Name: isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Yazarlar, i3S Bilimsel Platformları "Biyoarayüzler ve Nanoteknoloji" ve ulusal altyapı Portekiz Biyogörüntüleme Platformu'nun (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) bir üyesi olan "Histoloji ve Elektron Mikroskobu" nun desteğini kabul etmektedir. Ayrıca, TEM için ultra ince kesit boyama protokolünü optimize etmeye yardımcı olduğu için Prof. J. A. Gonzalez-Reyes'e (Córdoba Üniversitesi, İspanya) ve nanopartikül izleme analizi için Dr. Cecília Durães ve Dr. Ana Rita Pinto'ya (Porto Üniversitesi, Portekiz) teşekkür ederiz.
Bu çalışma, ABD Ulusal Bilim Vakfı (OCE-2049004'ten SJB'ye), Fundo Europeu de Desenvolvimento Bölgesel (FEDER) fonları tarafından COMPETE 2020 Operacional Rekabetçilik ve Uluslararasılaşma Programı (POCI), Portekiz, 2020 ve Portekiz fonları tarafından Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior tarafından POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO) projesi çerçevesinde finanse edilmiştir. Fundação para a Ciência e a Tecnologia, doktora bursu SFRH / BD / 130478 / 2017 (SL) ve FCT Investigator hibesi IF / 00256 / 2015 (PO) için de büyük ölçüde kabul edilmektedir. M.C.M.-M. Horizon 2020 Çerçeve Programı (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891) kapsamında Marie Skłodowska-Curie Bireysel Bursu (Yeniden Entegrasyon paneli) tarafından desteklenmiştir.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Hücre dışı veziküller (EV'ler), çapı ~ 20-400 nm arasında değişen, neredeyse tüm organizmalar tarafından çevrelerinesalınan küresel yapılardır 1,2,3. Veziküller bir lipit çift katmanlı tarafından sınırlandırılır ve kendilerini kopyalayamazlar. Gram-negatif bakterilerde, bu yapıların öncelikle dış zardan küçük kısımların 'ağartılması' ile ortaya çıktığı düşünülmektedir. Yine de, kamçı hareketi, hücre lizisi ve hem iç hem de dış membran malzemesinin salgılanması gibi diğer işlemler de veziküller üretebilir 4,5. EV'ler, lipitler, çözünür ve membran proteinleri, nükleik asitler ve metabolitler dahil olmak üzere çeşitli biyomoleküller içerebilir ve bu materyalihücreler arasında taşıyabilir 4,5,6. Bu özellikler göz önüne alındığında, EV'ler hücresel iletişim, biyofilm oluşumu, yatay gen transferi, konakçı-faj dinamikleri ve besin değişimi 4,6 dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik süreçlerdeki olası rollerini anlamak için çalışılmaktadır.
Siyanobakteriler, tek hücreli ve filamentli organizmalar da dahil olmak üzere büyük ve çeşitli bir Gram-negatif bakteri grubudur. Fizyolojilerini ve çeşitliliklerini 7,8, hizmet ettikleri kritik ekosistem işlevlerini9,10 ve biyoteknoloji için faydalarını anlamak da dahil olmak üzere birçok açıdan ilgi çekicidirler 11,12. Siyanobakteriler, deniz, tatlı su ve karasal ortamlarda serbest yaşayan organizmalar olarak veya yosunlar, eğrelti otları, bitkiler veya likenler ve süngerler ile simbiyotik ilişkilerde çok çeşitli habitatlarda bulunur13. Sucul ekosistemlerde çok önemli birincil üreticiler olarak hizmet ederler, oksijenik fotosentez 9,10 yoluyla oksijen ve organik karbon üretirler ve bazıları atmosferik azotu da sabitleyebilirler7. Prochlorococcus, Synechococcus ve Synechocystis dahil olmak üzere deniz ve tatlı su siyanobakterileri, laboratuvar koşullarında EV'ler üretir 14,15,16 ve siyanobakteriyel veziküller doğal ortamlarda da bulunabilir14,17. Siyanobakteriyel veziküllerin biyolojik ve ekolojik fonksiyonları bilinmemektedir, ancak bu alandaki daha ileri araştırmaların, siyanobakteriyel fizyoloji, farklılaşma, iletişim stratejileri, evrim ve trofik etkileşimler hakkındaki sorulara yeni bakış açıları sağlaması muhtemeldir. Ek olarak, siyanobakteriyel EV'lerin çeşitli biyomolekül kategorilerini taşıma kabiliyetinin ticari uygulamaları olabilir18,19.
