestras de vesículas de estas cepas. También se describen enfoques para aislar vesículas de muestras de campo acuático. Finalmente, también se discuten los desafíos típicos encontrados con la purificación de vesículas de cianobacterias, las consideraciones metodológicas para diferentes aplicaciones posteriores y las compensaciones entre los enfoques.

La Figura 1 presenta una visión general del proceso de aislamiento de vesículas cianobacterianas, destacando aspectos clave del protocolo descrito aquí. De particular interés son los pasos que detallan la separación de la biomasa de cianobacterias de la fracción de partícula pequeña (vesícula), la concentración de la muestra de vesícula y el aislamiento y purificación de vesículas (Figura 1, pasos 2 a 4), que son críticos para obtener preparaciones reproducibles de vesículas. La Figura 2 presenta resultados representativos del aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares de la cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Se ha demostrado que la membrana externa de esta cianobacteria contiene carotenoides31, que confieren una coloración anaranjada característica a las muestras de vesículas recogidas por peletización directa mediante ultracentrifugación (Figura 2A). Una vez que se resuspende el pellet de vesícula, las vesículas se pueden examinar mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), ya sea teñiendo negativamente las muestras con acetato de uranilo (Figura 2B) o mediante la observación de secciones ultrafinas (Figura 2C). La distribución y concentración del tamaño de las vesículas se puede evaluar mediante dispersión dinámica de luz (DLS) (Figura 2D) y análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Figura 2E). Con el protocolo descrito, típicamente se obtuvieron ~3.5 ± 1.0 x 108 nanopartículas por ml en un cultivo de crecimiento exponencial de Synechocystis sp. PCC 6803 a un OD730 de 1.0. Se pueden realizar análisis bioquímicos de EV aislados para complementar la caracterización física de las vesículas aisladas. Como ejemplo, las vesículas purificadas de Synechocystis sp. PCC 6803 se separaron en un gel de poliacrilamida SDS y se tiñeron para lipopolisacáridos (LPS; Figura 2F). Como los LPS son específicos de la membrana externa32, la detección de LPS puede validar la presencia de vesículas unidas a la membrana y servir como marcador para analizar el contenido relativo de vesículas entre preparaciones de la misma cepa33. La inspección de la abundancia relativa de LPS de bajo vs. alto peso molecular puede indicar cambios en la composición de vesículas entre muestras34,35.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> Figura 1: Procedimientos experimentales utilizados para el aislamiento y caracterización de EV cianobacterianos. Representaciones esquemáticas de cultivos en crecimiento (1) y separación de la biomasa cianobacteriana del medio de crecimiento (2). Las muestras libres de células que contienen vesículas se concentran (3), y luego los EV se aíslan y purifican (4). Dependiendo de la aplicación, las preparaciones de vesículas se pueden caracterizar utilizando una o una combinación de microscopía electrónica de transmisión (TEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), dispersión dinámica de luz (DLS) y perfil de lipopolisacáridos (LPS) (5). RT, temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos del aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares para la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Fotografía del pellet de vesícula extracelular (EVs pellet) obtenido después de la ultracentrifugación del medio extracelular concentrado libre de células de un cultivo de Synechocystis sp. PCC 6803 de 600 ml cultivado a un OD730 de 1.0-1.5. Tenga en cuenta la coloración naranja típica de la bolita de vesícula derivada de los carotenoides que se encuentran en la membrana externa. (B,C) Fotografías de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de secciones teñidas negativamente (B) y ultrafinas (C) de muestras de vesículas de Synechocystis sp. PCC 6803. Barras de escala: 200 nm y 50 nm, respectivamente. Las muestras se visualizaron en un microscopio electrónico de transmisión operado a 80 kV. (D) Gráfico típico de dispersión dinámica de luz (DLS) que representa la distribución del volumen de la vesícula en función del diámetro de la vesícula (en nm). Las líneas de color indican datos de tres mediciones técnicas replicadas de la misma muestra. (E) Datos representativos de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) de la distribución del tamaño de la vesícula extracelular de Synechocystis (en nm). La línea negra indica la media de tres réplicas técnicas, y las líneas rojas representan el error estándar de la media. (F) El perfil de lipopolisacáridos (LPS) se detectó después de separar la preparación de vesículas por electroforesis en un gel de poliacrilamida SDS al 16% (p/v) y la tinción con un kit de tinción de LPS comercial. Los LPS de bajo y alto peso molecular, correspondientes a formas de LPS rugosas y lisas, respectivamente, son detectables. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Expediente complementario 1: Ecuación para calcular r. El número de vesículas producidas por célula por generación entre dos puntos durante el crecimiento exponencial (típicamente el comienzo y el final del curso del tiempo) se determina utilizando esta ecuación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento, la concentración y la caracterización de vesículas extracelulares de cultivos de cianobacterias. También se discuten los enfoques para purificar vesículas de cultivos a diferentes escalas, las compensaciones entre metodologías y las consideraciones para trabajar con muestras de campo.

