Name: a human corneal organ culture model of descemet's stripping only with accelerated healing stimulated by engineered fibroblast growth factor 1
Uploaded: 2022-07-22T13:30:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet's Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1 at JoVE.com

Financiering voor dit werk werd ondersteund door Trefoil Therapeutics en NIH NCATS TRND CRADA #2016-04. De auteurs willen Tony Wong bedanken voor histopathologisch advies en diensten, het Nikon Imaging Center van UC San Diego voor het gebruik van hun confocale microscoop en Drs. Natalie Afshari en Marian Macsai voor hun advies over chirurgische techniek. Daarnaast zijn de auteurs de donoren van ogen en de oogbanken dankbaar voor het verstrekken van hoornvliezen.

Dit werk gebruikte bestaande specimens zonder identificatie van proefpersonen en is vrijgesteld van IRB-goedkeuring op grond van 45 CFR 46.101 (b) (4).
Menselijke donorhoornvliezen werden verkregen uit verschillende oogbanken in de VS (zie Tabel met materialen). Cornea's werden individueel dystrofisch beoordeeld door de oogbanken op basis van bevindingen zoals guttae, pleomorfisme, polymegathisme en / of lage ECD bij spiegelende evaluatie. Figuur 1 toont Trypan Blue-kleuring in het hoornvlies tijdens het maken van de wond, onmiddellijk na het strippen en na 2 weken in cultuur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig01.jpg"> Figuur 1: Diagram dat het hoornvlies weergeeft tijdens het maken van de wond, onmiddellijk na het strippen en na 14 dagen in cultuur zoals gevisualiseerd door Trypan Blue. De vermindering van het bevlekte gebied tussen deze tijdspunten werd gemeten om het niveau van genezing te bepalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
1. Wondvorming
<ol><li>Verwijder met behulp van een steriele tang het hoornvlies uit de media en spoel in 1x PBS om restmedia en celresten te verwijderen. Plaats na het spoelen de endotheelzijde van het hoornvlies naar boven op het deksel van een petrischaaltje.</li>
	<li>Pipetteer 30 μL Trypan Blue in een goed geputte schaal. Doop een nieuwe biopsiestoot van 4 mm in Trypan Blue en tik het overtollige af.</li>
	<li>Plaats met beide handen de stoot boven het midden van het hoornvlies en laat deze recht naar beneden op het endotheeloppervlak zakken, waarbij minimale druk wordt uitgeoefend.</li>
	<li>Zonder de positie of druk op het hoornvlies te veranderen, verschuift u de stoot naar één hand en grijpt u met de pas bevrijde hand naar een tang. Gebruik de tang om het hoornvlies op zijn plaats te houden terwijl je de biopsiestoot verschillende keren ongeveer 90° heen en weer draait.</li>
	<li>Til de stoot recht omhoog van het hoornvlies en zet opzij.</li>
	<li>Spoel nogmaals in 1x PBS om overtollige Trypan Blue te verwijderen.</li>
</ol>2. Descemet's strippen
<ol><li>Breng het hoornvlies op een petrischaaldeksel over in een ontleedkijker. OPMERKING: Laat het hoornvlies niet langer dan 5 minuten drogen. Als er meer tijd nodig is om het proces te voltooien, spoel dan opnieuw in 1x PBS om het endotheel te hydrateren.</li>
	<li>Houd het hoornvlies op zijn plaats met een gebogen tang en scoor het membraan van Descemet door de punt van een scherpe naald van 30 G lichtjes langs de ring van Trypan Blue te slepen die door de biopsiestoot is achtergelaten. Gebruik minimale druk om te voorkomen dat het onderliggende stroma wordt verstoord.</li>
	<li>Gebruik met een Sinskey-haak zachte schepbewegingen om het membraan van Descemet rond de wondrand op te tillen en af te pellen, waarbij je naar het midden van de laesie toewerkt. OPMERKING: Het membraan van Descemet zou met zeer weinig weerstand moeten komen. Als er moeilijkheden worden ondervonden, trekt men waarschijnlijk stroma op. Als dit gebeurt, begin dan opnieuw en til vanaf een nieuw punt langs de wondrand.</li>
	<li>Zodra het grootste deel van het membraan van Descemet van het stroma is gescheiden, gebruikt u gorovoy-tangen om het membraan te verwijderen en opzij te zetten.</li>
	<li>Onderzoek het gestripte gebied op eventuele resterende stukjes membraan en verwijder met gorovoy-tang.</li>
</ol>3. Trypan Blauwe kleuring
OPMERKING: Na het strippen van Descemet, kleur het hoornvlies met Trypan Blue om het wondgebied te visualiseren.