Bu protokol, siyanobakteriyel hücre dışı vezikül biyolojisinin daha geniş bir incelemesini sağlamak ve teşvik etmek için siyanobakteriyel kültürlerden ve saha örneklerinden vezikülleri izole etme ve karakterize etme yöntemlerini açıklamaktadır. Burada açıklanan iş akışı, EV'leri diğer bakterilerden izole etme ve karakterize etme protokollerine benzer olsa da, siyanobakteriyel kültürler ve saha örnekleri tipik olarak konakçı ile ilişkili veya patojenik model sistemlerinde yaygın olarak gözlenenden daha düşük hücre ve vezikül konsantrasyonları içerir20,21,22. Bu nedenle, siyanobakteriyel EV'lerin çalışmaları, suşlar ve medya geçmişleri arasında daha fazla farklılık gösteren ekim ve vezikül izolasyonu için özel hususlar ve optimizasyonlar gerektirir. Tek bir protokol tüm suşlar, büyüme koşulları ve aşağı akış uygulamaları için eşit derecede iyi çalışmayacağından, araştırmacıların deneysel sorularını ele almak için en uygun yaklaşımları belirleyebilmeleri için birden fazla seçenek sunarız ve ilgili ödünleşimleri tartışırız.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Home-made buffer</td>
			<td>---</td>
			<td>Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl acetate solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td>Negative staining - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC9100XX</td>
			<td>Alternative option for centrifugal ultrafiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG11 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71150</td>
			<td>Transmission electron microscopy (TEM) grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000</td>
			<td>Commercial TEM grid glow discharger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder for vacuum system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>300-4000</td>
			<td>Reusable units with filter membrane support plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160; Grade I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-10X1ml</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate, Trihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td>Stain for use in electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MAP100C36</td>
			<td>For centrifugal ultrafiltration of small volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Pellicon 3 TFF Module</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX42P0060 or XX42P0080</td>
			<td>Alternative TFF option for concentrating large volume samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z00QSV0WW</td>
			<td>Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>LM14 or NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L80 XP</td>
			<td>Ultracentrifuge (or similar model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep / Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>Ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Centramate PE TFF holder</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>FS002K10</td>
			<td>TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07559-07</td>
			<td>Pump for driving large-scale TFF modules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piston Gradient Fractionator</td>
			<td>Biocomp Instruments</td>
			<td>152-001</td>
			<td>Automated density gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro99 medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of Prochlorococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P20495</td>
			<td>LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SN medium</td>
			<td>Home-made medium</td>
			<td>---</td>
			<td>Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250-100G</td>
			<td>Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW60Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>335650</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1mL Luer</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td>For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4602</td>
