Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Författarna erkänner stödet från i3S vetenskapliga plattformar "Biointerfaces and Nanotechnology" och "Histology and Electron Microscopy", en medlem av den nationella infrastrukturen Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Vi tackar också prof. J. A. Gonzalez-Reyes (University of Córdoba, Spanien) för att ha hjälpt till att optimera det ultratunna sektionsfärgningsprotokollet för TEM, och Dr. Cecília Durães och Dr. Ana Rita Pinto (University of Porto, Portugal) för nanopartikelspårningsanalysen.
Detta arbete finansierades av US National Science Foundation (OCE-2049004 till SJB), av Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) fonder genom COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal, 2020, och av portugisiska medel genom Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior inom ramen för projektet POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 till PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia är också mycket erkänt för doktorandstipendiet SFRH / BD / 130478/2017 (SL) och FCT Investigator grant IF / 00256 / 2015 (PO). M.C.M.-M. stöddes av marie skłodowska-Curie-stipendiet (återintegreringspanelen) inom ramprogrammet Horisont 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Allmänna överväganden Protokollet (figur 1) presenteras som en uppsättning alternativ för att markera att det inte finns någon "one-size-fits-all" -metod för att arbeta med cyanobakteriella extracellulära vesiklar. Intresserade forskare kan använda de delar av detta protokoll som är kompatibla och lämpliga för deras specifika modellorganism, experimentella frågor / mål och utrustningstillgänglighet. Alla vesikelisoleringsmetoder innebär avvägningar och kommer oundvikligen att resultera i en viss grad av partiskhet. Även om man bör försöka minimera detta när det är möjligt, är det viktigaste övervägandet att se till att den detaljerade metod som används rapporteras enligt lämpliga MISEV-riktlinjer (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)36.
Kultur tillväxt Cyanobakteriella kulturer kan lätt erhållas från en av de många kultursamlingar som finns tillgängliga över hela världen. Några exempel är Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, Frankrike), Pasteur Culture Collection (Institute Pasteur, Paris, Frankrike) och Provasoli-Guillard National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA, Maine, USA). Den valda cyanobakteriella stammen måste odlas under lämpliga medium- och miljöförhållanden, som varierar avsevärt mellan olika stammar. En lista över vanliga medier för cyanobakteriell odling finns på kultursamlingswebbplatser eller andra publikationer 37,38,39.
Att arbeta med cyanobakteriella extracellulära vesiklar innebär några unika utmaningar jämfört med de metoder som rapporterats för många typiska heterotrofer i modelllaboratorier. Cyanobakteriella kulturer har vesikelkoncentrationer av storleksordningar lägre än de som finns i andra mikrober såsom Escherichia coli 14,16,40. Dessa skillnader, som förmodligen härrör från lägre celltätheter och / eller vesikelproduktionshastigheter, innebär att relativt stora kulturer (~ 1-20 L eller mer) kan krävas för att ge tillräckligt med material för bulkanalyser. Således uppmuntras forskare att testa vesikelutbyten från mindre kulturer för att bestämma hur mycket material som kommer att behövas för att uppnå sina önskade slutmål. Vikten av att fastställa om de medier som används för experimentet har en detekterbar partikelbakgrund måste också betonas innan ett experiment påbörjas, eftersom det materialet potentiellt kan förvirra vesikelpopulationskvantifieringen, minska känsligheten för vesikelkoncentration/ storleksmätningar eller förorena de slutliga vesikelpreparaten.
En annan utmaning för fältet är att inte alla cyanobakterier växer bra, eller alls, i ren kultur. Innan de görs axeniska kan tolkningar av fysiska vesikelegenskaper, produktionshastigheter eller innehåll inte nödvändigtvis leda till tydliga slutsatser om vesiklar som produceras av någon stam i samhället. Forskare rekommenderas också att överväga vilka andra typer av partiklar som kan vara närvarande och potentiellt förväxlas med vesiklar av specifika nanopartikelanalysverktyg, som inte nödvändigtvis kan skilja mellan olika partikeltyper. Det kan till exempel vara viktigt att verifiera att stammen som används saknar profag, antingen via genomsekvensering, induktionsanalyser eller på annat sätt eller inte släpper ut andra typer av partiklar. Enligt vår erfarenhet är de flesta cyanobakteriella vesiklar <0,2 μm i diameter, men när man tittar på en ny stam eller tillväxttillstånd bör man bekräfta om användning av ett filter på 0,45 μm porstorlek förändrar storleksfördelningen för renade partiklar.