<ol><li>Breng het hoornvlies op een petrischaaldeksel terug naar de bioveiligheidskast en spoel af in 1x PBS met 0,01% (w / v) CaCl2 en MgCl2 om celresten te verwijderen en een strakke hechting van resterende CECs aan het intacte Descemet-membraan te vergemakkelijken.</li>
	<li>Doe het hoornvlies in een welgemeende schaal en pipetteer 30 μL Trypan Blue op de endotheellaag gedurende 30 s.<ol>
<li>Gebruik een tang om het hoornvlies voorzichtig te laten schommelen om ervoor te zorgen dat het hele endotheeloppervlak bedekt is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spoel overtollig Trypan Blue af in 1x PBS met 0,01% (w/v) CaCl2 en MgCl2 en beeld het gekleurde hoornvlies af onder een ontleedmicroscoop voor het tijdspunt van dag 0.<ol>
<li>Zorg ervoor dat het hoornvlies zodanig in balans is dat het licht gelijkmatig wordt doorgelaten en dat de positionering kan worden gerepliceerd over tijdspunten. OPMERKING: Tang kan worden gebruikt om het hoornvlies op zijn plaats te houden tijdens het afbeelden indien nodig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cultuurperiode
<ol><li>Kweekhoornvliezen in een zesputige plaat met laagserummedia bestaande uit OptiMEM; 1x insuline, transferrine en selenium; 1x antibioticum/antimycotisch; 0,02 mg/ml CaCl2; 0,2 mg/ml ascorbinezuur; en 0,8% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum. Kweek het linker hoornvlies in 8 ml laagserummedia alleen en het rechter hoornvlies in 8 ml laagserummedia aangevuld met 100 ng /ml eFGF1 (NM141).<ol>
<li>Incubeer bij 37 °C met 6% CO2 gedurende 14 dagen met dagelijkse mediawisselingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal de Trypan Blue-kleuringsprocedure op dag 3, 6, 9, 12 en 14 en breng elk hoornvlies onmiddellijk na de kleuring in beeld. Zorg ervoor dat de camera-instellingen consistent blijven op alle tijdstippen.</li>
	<li>Voeg op dag 12 10 μM EdU toe aan zowel controle- als eFGF1 (NM141)-aangevulde media en incubeer gedurende 48 uur om prolifererende cellen te labelen. Vernieuw media met EdU opnieuw toegevoegd op dag 13.</li>
	<li>Gebruik op dag 14, 48 uur na de toevoeging van EdU, Trypan-vlek en beeldhoornvliezen zoals gewoonlijk, behalve in plaats van 1x PBS met CaCl2 en MgCl2, gewoon 1x PBS voor spoelingen om te voorkomen dat het calcium interageert met de Alizarin Red-vlek.</li>
</ol>5. Alizarine Rode kleuring
<ol><li>Bereid op dag 14 5% Alizarin Red in 0,9% zoutoplossing. OPMERKING: Alizarine Red lost niet volledig op in een zoutoplossing. Bij het combineren, vortexoplossing en gesteente gedurende ten minste 1 uur. Vortex nogmaals en filter voor gebruik om onopgeloste deeltjes te verwijderen.</li>
	<li>Zodra trypan-kleuring en beeldvorming zijn voltooid, brengt u hoornvliezen over naar een goed gewelfde schaal en voegt u 200 μL Alizarin Red toe aan het endotheeloppervlak van elk hoornvlies.<ol>
<li>Vlek gedurende 2 minuten, spoel vervolgens elk hoornvlies in een petrischaal van 1x PBS om overtollig Alizarin Red te verwijderen voordat je het in een zes-well plaat plaatst die vooraf is gevuld met 8 ml 1x PBS gedurende twee wasbeurten van 5 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel na de tweede wasbeurt het gestripte gebied van elk hoornvlies voor onder een ontleedmicroscoop. OPMERKING: In tegenstelling tot trypan-beeldvorming, kunnen hoornvliezen in 1x PBS worden achtergelaten om alizarinekleuring in beeld te brengen om te voorkomen dat ze tijdens het proces uitdrogen.</li>
</ol>6. Fixatie en permeabilisatie
<ol><li>Zodra alizarinebeelden zijn vastgelegd, brengt u hoornvliezen over op een plaat met 12 putten en wast u gedurende 30 minuten 4 ml 1x PBS met 0,05% Tween-20 (PBS-T) om eventuele deeltjes uit weefsel te verwijderen voorafgaand aan de fixatie.</li>
	<li>Bevestig hoornvliezen in 4 ml van 4% PFA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Permeabiliseer cellen gedurende 5 minuten in 4 ml 1x PBS met 1% Triton X-100 en was vervolgens drie keer in 4 ml gewone 1x PBS gedurende 30 minuten elk.</li>
</ol>7. Immunohistochemie
<ol><li>Blok hoornvliezen gedurende 1 uur bij 37°C in 4 ml 1x PBS met 2% runderserumalbumine en 2% geitenserum.</li>