			<td>For vesicle isolation from cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Buffering agent for cyanobacterial growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>Or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type XIV protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClear tubes for the SW60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td>Single use ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td>
			<td>RMC Products,&#160; Boeckeler Instruments</td>
			<td>75501</td>
			<td>Microtome for ultra-thin sections - TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal 320 R centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Z654736</td>
			<td>This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum apparatus</td>
			<td>KNF Neuberger</td>
			<td>N026.3 AT.18</td>
			<td>Or any similar vacuum pump and trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VF20P4</td>
			<td>TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2&#181;m)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6717-9502</td>
			<td>Capsule filter for filtering large volumes of liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS) instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of cyanobacterial extracellular vesicles

Siyanobakteriler, küresel ekosistemlerde kritik rol oynayan ve temel biyoteknoloji modelleri olarak hizmet eden çeşitli fotosentetik, Gram-negatif bakteri grubudur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, hem deniz hem de tatlı su siyanobakterilerinin, mikropların dış yüzeyinden salınan küçük zara bağlı yapılar olan hücre dışı veziküller ürettiğini göstermiştir. Veziküller muhtemelen çeşitli biyolojik süreçlere katkıda bulunurken, siyanobakteriyel biyolojideki spesifik fonksiyonel rolleri büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu alandaki araştırmaları teşvik etmek ve ilerletmek için, siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izole edilmesi, konsantre edilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Mevcut çalışma, vezikülleri Prochlorococcus, Synechococcus ve Synechocystis'in büyük kültürlerinden başarıyla izole eden metodolojileri tartışmaktadır. Bu suşlardan vezikül örneklerini ölçmek ve karakterize etmek için yöntemler sunulmuştur. Vezikülleri sucul alan örneklerinden izole etmek için yaklaşımlar da açıklanmaktadır. Son olarak, siyanobakteriyel vezikül saflaştırma ile karşılaşılan tipik zorluklar, farklı aşağı akış uygulamaları için metodolojik hususlar ve yaklaşımlar arasındaki dengeler de tartışılmaktadır.

Şekil 1, siyanobakteriyel vezikül izolasyon sürecine genel bir bakış sunarak, burada açıklanan protokolün temel yönlerini vurgulamaktadır. Siyanobakteriyel biyokütlenin küçük parçacık (vezikül) fraksiyonundan ayrılmasını, vezikül örneğini yoğunlaştırmayı ve vezikül izolasyonunu ve saflaştırmasını (Şekil 1, adım 2 ila 4) detaylandıran adımlar, veziküllerin tekrarlanabilir preparatlarını elde etmek için kritik öneme sahiptir. Şekil 2, siyanobakteri Synechocystis sp. PCC 6803'ten hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonundan temsili sonuçlar sunmaktadır. Bu siyanobakterinin dış zarının, ultrasantrifüjleme yoluyla doğrudan peletleme yoluyla toplanan vezikül örneklerine karakteristik turuncu renklenme sağlayan karotenoidler31 içerdiği gösterilmiştir (Şekil 2A). Vezikül peleti yeniden askıya alındıktan sonra, veziküller transmisyon elektron mikroskobu (TEM), uranil asetat ile numunelerin negatif boyanması (Şekil 2B) veya ultra ince kesitlerin gözlemlenmesi (Şekil 2C) ile incelenebilir. Vezikül boyutu dağılımı ve konsantrasyonu, dinamik ışık saçılması (DLS) (Şekil 2D) ve nanopartikül izleme analizleri (NTA) (Şekil 