Många aspekter av kulturförhållanden kan påverka vesikelproduktionen och dess innehåll 41,42. De fysikaliska och kemiska förhållanden som används för odlingstillväxt (inklusive lätt bestrålning, temperatur och mediesammansättning) måste därför dokumenteras och kontrolleras i den mån det är möjligt för att säkerställa resultatens reproducerbarhet. Varje kemisk analys av vesikelinnehåll måste ta hänsyn till bakgrundssammansättningen, särskilt vid utförande av analyser av hög genomströmning i "-omics"-stil. Detta kan vara särskilt viktigt när du använder odefinierade medier, såsom de som är baserade på en naturlig havsvattenbakgrund eller kompletteras med jästextrakt eller trypton. Att använda ett definierat tillväxtmedium kan vara att föredra beroende på de experimentella målen.
Forskare måste noggrant övervaka odlingstillväxtdynamiken med jämna mellanrum för att säkerställa att de vet var i tillväxtfasen en viss batchkultur är och inte bara samla in prover efter en godtycklig tid. Vesikelsammansättningen kan variera mellan tillväxtfaser, särskilt mellan exponentiella och stationära faser41,42. Till exempel kan åtminstone en viss bråkdel av vesiklar som provtas i den stationära fasen uppstå från en annan cellulär mekanism, såsom celllys, som inte kommer att inträffa under exponentiell tillväxt. Även om detta fortfarande kan vara av stort biologiskt intresse, är det viktigt att känna till provet. Om en cyanobakteriell odling når den önskade tillväxtfasen vid en tidpunkt då det inte är möjligt att gå direkt till provkoncentrationen rekommenderas att cellerna separeras från den <0,2 μm fraktionen omedelbart (med centrifugering och/eller direkt 0,2 μm filtrering) och sedan lagras det cellfria filtratet vid 4 °C. Materialet kan lagras på detta sätt i dagar med liten eller ingen märkbar inverkan på koncentrationen eller storleksfördelningen av vesiklar.
Vesikelrening Det frekventa behovet av att isolera vesiklar från betydande volymkulturer är avgörande i arbetsflödet för cyanobakteriell vesikelisolering. Vid arbete med större volymer material måste vesiklarna koncentreras innan arbetsflöden för separation nedströms. Koncentratorer (tangentiella flödesfiltermembran eller centrifugalkolonner) med en nominell molekylviktgräns på 100 kDa rekommenderas i allmänhet, eftersom de möjliggör separation från lösligt material med låg molekylvikt samtidigt som koncentrationstiderna är rimliga, men 30 kDa-filter används också ofta med framgång. Medan flera icke-ultracentrifugeringsbaserade metoder för att rena vesiklar (t.ex. storleksuteslutningskromatografi, mikrofluidikbaserade system, affinitetsfångsttekniker och nederbördsbaserade tillvägagångssätt) blir populära i det extracellulära vesikelfältet, enligt vår erfarenhet, kan dessa tillvägagångssätt resultera i minskade utbyten och är vanligtvis oförenliga med de odlingsvolymer som behövs.
Forskare måste överväga sammansättningen av jodoxanolbakgrunden och de tvätt- / resuspensionsbuffertar som används vid vesikelrening för att säkerställa att de är kompatibla med de önskade nedströmsapplikationerna. I många fall kan det slutliga vesikelprovet återsuspenderas i tillväxtmedier eller en definierad buffert som är jämförbar i sammansättning med tillväxtmediet (t.ex. naturligt kontra artificiellt havsvatten). Detta kan dock inte vara möjligt med marina cyanobakteriella vesiklar, vilket kommer att kräva ytterligare experimentell manipulation för analys, eftersom höga saltkoncentrationer som liknar havsvattennivåerna kan hämma många enzymatiska reaktioner. I sådana fall fungerar standardlaboratoriebuffertar som 0,2 μm filtrerade, 1x PBS vanligtvis bra för att upprätthålla stabiliteten hos marina cyanobakteriella vesiklar och kan vara mer kompatibla med nedströms experimentella processer.
Densitetsgradientrening kan betraktas som valfri beroende på experimentella mål och odlingssammansättning men rekommenderas starkt för att producera ett mer rigoröst rent och reproducerbart prov. EV-populationer är heterogena och kan hittas över en rad flytande densiteter, som ytterligare varierar beroende på belastning, tillväxtförhållanden och andra faktorer 4,5,6. De densiteter som anges ovan representerar de som vanligtvis finns för vesiklar från cyanobakteriella kulturer och fältprover i jodoxanol, men resultaten i andra stammar kan variera. Andra densitetsgradientmaterial som sackaros och CsCl kan användas för vesiklar, men de kommer att migrera till olika flytande densiteter i dessa bakgrunder. Olika gradientmediabakgrunder kan påverka återhämtningen av lipidslutna virus43 och kan potentiellt påverka återhämtningen av vesiklar från olika stammar.