	<li>Incubeer in 1 ml blokkerende oplossing met 2,5 μg/ml primair antilichaam muis anti-ZO-1 gedurende 1 uur bij 37 °C en was vervolgens driemaal in 4 ml van 1x PBS gedurende 30 minuten elk. OPMERKING: De plaat kan worden gekanteld tijdens antilichaamkleuring om het benodigde volume reagentia te minimaliseren. Zorg er wel voor dat het hele hoornvlies volledig is ondergedompeld in antilichaamoplossing.</li>
	<li>Voer de EdU Click-iT-reactie uit met een cocktail met 0,88 mg / ml ascorbinezuur, 0,26 mg / ml CuSO4 en 2,5 μM Alexa Fluor 488 azide.<ol>
<li>Reactiecomponenten voorbereiden<ol>
<li>Voeg 500 μL 1x PBS toe aan 88 mg ascorbinezuur en vortex totdat deze zijn opgelost.</li>
			<li>Voeg 840 μL gedeïoniseerd water toe aan 44 mg CuSO4 en vortex totdat het is opgelost.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereid de cocktail door de volgende reagentia toe te voegen aan 6 ml 1x PBS in deze volgorde, waarbij de buis wordt omgekeerd om na elke toevoeging te mengen: 30 μL ascorbinezuuroplossing, 30 μL CuSO4-oplossing en vervolgens 15 μL Alexa Fluor 488 OPMERKING: Eenmaal bereid, is deze oplossing lichtgevoelig. Voor de rest van het protocol moeten hoornvliezen waar mogelijk tegen licht worden beschermd.</li>
		<li>Voeg 1 ml EdU-reactiecocktail toe aan elk hoornvlies en reageer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 4 ml van 10 μg/ml Hoechst 33342 toe aan elk hoornvlies en reageer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en was vervolgens drie keer in 1x PBS-T gedurende 30 minuten elk.</li>
	<li>Incubeer in 1 ml blokkerende oplossing met 2 μg / ml Alexa Fluor 555 gelabeld geiten-anti-muis IgG gedurende 1 uur bij 37 ° C en was vervolgens drie keer in 1x PBS-T gedurende 30 minuten elk.</li>
	<li>Store cornea's bij 4 °C in 4 ml van 1x PBS met 1% anti / anti, 0,1% ciprofloxacine en 0,1% amfotericine B om microbiële groei te voorkomen.</li>
	<li>Monteer bij het uitvoeren van confocale beeldvorming hele hoornvliezen in 200 μL montagemedium op glazen dia's met afgeplakte coverslip om af te vlakken.</li>
</ol>8. Trypan Beeldanalyse
<ol><li>Voer alle beeldanalyses uit met behulp van NIH's open-source software ImageJ. Open een afbeelding met Bestand > Openen en klik op Afbeelding > > kleurdrempel aanpassen.</li>
	<li>Gebruik de schuifregelaars "Hue" om alleen het blauwe bereik te omvatten en pas de bovenste schuifregelaar "Helderheid" helemaal naar links aan om meer van het gekleurde gebied op te nemen. OPMERKING: Als deze actie ertoe leidt dat delen van de afbeelding die niet met Trypan zijn gekleurd, worden opgenomen, kan de schuifregelaar "Helderheid" worden teruggebracht naar het oorspronkelijke niveau.</li>
	<li>Pas langzaam de bovenste schuifregelaar "Verzadiging" aan totdat de drempel het gekleurde gebied nauwkeurig omlijnt. OPMERKING: Het is handig om een kopie van de originele afbeelding open te hebben om naar te verwijzen tijdens dit proces.</li>
	<li>Klik op de knop Selecteren in het menu met de kleurdrempel en gebruik vervolgens het selectiepenseel om gebieden buiten de wond die zijn opgeraapt, te deselecteren.</li>
	<li>Klik op Analyseren > Meten om het bevlekte gebied in pixels te rapporteren.</li>
	<li>Schakel alles uit met Bewerken > selectie > Selecteer Geen en gebruik het gereedschap voor ovale selectie om de limbus zo dicht mogelijk bij elkaar te plaatsen en klik vervolgens op > meting analyseren om het gebied van het hoornvlies in pixels te rapporteren. OPMERKING: Helderheid kan tijdelijk worden verhoogd om te helpen bij het visualiseren van de limbus als dit deel van het beeld te donker is.</li>
	<li>Registreer gebiedswaarden en deel het bevlekte gebied door het gebied van het hele hoornvlies en vermenigvuldig vervolgens met 100 om het percentage gekleurd te berekenen.</li>
	<li>Herhaal dit proces nog twee keer voor elke afbeelding en neem vervolgens het gemiddelde van de drie metingen.</li>
</ol>9. Statistische analyse
<ol><li>Zodra alle afbeeldingen zijn geanalyseerd, deelt u het gemiddelde percentage bevlekt op dag 14 door het percentage gekleurd op dag 0 om het resterende niet-genezen gebied te bepalen. Trek dit bedrag af van 100% om het percentage van het gestripte gebied te berekenen dat gedurende 14 dagen is genezen.</li>