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares cianobacterianas

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Este protocolo es significativo ya que no solo demuestra enfoques para purificar vesículas de cultivo a diferentes escalas, compensaciones, diferencias entre metodologías y también consideración para trabajar con muestras de campo. Las cianobacterias presentan desafíos únicos de muestreo y análisis de vesículas. Estas técnicas han aislado y concentrado con éxito vesículas de cultivo y de muestras ambientales.Para concentrar muestras de menos de 500 mililitros, comience por enjuagar los concentradores centrífugos de ultrafiltración de 15 a 20 mililitros con agua de grado ultrapuro Tipo 1. Cargue los concentradores en la centrífuga y gire a 4, 400 x g a cuatro grados centígrados. Descarta la ejecución y repite el paso al menos dos veces.Cargue la muestra de sobrenadante en un concentrador enjuagado con agua y gire en las mismas condiciones. Repita este paso hasta que la muestra se concentre en un volumen final de 15 a 30 mililitros. Para concentrar un volumen de más de 500 mililitros, realice una filtración de flujo tangencial configurando el aparato como se describe en el manuscrito.Conecte una bomba peristáltica a la línea de admisión y coloque abrazaderas ajustables en la línea de retención. Desinfecte la filtración de flujo tangencial como se describe en el manuscrito, luego enjuague el dispositivo con un litro de agua de grado ultrapuro Tipo 1. Añadir menos de 0,2 micras de filtrado en el depósito de muestras.Aumente lentamente la velocidad de la bomba y los niveles de contrapresión en la línea de retención para aumentar la salida de las líneas de filtrado. Continúe ejecutando la filtración de flujo tangencial y rellene el reservorio con sobrenadante de cultivo a medida que se retira el material. Deje de concentrar la muestra una vez que el volumen en el depósito alcance la cantidad más baja posible necesaria para mantener el flujo en la línea de admisión sin introducir burbujas de aire.Cierre la línea de salida con una abrazadera. Retire la contrapresión en la línea de retención. Recircule el sobrenadante concentrado a través del filtro durante 10 minutos, reduciendo la tasa de recirculación de 20 a 40 mililitros por minuto para maximizar la recuperación.Mueva la línea de retención a un recipiente limpio, retire la línea de admisión de la muestra y recoja el material concentrado. Recupere cualquier material restante en el depósito de muestras utilizando una pipeta. Filtre el sobrenadante concentrado a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras.Si es necesario, guarde el concentrado final a cuatro grados centígrados durante aproximadamente tres semanas antes de pasar a la purificación de vesículas. Para granular la muestra de cultivo concentrado, colóquela en un tubo de ultracentrífuga limpio y agregue medios limpios o tampón para asegurarse de que el tubo esté lleno. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante con una pipeta.Vuelva a lavar el material peletizado con medios de cultivo frescos o tampón de lavado, como solución salina tamponada con fosfato 1X y repita la centrifugación. Vuelva a suspender el pellet final en cultivo fresco mediante pipeteo suave con una pipeta de un mililitro y transfiéralo a un recipiente limpio. Para realizar la ultracentrifugación del gradiente de densidad, prepare las existencias de iodixanol como se describe en el manuscrito.Mezcle una parte del tampón 4X con tres partes de stock de iodixanol al 60% para hacer una solución de iodixanol al 45%. Diluya 45% de iodixanol con tampón 1X para crear existencias de medios degradados de 40, 35, 30, 25, 20, 15 y 10% concentraciones finales de iodixanol. Luego, superponga cuidadosamente cantidades iguales de todas estas existencias de gradiente de iodixanol en un tubo de ultracentrífuga, utilizando todo el volumen del tubo.Después de la centrifugación, recoja las fracciones