Vesiklar kan gå förlorade på flera punkter genom vesikelisolering och gradientreningsprocess som beskrivs här, vilket minskar utbytet och ökar mängden utgångsmaterial som behövs för att uppnå ett givet slutligt vesikelutbyte för nedströmsapplikationer. Särskild försiktighet bör iakttas vid arbete med vesikelpellets efter ultracentrifugering. Medan vissa cyanobakteriella vesiklar kan ha karotenoider eller andra föreningar som kan ge vesikelprover en viss mängd pigmentering (figur 2), beroende på stammen eller mängden material, förväntas det inte nödvändigtvis kunna visualisera vesiklarpelleten direkt. Var medveten om var pelleten förväntas vara med tanke på vilken typ av centrifugrotor som används. När så är möjligt föreslås renade vesikelprover undersökas med elektronmikroskopi för att verifiera sammansättningen av det slutliga material som återvunnits.
Lagringsförhållandenas inverkan på vesiklar och deras innehåll är fortfarande en öppen fråga. Även om det har visat sig att lagringen inte har någon märkbar effekt på cyanobakteriell vesikelstorlek eller koncentration14, kan funktionaliteten hos isolerade vesikelpreparat förändras över tiden44. Även om frys-/upptiningscykler bör undvikas när så är möjligt, verkar effekten av frysprover på det totala antalet fordon och storlekar vara minimal. Man bör vara medveten om potentialen för frys-tina cykler att påverka sammansättningen av vesikelinnehållet, såsom längden på vesikelassocierade nukleinsyror eller stabiliteten hos proteiner.
Vesiklar från field samples Nuvarande metoder för att isolera extracellulära vesiklar från naturliga vattenmiljöer liknar konceptuellt och operativt de som beskrivs här för stora volymkulturer. Ändå kan de kräva ännu större volymer material. Sådana fältprover kan involvera insamling, filtrering och koncentration av hundratals till tusentals liter vatten för att erhålla tillräckligt med material för analys. Beroende på grumligheten hos det prov som används kan det behövas ett eller flera förfiltreringssteg före 0,2 μm-filtret. Den specifika TFF-anordning som används bör vara lämplig för att arbeta med så stora volymer inom rimlig tid (helst i storleksordningen timmar) och utan att sätta alltför stort tryck på provet. I praktiken innebär detta ofta att man använder en mycket större total ytarea än vad som kan tillämpas på odlingsbaserade prover, liksom slangar med större diameter för att underlätta ökade flödeshastigheter. Denna ökade filteryta kommer sannolikt att leda till en marginell ökning av partikelförluster jämfört med mindre TFF-arrangemang och en större slutlig volym koncentrat; Dessa farhågor måste dock vägas mot överväganden om den totala handläggningstiden. För situationer som en utökad oceanografisk kryssning där prover inte kommer tillbaka till ett laboratorium på många dagar efter provtagning rekommenderar vi att du utför initial 0,2 μm filtrering och TFF-steg i fältet. Denna mindre volym koncentrerat material kan sedan lagras vid 4 °C eller -80 °C ombord (beroende på tillgänglighet och analytiska överväganden nedströms) tills det returneras till laboratoriet för slutlig bearbetning.
Isolering och separation av extracellulära vesiklar från andra små partiklar, både organiska och oorganiska, kan vara utmanande, och metoder för att separera olika partiklar är ännu inte perfekta. Till exempel kan iodixanoldensitetsgradienter inte lätt separera alla klasser av vesiklar och virus som finns i ett givet prov. Eftersom typerna av förvirrande partiklar och deras fysikaliska egenskaper kommer att variera mellan provtagningsplatserna är det för närvarande omöjligt att tillhandahålla ett protokoll som robust delar upp alla klasser av små vattenpartiklar. Försök och fel är viktiga, och experiment med jodoxanolområdet som används i gradient- och ultracentrifugeringsförhållandena kommer att krävas för att maximera separationen; en samling mindre volymer, mer finupplösta densitetsfraktioner kan också krävas. Beroende på sammanhanget kan användning av CsCl-gradienter istället för jodoxanol hjälpa till att separera miljöpartiklar45. Ändå kan förändringen i osmotiska förhållanden leda till fördomar i de slutliga återvunna produkterna, som diskuterats ovan.