	<li>Gebruik een gepaarde t-test om het percentage genezen waarden tussen controle- en behandelingsgroepen te vergelijken.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eghrari, A. O., Gottsch, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuchs'+corneal+dystrophy.">Fuchs' corneal dystrophy.</a> Expert Review of Ophthalmology. 5 (2), 147-159 (2010).</li><li>Ku, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+loss+in+penetrating+keratoplasty,+endothelial+keratoplasty,+and+deep+anterior+lamellar+keratoplasty.">Endothelial cell loss in penetrating keratoplasty, endothelial keratoplasty, and deep anterior lamellar keratoplasty.</a> Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (4), 199 (2017).</li><li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+survey+of+corneal+transplantation+and+eye+banking.">Global survey of corneal transplantation and eye banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Braunstein, R. E., Airiani, S., Chang, M. A., Odrich, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+edema+resolution+after+&amp;#34;descemetorhexis&amp;#34.">Corneal edema resolution after &amp;#34;descemetorhexis&amp;#34.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 29 (7), 1436-1439 (2003).</li><li>Pan, J. C., Eong, K. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+resolution+of+corneal+oedema+after+inadvertent+'descemetorhexis'+during+cataract+surgery.">Spontaneous resolution of corneal oedema after inadvertent 'descemetorhexis' during cataract surgery.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 34 (9), 896-897 (2006).</li><li>Shah, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+corneal+clearing+after+Descemet's+stripping+without+endothelial+replacement.">Spontaneous corneal clearing after Descemet's stripping without endothelial replacement.</a> Ophthalmology. 119 (2), 256-260 (2012).</li><li>Ziaei, M., Barsam, A., Mearza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+corneal+clearance+despite+graft+removal+in+Descemet+stripping+endothelial+keratoplasty+in+Fuchs+endothelial+dystrophy.">Spontaneous corneal clearance despite graft removal in Descemet stripping endothelial keratoplasty in Fuchs endothelial dystrophy.</a> Cornea. 32 (7), 164-166 (2013).</li><li>Huang, M. J., Kane, S., Dhaliwal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Descemetorhexis+without+endothelial+keratoplasty+versus+DMEK+for+treatment+of+fuchs+endothelial+corneal+dystrophy.">Descemetorhexis without endothelial keratoplasty versus DMEK for treatment of fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Cornea. 37 (12), 1497 (2018).</li><li>Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+corneal+clearance+with+the+use+of+a+rho-kinase+inhibitor+after+descemetorhexis+without+endothelial+keratoplasty+for+Fuchs+endothelial+corneal+dystrophy.">Pilot study of corneal clearance with the use of a rho-kinase inhibitor after descemetorhexis without endothelial keratoplasty for Fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Cornea. 40 (7), 899-902 (2021).</li><li>Macsai, M. S., Shiloach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+topical+rho+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+Fuchs+dystrophy+after+Descemet+stripping+only.">Use of topical rho kinase inhibitors in the treatment of Fuchs dystrophy after Descemet stripping only.</a> Cornea. 38 (5), 529-534 (2019).</li><li>Moloney, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Descemetorhexis+without+grafting+for+Fuchs+endothelial+dystrophy-supplementation+with+topical+ripasudil.">Descemetorhexis without grafting for Fuchs endothelial dystrophy-supplementation with topical ripasudil.</a> Cornea. 36 (6), 642-648 (2017).</li><li>Thalmann-Goetsch, A., Engelmann, K., Bednarz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+the+effects+of+different+growth+factors+on+migration+of+bovine+corneal+endothelial+cells+during+wound+healing.">Comparative study on the effects of different growth factors on migration of bovine corneal endothelial cells during wound healing.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 75 (5), 490-495 (1997).</li><li>Landshman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cat+corneal+endothelium+induced+in+vivo+by+fibroblast+growth+factor.">Regeneration of cat corneal endothelium induced in vivo by fibroblast growth factor.