de 0,5 mililitros cada una para aproximadamente un gradiente de 4,5 mililitros mediante el pipeteo cuidadoso o el uso de un colector de fracciones. Determine la densidad de cada fracción, en gramos por mililitro, utilizando una balanza analítica y una pipeta calibrada. Retire la muestra del tubo, determine el peso y devuelva la muestra al tubo.Diluya las fracciones individuales con tampón limpio en un tubo nuevo seguido de un medio limpio o lavado tampón. Aplique con cuidado cinco microlitros de vesícula y déjelo reposar durante cinco minutos. Retire la muestra tocando el borde de una rejilla con un trozo de papel de filtro limpio.Pipetear de 20 a 50 microlitros de acetato de uranilo al 2% sobre una superficie plana cubierta por una película de plástico. Luego coloque la rejilla flotando sobre ella durante dos minutos. Retire el acetato de uranilo con papel de filtro y flote brevemente sobre una gota de agua ultrapura para lavar.Llene la cámara con agua ultrapura con una jeringa limpia y asegúrese de que no haya burbujas de aire. Haga clic en iniciar cámara y visualice la región óptima de la cámara alrededor de la huella digital. Deslice los controles deslizantes de ganancia de pantalla y nivel de cámara hacia el máximo, luego disminuya al nivel más bajo para ver las partículas más tenues.Ajuste el enfoque según sea necesario para asegurarse de que las partículas sean aproximadamente igualmente visibles en todo el campo de visión y continúe lavando con agua ultra limpia hasta que la cámara esté limpia. Agregue la muestra de vesícula a la cámara con una jeringa de un mililitro y confirme la configuración de adquisición. Seleccione la medición estándar en el cuadro desplegable SOP y cambie la configuración para recopilar al menos tres réplicas técnicas de videos de 60 segundos cada una.Presione create'and run script' y siga las indicaciones y empuje aproximadamente 100 microlitros de muestra en la cámara entre réplicas. Determine los parámetros de partícula haciendo clic en análisis 'y abrir experimento' y cargue el archivo de muestra. Seleccione procesar archivos seleccionados y espere a que se complete el análisis.El aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares de la cianobacteria Synechocystis sp. PCC6803, mostró que la membrana externa contiene carotinoides, que confieren una coloración anaranjada característica a las muestras de vesículas recogidas por peletización directa mediante ultracentrifugación. El pellet de vesícula resuspendido se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión, ya sea teñiendo negativamente las muestras con acetato de uranilo o observando secciones ultrafinas.La distribución y concentración del tamaño de las vesículas se evaluaron mediante análisis dinámicos de dispersión de luz y seguimiento de nanopartículas. Las vesículas purificadas de Synechocystis sp. PCC6803 se separaron en un gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida y se tiñeron para lipopolisacáridos.Las muestras deben tomarse antes y después de la muestra de vesícula concentrada para asegurarse de que la filtración de flujo tangencial está funcionando y las vesículas se están concentrando. Luego debe medir ambas muestras utilizando el análisis de seguimiento de nanopartículas. Se requieren esfuerzos futuros para fusionar este método con otros enfoques, como la cromatografía de exclusión de tamaño o el fraccionamiento asimétrico de flujo de campo para mejorar la discriminación y el aislamiento de partículas pequeñas de cultivo y muestras ambientales.Esta técnica es útil para estudiar las vesículas de cianobacterias y los roles funcionales específicos de estas vesículas en la biología de las cianobacterias.

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Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Aislamiento de microARN de cultivos de garrapatas ex vivo de glándulas salivales y vesículas extracelulares

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...