Vesikel karakterisering Nanopartikelanalysinstrument är ännu inte rutinmässigt tillgängliga i mikrobiologiska laboratoriemiljöer men blir alltmer tillgängliga. Alla metoder har för- och nackdelar, och vi gör inget specifikt godkännande av en plattform som bättre än alla andra för cyanobakteriellt vesikelarbete; Faktum är att alla har särskilda avvägningar när det gäller kostnader, upplösning, användarvänlighet, detektionsgränser, kompatibilitet med olika tillväxtmedier / buffertbakgrunder och datareproduktion. Förutom instrument baserade på nanopartikelspårningsanalys som beskrivs ovan kan andra tillvägagångssätt, inklusive nanoflödescytometri, mikrofluidisk resistiv pulsavkänning och avstämbar resistiv pulsavkänning, tillämpas46,47. Användare bör vara noga med att lära sig detaljerna i deras tillgängliga instrumentering och verifiera att det fungerar bra med deras system, eftersom vi har stött på svårigheter när vi använder vissa plattformar med havsvattenbaserade medier. Vi uppmuntrar fältet att gå mot kvantitativ karakterisering av vesikelstorlek, koncentrationer och produktionshastigheter. Mätning av vesikelkoncentrationer på basis av en grundläggande partikel per ml, och inte i termer av proteininnehåll eller andra mätvärden, kommer att möjliggöra integrering av vesiklar i mer kvantitativa ramar och möjliggöra jämförelser mellan stammar och förhållanden. Ytterligare ansträngningar för att förbättra förmågan att kalibrera koncentrationsmätningar för <100 nm partiklar behövs.
Det faktum att mätningar av vesikelproduktionshastighet görs direkt från 0,2 μm filtrerad odlingssupernatant för att minimera partikelförluster skulle vara associerat med andra reningssteg som beskrivs ovan. Detta betyder dock att tillvägagångssättet inte nödvändigtvis diskriminerar mellan faktiska extracellulära vesiklar och andra små partiklar som finns i kulturerna. Endast räkning av partiklar inom specifika storleksintervall (t.ex. 50-250 nm diameter) kan hjälpa till att utesluta vissa avvikare, men visuell bekräftelse på att pelleterat <0,2 μm odlingsinnehåll verkar vara membranbundna vesiklar (med TEM eller andra metoder) behövs för att specifikt kunna hävda att man mäter produktionen av vesiklar i motsats till produktionen av vesikelliknande partiklar.
En väsentlig faktor vid vesikelkarakterisering är att säkerställa att vesikelprovet analyseras i lämpligt linjärt känslighetsområde för nanopartikelanalysanordningen. När ett prov är för koncentrerat är det enkelt att späda ut materialet med en ren buffert och analysera det igen. Å andra sidan kan den relativt låga cell- och/eller vesikeltätheten hos vissa cyanobakteriella kulturer ibland ge vesikelpreparat som ligger under vissa instruments detektionsgränser. I de fall där detta sker med vesikelrening i bulk kan man överväga att odla större volymkulturer, återpela och återsuspera det slutliga materialet i en mindre volym, eller utvärdera om det finns ett steg i isoleringsprocessen där alltför stora förluster uppstår och kan mildras. Vid mätning av vesikelproduktionshastigheter är korrigeringarna inte nödvändigtvis så enkla. Prover kan koncentreras vid behov, men den första bör se om justeringar av mediet kan leda till högre celltäthet eller om tillräckligt koncentrerade prover kan erhållas från senare tidpunkter under exponentiell fas där koncentrationerna blir högre.
Begränsningar Som med alla protokoll har vesikelisolering med hjälp av dessa metoder tydliga begränsningar. Dessa tillvägagångssätt förlitar sig inte på deras garanti för att en helt ren beredning av vesiklar kommer att isoleras. Både kulturer och fältprover kan innehålla andra material, som migrerar på samma sätt som vesiklar i densitetsgradienter. Ändå är dessa typer av ytterligare reningsmetoder åtminstone väsentliga för att säkerställa noggrannhet och reproducerbarhet av vesikelanalys. Medan vi beskriver vesikelisoleringsmetoder i samband med cyanobakterier, kommer kulturer av många andra mikrober också att innehålla vesiklar i relativt låga koncentrationer, och de förfaranden som beskrivs här bör vara allmänt tillämpliga. Det förväntas att dessa metoder inte kommer att fungera som ett permanent protokoll utan istället som en utgångspunkt för att stimulera framtida framsteg i arbetet med extracellulära vesiklar från olika mikrober. Framtida ansträngningar krävs för att slå samman dessa metoder med andra tillvägagångssätt som storleksuteslutningskolonner eller asymmetrisk fältflödesfraktionering för att förbättra diskrimineringen och separationen av olika kategorier av små partiklar från kulturer och miljöprover. Vi hoppas också att dessa tekniker kan fortsätta att utvecklas tillsammans med förbättringar i nanopartikelkarakteriseringstekniker för att förbättra förmågan att undersöka heterogenitet inom vesikelpopulationer, deras innehåll och deras exakta funktionella roller i miljön.