</a> Experimental Eye Research. 45 (6), 805-811 (1987).</li><li>Lee, J., Blaber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+functional+half-life+of+fibroblast+growth+factor-1+by+recovering+a+vestigial+disulfide+bond.">Increased functional half-life of fibroblast growth factor-1 by recovering a vestigial disulfide bond.</a> Journal of Proteins &amp; Proteomics. 1, 37-42 (2010).</li><li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+cysteine-free+form+of+human+fibroblast+growth+factor-1+for+&amp;#34;second+generation&amp;#34;+therapeutic+application.">Engineering a cysteine-free form of human fibroblast growth factor-1 for &amp;#34;second generation&amp;#34; therapeutic application.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (4), 1444-1453 (2016).</li><li>Eveleth, D., Pizzuto, S., Weant, J., Jenkins-Eveleth, J., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+human+corneal+endothelia+in+organ+culture+stimulated+by+wounding+and+the+engineered+human+fibroblast+growth+factor+1+derivative+TTHX1114.">Proliferation of human corneal endothelia in organ culture stimulated by wounding and the engineered human fibroblast growth factor 1 derivative TTHX1114.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: the Official Journal of the. 36 (9), 686-696 (2020).</li><li>TTHX1114(NM141) in Combination With DWEK/DSO. ClinicalTrials.gov Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04676737?term=TTHX1114&amp;draw=2&amp;rank=2">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04676737?term=TTHX1114&amp;draw=2&amp;rank=2</a> (2020)</li><li>Soh, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicative+factors+for+corneal+endothelial+cell+migration).">Predicative factors for corneal endothelial cell migration).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (2), 338-348 (2016).</li><li>van Dooren, B. T. H., Beekhuis, W. H., Pels, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+trypan+blue+with+human+corneal+cells.">Biocompatibility of trypan blue with human corneal cells.</a> Archives of Ophthalmology. 122, (2004).</li><li>Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+Factors+for+Corneal+Clearance+After+Descemetorhexis+Without+Endothelial+Keratoplasty.">Predictive Factors for Corneal Clearance After Descemetorhexis Without Endothelial Keratoplasty.</a> Cornea. 37 (2), 736-742 (2018).</li><li>Borkar, D. S., Veldman, P., Colby, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Fuchs+endothelial+dystrophy+by+Descemet+stripping+without+endothelial+keratoplasty.">Treatment of Fuchs endothelial dystrophy by Descemet stripping without endothelial keratoplasty.</a> Cornea. 35 (10), 1267-1273 (2016).</li><li>Amano, S., Mimura, T., Yamagami, S., Osakabe, Y., Miyata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+corneas+reconstructed+with+cultured+human+corneal+endothelial+cells+and+human+corneal+stroma.">Properties of corneas reconstructed with cultured human corneal endothelial cells and human corneal stroma.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 49 (6), 448-452 (2005).</li><li>Rolev, K., O&#700;Donovan, D. G., Coussons, P., King, L., Rajan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+of+human+corneal+endothelial+cell+transplantation+using+an+in+vitro+human+corneal+model.">Feasibility study of human corneal endothelial cell transplantation using an in vitro human corneal model.</a> Cornea. 37 (6), 778-784 (2018).</li><li>Spinozzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+and+transplantation+of+human+corneal+endothelial+cells+cultured+on+biocompatible+carriers.">In vitro evaluation and transplantation of human corneal endothelial cells cultured on biocompatible carriers.</a> Cell Transplantation. 29, 1-11 (2020).</li><li>Garcin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-month+storage+of+human+corneas+in+an+active+storage+machine.">Three-month storage of human corneas in an active storage machine.</a> Transplantation. 104 (6), 1159-1165 (2020).</li></ol>

DDE, SP, GD en JW zijn werknemers van en houden aandelen in Trefoil Therapeutics, Inc. DDE is uitvinder van patenten voor eFGF1 (NM141).