2E) kullanılarak değerlendirilebilir. Tarif edilen protokolle, mL başına tipik olarak ~ 3.5 ± 1.0 x 108 nanopartikül, 1.0'lık bir OD730'da üstel olarak büyüyen bir Synechocystis sp. PCC 6803 kültüründe elde edildi. İzole edilmiş veziküllerin fiziksel karakterizasyonunu tamamlamak için izole EV'lerin biyokimyasal analizleri yapılabilir. Örnek olarak, saflaştırılmış Synechocystis sp. PCC 6803 vezikülleri bir SDS-poliakrilamid jel üzerinde ayrıldı ve lipopolisakkaritler (LPS; Şekil 2F). LPS dış membran32'ye özgü olduğundan, LPS tespiti membrana bağlı veziküllerin varlığını doğrulayabilir ve aynı suş33'ten preparatlar arasındaki göreceli vezikül içeriğini analiz etmek için bir belirteç görevi görebilir. Düşük ve yüksek moleküler ağırlıklı LPS'lerin göreceli bolluğunun incelenmesi, numuneler arasındaki vezikül bileşimindeki değişiklikleri gösterebilir34,35.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> Şekil 1: Siyanobakteriyel EV izolasyonu ve karakterizasyonu için kullanılan deneysel prosedürler. Büyüyen kültürlerin şematik gösterimleri (1) ve siyanobakteriyel biyokütlenin büyüme ortamından ayrılması (2). Veziküller içeren hücresiz örnekler konsantre edilir (3) ve daha sonra EV'ler izole edilir ve saflaştırılır (4). Uygulamaya bağlı olarak, vezikül preparatları, iletim elektron mikroskobu (TEM), nanopartikül izleme analizi (NTA), dinamik ışık saçılması (DLS) ve lipopolisakkarit (LPS) profillemesinin bir veya bir kombinasyonu kullanılarak karakterize edilebilir (5). RT, oda sıcaklığı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> Şekil 2: Siyanobakteri Synechocystis sp. PCC 6803 için hücre dışı vezikül izolasyonu ve karakterizasyonunun temsili sonuçları. (A) Konsantre hücresiz hücre dışı ortamın ultrasantrifüjlenmesinden sonra elde edilen hücre dışı vezikül peletinin (EVs peleti) fotoğrafı, 600 mL Synechocystis sp. PCC 6803 kültüründen 1.0-1.5'lik bir OD730'a büyütüldü. Dış zarda bulunan karotenoidlerden türetilen vezikül peletinin tipik turuncu renklenmesine dikkat edin. (B,C) Synechocystis sp. PCC 6803 vezikül örneklerinin negatif boyanmış (B) ve ultra ince kesitlerinin (C) transmisyon elektron mikroskobu (TEM) fotoğrafları. Ölçek çubukları: sırasıyla 200 nm ve 50 nm. Örnekler, 80 kV'ta çalıştırılan bir transmisyon elektron mikroskobu üzerinde görselleştirildi. (D) Vezikül hacminin dağılımını vezikül çapının bir fonksiyonu olarak gösteren tipik dinamik ışık saçılması (DLS) grafiği (nm cinsinden). Renkli çizgiler, aynı numunenin üç teknik çoğaltma ölçümünden elde edilen verileri gösterir. (E) Synechocystis hücre dışı vezikül boyutu dağılımının temsili nanopartikül izleme analizi (NTA) verileri (nm cinsinden). Siyah çizgi üç teknik kopyanın ortalamasını gösterir ve kırmızı çizgiler ortalamanın standart hatasını temsil eder. (F) Lipopolisakkaritler (LPS) profili, vezikül preparatının %16 (w/v) SDS-poliakrilamid jel üzerinde elektroforez ile ayrılması ve ticari bir LPS boyama kiti ile boyanmasından sonra tespit edilmiştir. Sırasıyla kaba ve pürüzsüz LPS formlarına karşılık gelen düşük ve yüksek moleküler ağırlıklı LPS tespit edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: R hesaplanacak denklem. Üstel büyüme sırasında iki nokta arasında nesil başına hücre başına üretilen vezikül sayısı (tipik olarak zaman akışının başlangıcı ve sonu) bu denklem kullanılarak belirlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles at JoVE.com

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Mevcut protokol, siyanobakteriyel kültürlerden hücre dışı veziküllerin izolasyonu, konsantrasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı açıklamalar sunmaktadır. Vezikülleri farklı ölçeklerdeki kültürlerden arındırmaya yönelik yaklaşımlar, metodolojiler arasındaki ödünleşimler ve saha örnekleriyle çalışmak için dikkat edilmesi gerekenler de tartışılmaktadır.

Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Bu protokol sadece farklı ölçeklerde kültürden veziküllerin arındırılması için yaklaşımlar, ödünleşimler, metodolojiler arasındaki farklılıklar ve aynı zamanda saha örnekleriyle çalışmak için dikkate alınması gereken yaklaşımları göstermesi açısından önemlidir. Siyanobakteriler benzersiz vezikül örnekleme ve analiz zorlukları sunar. Bu teknikler, vezikülleri kültürden ve çevresel örneklerden başarıyla izole etmiş ve yoğunlaştırmıştır.500 mililitreden daha az numuneleri konsantre etmek için, 15 ila 20 mililitrelik ultrafiltrasyon santrifüj konsantrifüjlü konsantratörlerin Tip 1 ultra saf dereceli suyla durulanması ile başlayın. Konsantratörleri santrifüje yükleyin ve dört santigrat derecede 4.400 x g'de döndürün. Çalıştırmayı atın ve adımı en az iki kez tekrarlayın.Süper natant numuneyi suyla durulanmış bir yoğunlaştırıcıya yükleyin ve aynı koşullar altında döndürün. Numune 15 ila 30 mililitrelik son bir hacme konsantre olana kadar bu adımı tekrarlayın. 500 mililitreden fazla bir hacme konsantre olmak için, aparatı makalede açıklandığı gibi kurarak teğetsel akış filtrasyonu gerçekleştirin.Giriş hattına peristaltik bir pompa takın ve ayarlanabilir kelepçeleri retentat hattına yerleştirin. Teğetsel akış filtrasyonunu makalede açıklandığı gibi sterilize edin, ardından cihazı bir litre Tip 1 ultra saf dereceli suyla yıkayın. Numune haznesine 0,2 mikrondan az filtrat ekleyin.Filtrat hatlarından çıkışı artırmak için retentate hattındaki pompa hızını ve geri basınç seviyelerini yavaşça artırın. Teğetsel akış filtrasyonunu çalıştırmaya devam edin ve malzeme çıkarıldıkça rezervuarı kültür süpernatantı ile doldurun. Rezervuardaki hacim, hava kabarcıkları sokmadan giriş hattına akışı sürdürmek için gereken mümkün olan en düşük miktara ulaştığında numuneyi yoğunlaştırmayı bırakın.Çıkış çizgisini bir kelepçe ile kapatın. Retentate hattı üzerindeki geri basıncı kaldırın. Konsantre süpernatantı filtreden 10 dakika boyunca yeniden dolaştırın, geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için devridaim hızını dakikada 20 ila 40 mililitre arasında azaltın.Retentat hattını temiz bir kaba taşıyın, giriş hattını numuneden çıkarın ve konsantre malzemeyi toplayın. Pipet kullanarak numune haznesinde kalan malzemeleri geri kazanın. Konsantre süpernatantı 0,2 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün.Gerekirse, vezikül saflaştırmaya geçmeden önce son konsantreyi yaklaşık üç hafta boyunca dört santigrat derecede saklayın. Konsantre kültür numunesini peletlemek için temiz bir ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin ve tüpün doldurulduğundan emin olmak için temiz ortam veya tampon ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı bir pipetle çıkarın.Pelet edilmiş malzemeyi taze kültür ortamı veya 1X fosfat tamponlu salin gibi yıkama tamponu ile tekrar yıkayın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Bir mililitrelik pipetle nazik pipetleme yaparak taze kültürdeki son peleti yeniden askıya alın ve temiz bir kaba aktarın. Yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme yapmak için, makalede açıklandığı gibi iyodiksantal stokları hazırlayın.% 45'lik bir iyodiksanol çözeltisi oluşturmak için 4X tamponunun bir kısmını% 60 iyodiksanol stoğunun üç kısmı ile karıştırın. 