Extracellulära vesiklar (EV) är sfäriska strukturer, som sträcker sig mellan ~ 20-400 nm i diameter, som frigörs av praktiskt taget alla organismer i sin omgivande miljö 1,2,3. Vesiklar avgränsas av ett lipid-dubbelskikt och kan inte replikera sig själva. I gramnegativa bakterier tros dessa strukturer främst uppstå genom "blebbing" av små portioner från det yttre membranet. Ändå kan andra processer, inklusive flagellärrörelse, celllys och utsöndring av både inre och yttre membranmaterial, också producera vesiklar 4,5. Elbilar kan innehålla olika biomolekyler, inklusive lipider, lösliga och membranproteiner, nukleinsyror och metaboliter, och kan transportera detta material mellan cellerna 4,5,6. Med tanke på dessa egenskaper studeras elbilar för att förstå deras möjliga roller i ett brett spektrum av biologiska processer, inklusive cellulär kommunikation, biofilmbildning, horisontell genöverföring, värd-fagdynamik och näringsutbyte 4,6.
Cyanobakterier är en stor och mångsidig grupp av gramnegativa bakterier, inklusive encelliga och trådformiga organismer. De är av intresse ur många perspektiv, inklusive att förstå deras fysiologi och mångfald 7,8, de kritiska ekosystemfunktionerna de tjänar 9,10 och deras användbarhet för bioteknik11,12. Cyanobakterier finns i en mängd olika livsmiljöer, antingen som fritt levande organismer i marina, sötvattens- och markmiljöer, eller i symbiotiska föreningar med mossor, ormbunkar, växter eller i lavar och svampar13. De fungerar som viktiga primärproducenter i akvatiska ekosystem och producerar syre och organiskt kol genom syrefotosyntes 9,10, och vissa kan också fixera atmosfäriskt kväve7. Marina och sötvatten cyanobakterier, inklusive Prochlorococcus, Synechococcus och Synechocystis, producerar elbilar under laboratorieförhållanden 14,15,16, och cyanobakteriella vesiklar finns också i naturliga miljöer14,17. De biologiska och ekologiska funktionerna hos cyanobakteriella vesiklar är okända, men ytterligare forskning inom detta område kommer sannolikt att ge nya insikter i frågor om cyanobakteriell fysiologi, differentiering, kommunikationsstrategier, evolution och trofiska interaktioner. Dessutom kan förmågan hos cyanobakteriella elbilar att bära olika kategorier av biomolekyler ha kommersiella tillämpningar18,19.
Detta protokoll beskriver metoder för att isolera och karakterisera vesiklar från cyanobakteriella kulturer och fältprover för att möjliggöra och uppmuntra en bredare undersökning av cyanobakteriell extracellulär vesikelbiologi. Medan arbetsflödet som beskrivs här är analogt med protokoll för att isolera och karakterisera elbilar från andra bakterier, innehåller cyanobakteriella kulturer och fältprover vanligtvis lägre cell- och vesikelkoncentrationer än vad som vanligtvis observeras med värdassocierade eller patogena modellsystem 20,21,22. Studier av cyanobakteriella elbilar kräver därför särskilda överväganden och optimeringar för odling och vesikelisolering, som varierar ytterligare mellan stammar och mediebakgrund. Eftersom inget enskilt protokoll fungerar lika bra för alla stammar, tillväxtförhållanden och nedströmsapplikationer, tillhandahåller vi flera alternativ och diskuterar de avvägningar som är inblandade så att forskare kan bestämma de metoder som är mest lämpliga för att ta itu med deras experimentella frågor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

Cyanobakterier är en mångsidig grupp fotosyntetiska, gramnegativa bakterier som spelar kritiska roller i globala ekosystem och fungerar som viktiga bioteknikmodeller. Nyligen utfört arbete har visat att både marina och sötvatten cyanobakterier producerar extracellulära vesiklar - små membranbundna strukturer som frigörs från mikrobernas yttre yta. Medan vesiklar sannolikt bidrar till olika biologiska processer, är deras specifika funktionella roller i cyanobakteriell biologi fortfarande i stort sett okända. För att uppmuntra och främja forskning inom detta område presenteras ett detaljerat protokoll för isolering, koncentration och rening av cyanobakteriella extracellulära vesiklar. Det aktuella arbetet diskuterar metoder som framgångsrikt har isolerat vesiklar från stora kulturer av Prochlorococcus, Synechococcus och Synechocystis. Metoder för att kvantifiera och karakterisera vesikelprover från dessa stammar presenteras. Metoder för att isolera vesiklar från vattenlevande fältprover beskrivs också. Slutligen diskuteras också typiska utmaningar med cyanobakteriell vesikelrening, metodologiska överväganden för olika nedströmstillämpningar och avvägningar mellan tillvägagångssätt.