Veel oogartsen maken zich zorgen over het aanbevelen van DSO aan hun patiënten om twee belangrijke redenen: 1) het langdurige genezingsproces en 2) gebrek aan gegevens (DSO is een nieuw concept op het gebied van oogheelkundige chirurgie). Het onderzoek dat we hebben gepresenteerd, zou van groot nut zijn om beide zorgen weg te nemen. Op basis van gegevens uit deze studie en andere, heeft de FDA een fase 2 klinische studie goedgekeurd waarbij eFGF1 (NM141) zal worden toegediend met verschillende doseringsschema's aan patiënten die DSO17 ondergaan.
De hierboven beschreven methode werd gemodelleerd na een studie uitgevoerd door Soh et al., waarbij cornea-endotheelgenezing werd geëvalueerd met en zonder de ROCK-remmer Y-27632 in zowel gekraste als geschilde wonden18. Terwijl Y-27632 de endotheelregeneratie versnelde met het membraan van Descemet nog intact, werd er zelfs met behandeling geen substantiële genezing gevonden in gestripte wonden. Met behulp van een vergelijkbare strippingtechniek gevolgd door behandeling met of zonder eFGF1 (NM141), waren de waarnemingen die we vonden niet consistent met die van Soh en collega's. De afwezigheid van Trypan Blue-kleuring in veel behandelde hoornvliezen op dag 14 en de aanwezigheid van ZO-1 positieve tight junctions binnen de hervormde endotheellaag stelt dat een intacte barrière, onderdeel van de natuurlijke functie van de CEC, werd hersteld in zowel normale als dystrofische hoornvliezen. Hoewel niet gekwantificeerd in deze studie, suggereert de aanwezigheid van EdU-positieve cellen in en rond het gestripte gebied ook proliferatie als een genezingsmechanisme, waarvan we eerder hebben vastgesteld dat het kan worden gestimuleerd door eFGF1 (NM141) in gewonde hoornvliezen16. Statistische analyse toonde aan dat behandeling met eFGF1 (NM141) resulteerde in een significant grotere genezing van DSO, gemiddeld meer dan twee keer zo hoog als controlehoornvliezen op het 14-daagse tijdstip. Hoewel de genezingspercentages matig variëren tussen individuen - een typisch kenmerk van donorhoornvliezen - bewijst de repliceerbaarheid van de resultaten over grote steekproefgroottes ook een zeer meetbare methode. Voor zover wij weten, zijn er geen andere voorbeelden van een ex vivo Descemet's stripping model in de literatuur.