40, 35, 30, 25, 20, 15 ve% 10 nihai iyodiksanol konsantrasyonlarının gradyan ortam stoklarını oluşturmak için% 45 iyodiksanol ile 1X tampon ile seyreltin. Daha sonra, tüm bu iyotiksanol gradyan stoklarının eşit miktarlarını, tüm tüp hacmini kullanarak bir ultrasantrifüj tüpüne dikkatlice yerleştirin.Santrifüjlemeden sonra, her biri yaklaşık 4,5 mililitrelik bir gradyan için 0,5 mililitrelik fraksiyonları, dikkatlice pipetleyerek veya bir fraksiyon toplayıcı kullanarak toplayın. Analitik terazi ve kalibre edilmiş pipet kullanarak her fraksiyonun yoğunluğunu mililitre başına gram cinsinden belirleyin. Numuneyi tüpten çıkarın, ağırlığı belirleyin ve numuneyi tüpe geri verin.Tek tek fraksiyonları yeni bir tüpte temiz tamponla seyreltin, ardından temiz bir ortam veya tampon yıkama yapın. Dikkatlice beş mikrolitre vezikül uygulayın ve beş dakika bekletin. Bir ızgaranın kenarına bir parça temiz filtre kağıdına dokunarak numuneyi çıkarın.Plastik filmle kaplı düz bir yüzeye 20 ila 50 mikrolitre %2 uranil asetat pipet verin. Ardından ızgarayı iki dakika boyunca üzerine yerleştirin. Filtre kağıdı kullanarak uranil asetatı çıkarın ve yıkamak için bir damla ultra saf su üzerinde kısa bir süre yüzün.Temiz bir şırınga kullanarak odayı ultra saf suyla doldurun ve hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kamerayı başlat'a tıklayın ve parmak izinin etrafındaki odanın en uygun bölgesini görselleştirin. Ekran kazancı ve kamera seviyesi kaydırıcılarını maksimuma doğru kaydırın, ardından en soluk parçacıkları görmek için en düşük seviyeye düşürün.Partiküllerin görüş alanı boyunca kabaca eşit derecede görünür olmasını sağlamak için odağı gerektiği gibi ayarlayın ve oda temizlenene kadar ultra temiz suyla yıkamaya devam edin. Vezikül örneğini bir mililitrelik bir şırınga kullanarak odaya ekleyin ve alım ayarlarını onaylayın. SÇP açılır kutusundan 'standart ölçüm'ü seçin ve ayarları değiştirerek her biri 60 saniyelik videolardan oluşan en az üç teknik kopya toplayın.'Komut dosyası oluştur' tuşuna basın ve istemleri izleyin ve yaklaşık 100 mikrolitre numuneyi çoğaltmalar arasındaki odaya itin. 'Analiz'e tıklayarak partikül parametrelerini belirleyin ve deneyi açın ve örnek dosyayı yükleyin. Seçilen dosyaları işle'yi seçin ve analizin tamamlanmasını bekleyin.Siyanobakteri Synechocystis sp. PCC6803'ten hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu, dış zarın, ultrasantrifüjleme yoluyla doğrudan peletleme yoluyla toplanan vezikül örneklerine karakteristik turuncu renklenme sağlayan karotinoidler içerdiğini göstermiştir. Resudükte vezikül peleti, transmisyon elektron mikroskobu ile uranil asetat ile numuneleri negatif boyayarak veya ultra ince kesitleri gözlemleyerek incelendi.Vezikül boyutu dağılımı ve konsantrasyonu, dinamik ışık saçılması ve nanopartikül izleme analizleri kullanılarak değerlendirildi. Saflaştırılmış Synechocystis sp. PCC6803 vezikülleri sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel üzerinde ayrıldı ve lipopolisakkaritler için boyandı.Teğetsel akış filtrasyonunun çalıştığından ve veziküllerin yoğunlaştığından emin olmak için konsantre vezikül numunesinden önce ve sonra numuneler alınmalıdır. Daha sonra nanopartikül izleme analizini kullanarak her iki numuneyi de ölçmeniz gerekir. Küçük parçacıkların kültür ve çevresel numunelerden ayırt edilmesini ve izolasyonunu iyileştirmek için bu yöntemi boyut dışlama kromatografisi veya asimetrik alan akışı fraksiyonasyonu gibi diğer yaklaşımlarla birleştirmek için gelecekteki çabalar gereklidir.Bu teknik, siyanobakteri veziküllerini ve bu veziküllerin siyanobakteriyel biyolojideki spesifik fonksiyonel rollerini incelemek için yararlıdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Siyanobakterilerde Bozulmamış Fitoidinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

MikroRNA'ların Kene Ex Vivo Tükürük Bezi Kültürlerinden ve Hücre Dışı Veziküllerden İzolasyonu

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...