Figur 1 visar en översikt över den cyanobakteriella vesikelisoleringsprocessen och belyser viktiga aspekter av protokollet som beskrivs här. Särskilt anmärkningsvärt är de steg som beskriver separation av cyanobakteriell biomassa från den lilla partikelfraktionen (vesikel), koncentration av vesikelprovet och vesikelisolering och rening (figur 1, steg 2 till 4), som är avgörande för att erhålla reproducerbara preparat av vesiklar. Figur 2 visar representativa resultat från isolering och karakterisering av extracellulära vesiklar från cyanobakterien Synechocystis sp. Det yttre membranet i denna cyanobakterie har visat sig innehålla karotenoider31, som ger en karakteristisk orange färg till vesiklarnas prover som samlats in genom direkt pelletering genom ultracentrifugering (figur 2A). När vesikelpelleten har återsuspenderats kan vesiklar undersökas med transmissionselektronmikroskopi (TEM), antingen genom negativ färgning av prover med uranylacetat (figur 2B) eller genom observation av ultratunna sektioner (figur 2C). Vesikelstorleksfördelning och koncentration kan bedömas med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS) (figur 2D) och nanopartikelspårningsanalyser (NTA) (figur 2E). Med det beskrivna protokollet erhölls vanligtvis ~ 3,5 ± 1,0 x 108 nanopartiklar per ml i en exponentiellt växande kultur av Synechocystis sp. PCC 6803 vid en OD730 av 1,0. Biokemiska analyser av isolerade elbilar kan utföras för att komplettera den fysiska karakteriseringen av de isolerade vesiklarna. PCC 6803 vesiklar separerades på en SDS-polyakrylamidgel och färgades för lipopolysackarider (LPS; Figur 2F). Eftersom LPS är specifika för det yttre membranet32 kan LPS-detektion validera närvaron av membranbundna vesiklar och fungera som en markör för att analysera relativ vesikelhalt mellan preparat från samma stam33. Inspektion av den relativa förekomsten av LPS med låg respektive hög molekylvikt kan indikera förändringar i vesikelsammansättningen mellanproverna 34,35.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> Figur 1: Experimentella procedurer som används för cyanobakteriell EV-isolering och karakterisering. Schematiska representationer av odlingskulturer (1) och separation av cyanobakteriell biomassa från tillväxtmediet (2). Cellfria prover som innehåller vesiklar koncentreras (3) och sedan isoleras och renas elbilarna (4). Beroende på applikation kan vesikelpreparat karakteriseras med användning av en eller en kombination av transmissionselektronmikroskopi (TEM), nanopartikelspårningsanalys (NTA), dynamisk ljusspridning (DLS) och lipopolysackarid (LPS) profilering (5). RT, rumstemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> Figur 2: Representativa resultat av den extracellulära vesikelisoleringen och karakteriseringen för cyanobakterien Synechocystis sp. (A) Fotografi av den extracellulära vesikelpelleten (EV-pellet) erhållen efter ultracentrifugering av det koncentrerade cellfria extracellulära mediet från en 600 ml Synechocystis sp. PCC 6803-kultur odlad till en OD730 av 1,0-1,5. Observera den typiska orange färgen på vesikelpelleten som härrör från karotenoiderna som finns i det yttre membranet. (B,C) Transmissionselektronmikroskopi (TEM) fotografier av negativt färgade (B) och ultratunna sektioner (C) av Synechocystis sp. Skalstaplar: 200 nm respektive 50 nm. Proverna visualiserades på ett transmissionselektronmikroskop som drivs vid 80 kV. (D) Typiskt dynamiskt ljusspridningsdiagram (DLS) som visar fördelningen av vesikelvolymen som en funktion av vesikeldiametern (i nm). Färgade linjer indikerar data från tre tekniska replikatmätningar av samma prov. (E) Representativa nanopartikelspårningsanalysdata (NTA) för Synechocystis extracellulära vesikelstorleksfördelning (i nm). Den svarta linjen anger medelvärdet av tre tekniska replikat och de röda linjerna representerar medelvärdets standardfel. (F) Lipopolysackaridprofilen (LPS) detekterades efter att vesikelpreparatet separerats genom elektrofores på en 16% (w / v) SDS-polyakrylamidgel och färgning med en kommersiell LPS-färgningssats. LPS med låg och hög molekylvikt, motsvarande grova respektive släta LPS-former, är detekterbara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande fil 1: Ekvation för att beräkna r. Antalet vesiklar som produceras per cell per generation mellan två punkter under exponentiell tillväxt (vanligtvis början och slutet av tidsförloppet) bestäms med hjälp av denna ekvation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Det nuvarande protokollet ger detaljerade beskrivningar för isolering, koncentration och karakterisering av extracellulära vesiklar från cyanobakteriella kulturer. Metoder för att rena vesiklar från kulturer i olika skalor, avvägningar mellan metoder och överväganden för att arbeta med fältprover diskuteras också.

Isolering och karakterisering av cyanobakteriella extracellulära vesiklar

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Detta protokoll är viktigt eftersom det inte bara visar metoder för att rena vesiklar från kultur i olika skalor, avvägningar, skillnader mellan metoder och även hänsyn till att arbeta med fältprover. Cyanobakterier innebär unika utmaningar för provtagning och analys av vesikel. Dessa tekniker har framgångsrikt isolerat och koncentrerat vesiklar från kultur och från miljöprover.För att koncentrera prover på mindre än 500 ml, börja med att skölja 15 till 20 ml ultrafiltreringscentrifugalkoncentratorer med typ 1 ultrarent vatten. Ladda koncentratorerna i centrifugen och snurra vid 4 400 x g vid fyra grader Celsius. Kasta genomgången och upprepa steget minst två gånger.Ladda supernatantprovet i en vattensköljd koncentrator och snurra under samma förhållanden. Upprepa detta steg tills provet koncentreras till en slutlig volym av 15 till 30 ml. För att koncentrera en volym på mer än 500 ml, utför tangentiell flödesfiltrering genom att ställa in apparaten enligt beskrivningen i manuskriptet.Fäst en peristaltisk pump på insugningsledningen och placera justerbara klämmor på retentatledningen. Sanera den tangentiella flödesfiltreringen enligt beskrivningen i manuskriptet och spola sedan enheten med en liter ultrarent vatten av typ 1. Tillsätt mindre än 0,2 mikron filtrat i provbehållaren.Öka långsamt pumphastigheten och mottrycksnivåerna på retentatledningen för att öka effekten från filtratledningarna. Fortsätt att köra den tangentiella flödesfiltreringen och fyll på behållaren med kultursupernatant när materialet tas bort. Sluta koncentrera provet när volymen i behållaren når den lägsta möjliga mängd som behövs för att upprätthålla flödet i insugningsledningen utan att införa luftbubblor.Stäng utflödesledningen med en klämma. Ta bort mottrycket på retentatlinjen. Återcirkulera den koncentrerade supernatanten genom filtret i 10 minuter, vilket minskar recirkulationshastigheten från 20 till 40 ml per minut för att maximera återhämtningen.Flytta retentatlinjen till ett rent kärl, ta bort insugningslinjen från provet och samla upp det koncentrerade materialet. Återvinn eventuellt återstående material i provbehållaren med hjälp av en pipett. Filtrera den koncentrerade supernatanten genom ett 0,2 mikron sprutfilter.Förvara vid behov det slutliga koncentratet vid fyra grader Celsius i cirka tre veckor innan du går över till vesikelrening. För att pelletera det koncentrerade odlingsprovet placera det i ett rent ultracentrifugrör och tillsätt rent media eller buffert för att säkerställa att röret fylls. Efter centrifugering, ta bort supernatanten med en pipett.Tvätta om det pelleterade materialet med färska odlingsmedier eller tvättbuffert, såsom 1X fosfatbuffrad saltlösning och upprepa centrifugeringen. Resuspend den slutliga pelleten i färsk kultur genom mild pipettering med en milliliter pipett och överför den till ett rent kärl. För att utföra ultracentrifugering av densitetsgradient, förbered jodoxanollager enligt beskrivningen i manuskriptet.Blanda en del av 4X-bufferten med tre delar 60% jodoxanollager för att göra en 45% jodoxanollösning. Späd 45% jodoxanol med 1X buffert för att skapa lager av gradientmedia med 40, 35, 30, 25, 20, 15 och 10% slutliga jodoxanolkoncentrationer. Lägg sedan försiktigt över lika stora mängder av alla dessa jodoxanolgradientlager i ett ultracentrifugrör med användning av hela rörvolymen.Efter centrifugering, samla fraktionerna av 0,5 ml vardera för ungefär en 4,5 ml gradient genom att försiktigt pipettera eller använda en fraktionsuppsamlare. Bestäm densiteten för varje fraktion, i gram per milliliter, med användning av en analytisk balans och kalibrerad pipett. Ta bort provet från röret, bestäm vikten och återför provet till röret.Späd enskilda fraktioner med ren buffert i ett nytt rör följt av ett rent medium eller bufferttvätt. Applicera försiktigt fem mikroliter vesikel och låt den sitta i fem minuter. Ta bort provet genom att röra kanten på ett rutnät till en bit rent filterpapper.Pipettera ut 20 till 50 mikroliter 2% uranylacetat på en plan yta täckt av plastfilm. Placera sedan gallret flytande ovanpå det i två minuter. Ta bort uranylacetat med filterpapper och flyt kort på en droppe ultrarent vatten för att tvätta.Fyll kammaren med ultrarent vatten med en ren spruta och se till att inga luftbubblor. Klicka på starta kameran'och visualisera det optimala området i kammaren runt tumavtrycket. Skjut skärmförstärknings- och kameranivåreglagen mot maximalt och minska sedan till den lägsta nivån för att se de svagaste partiklarna.Justera fokus efter behov för att säkerställa att partiklarna är ungefär lika synliga över synfältet och fortsätt tvätta med ultrarent vatten tills kammaren är ren. Tillsätt vesikelprovet i kammaren med en spruta på en milliliter och bekräfta anskaffningsinställningarna. Välj standardmätning'från SOP-listrutan och ändra inställningarna för att samla in minst tre tekniska replikat av 60 sekunders videor vardera.Tryck på create'and run script' och följ anvisningarna och tryck in cirka 100 mikroliter prov i kammaren mellan replikaten. Bestäm partikelparametrarna genom att klicka på analys 'och öppna experiment' och ladda provfilen. Välj process valda filer och vänta tills analysen är klar.Isoleringen och karakteriseringen av extracellulära vesiklar från cyanobakterien Synechocystis sp. PCC6803 visade att det yttre membranet innehåller karotenoider, vilket ger en karakteristisk orange färgisering till vesikelprover som samlats in genom direkt pelletering genom ultracentrifugering. Den återsuspenderade vesikelpelleten undersöktes genom transmissionselektronmikroskopi antingen genom negativ färgning av prover med uranylacetat eller genom att observera ultratunna sektioner.Vesikelstorleksfördelning och koncentration bedömdes med hjälp av dynamisk ljusspridning och nanopartikelspårningsanalyser. PCC6803 vesiklar separerades på en natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel och färgades för lipopolysackarider.Prover bör tas före och efter det koncentrerade vesikelprovet för att säkerställa att den tangentiella flödesfiltreringen fungerar och att blåsorna koncentreras. Då måste du mäta båda proverna med hjälp av nanopartikelspårningsanalysen. Framtida ansträngningar krävs för att slå samman denna metod med andra metoder som storleksuteslutningskromatografi eller asymmetrisk fältflödesfraktionering för att förbättra diskrimineringen och isoleringen av små partiklar från odlings- och miljöprover.Denna teknik är till hjälp för att studera cyanobakterieblåsorna och de specifika funktionella rollerna för dessa vesiklar i cyanobakteriell biologi.

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Tekniker för analys av extracellulärt Blåsor Använda flödescytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Generering av Markerade och Markerless mutanter i Model Blågrön Art

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolering, karakterisering och hög genomströmning extracellulära Flux analys av mus primära renala tubulära epitelceller

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow flödescytometrisk analys av extracellulära blåsor från Cell-villkorade Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rening och analys av Caenorhabditis elegans Extracellulära blåsor

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikelspårningsanalys för kvantifiering och storleksbestämning av extracellulära blåsor

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Direkt stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi av extracellulära blåsor i tre dimensioner

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalbar isolering och rening av extracellulära vesiklar från Escherichia coli och andra bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Isolering och karakterisering av intakt fycobilisome i Cyanobakterier

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolering av mikroRNA från Tick Ex Vivo spottkörtelkulturer och extracellulära vesiklar

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...