Belangrijke componenten van het protocol zelf die waardevol zouden zijn voor andere onderzoekers die DSO bestuderen, zijn het gebruik van Trypan Blue om kaal stroma te detecteren en de beeldverwerkingstechniek die wordt gebruikt om het gekleurde gebied te meten. Trypan Blue wordt vaak gebruikt in oogheelkundige chirurgie, vooral bij het werken met het membraan van Descemet om niet-levensvatbare cellen te detecteren en te helpen bij de zichtbaarheid van het weefsel. De kleuringstijdpunten in dit protocol maakten effectieve herhaalde kleuring mogelijk zonder cornea's te veel bloot te stellen aan Trypan Blue, omdat is aangetoond dat het giftig is voor CECs bij hoge concentraties19. De vermindering van het bevlekte gebied gedurende 14 dagen in alle hoornvliezen, bevestigd door Alizarin Red en immunohistochemie als het resultaat van gemigreerde CECs, toont een eenvoudige en reproduceerbare methode om genezing te meten. Met behulp van het kleurdrempelmenu van ImageJ verzamelden meerdere analisten gegevens met standaarddeviaties die consistent onder de 1% lagen (gegevens niet weergegeven). Hoewel alternatieve programma's op dezelfde manier kunnen presteren, is ImageJ een open-source software die in staat is om nauwkeurige gebiedsmetingen te produceren om genezing te volgen.
Er is echter één aspect van het strippingprotocol dat we zowel noodzakelijk vonden voor het maken van wonds, maar ook belemmerend voor het algehele genezingsproces. Het gebruik van een scherpe naald van 30 G om het membraan van Descemet te scoren langs het merkteken dat door de biopsiestoot is achtergelaten, maakt het mogelijk een gladde, cirkelvormige wond te creëren die door clinici wordt opgemerkt om een snellere genezing te ondersteunen10. Tegelijkertijd is deze stap schadelijk voor het hoornvlies, omdat het scheuren in de stromale vezels kan veroorzaken die stromale celdood veroorzaken, de migratie van endotheelcellen over de wondrand belemmeren en de vorming van knobbeltjes induceren die resulteren in meer aanhoudend postoperatief oedeem20. Clinici die DSO uitvoeren, gebruiken meestal een omgekeerde Sinskey-haak om de wond te initiëren, maar zonder intraoculaire druk die het hoornvlies strak houdt, is dit hulpmiddel minder effectief in het ex vivo-model . Een alternatief hulpmiddel dat het membraan van Descemet kan scheuren zonder het onderliggende stroma te beschadigen, zou het protocol verbeteren, bijvoorbeeld het irrigatie- en aspiratiehandstuk aanbevolen door Macsai en Shiloach10. Verdere experimenten zullen nodig zijn om te bepalen of deze techniek compatibel is met het ex vivo model.
Een uitdaging die inherent lijkt aan het ex vivo model is het frequent voorkomen van CEC-sterfte in het gebied dat perifeer is aan de wond, met name in dystrofische hoornvliezen. Dit verdoezelde af en toe de kwantificering van het wondgebied, omdat de nauwkeurigheid van het kleurdrempelgereedschap beperkter wordt naarmate het gekleurde gebied zich uitstrekt tot voorbij het midden van het hoornvlies, waar de kromming resulteert in een ongelijke lichtverdeling. Deze variabele metingen vonden echter voornamelijk plaats op eerdere tijdstippen voordat perifere kleuring geleidelijk verdween naarmate beschadigde CECs werden opgeruimd en naburige cellen werden uitgerekt, gemigreerd of verspreid om ze te vervangen. Tegen het laatste tijdspunt van 14 dagen was het bevlekte gebied terug gelokaliseerd naar het midden van het hoornvlies en waren alle beelden meetbaar. Een vergelijkbare waarneming werd met vergelijkbare frequentie gedaan door Soh et al., waar vijf van de 14 normale hoornvliezen vroeg in de kweekperiode18 presenteerden wat zij 'Premature Culture Failure' (PCF) noemden. Hoewel de schade zich in de loop van de tijd in onze hoornvliezen omkeerde en toch permanent was in hun geval, kan dit worden toegeschreven aan het feit dat hun methode het verwonden van een groter deel van het hoornvlies vereiste. De waarneming van meer voorkomende perifere Trypan-kleuring in dystrofische hoornvliezen kan erop wijzen dat dystrofische hoornvliezen gevoeliger zijn voor endotheelceldood dan gezonde hoornvliezen. Hoewel de exacte oorzaak van deze celdood nog moet worden opgehelderd, geloven we dat het onwaarschijnlijk is dat dit probleem relevant zal zijn voor menselijke hoornvliezen in vivo. Schade aan het perifere endotheel is voor zover wij weten in geen enkele klinische case study van DSO gemeld, wat suggereert dat dit fenomeen uniek is voor donorhoornvliezen gekweekt ex vivo 6,8,10,11,21. Afgezien van twee gevallen waarin alleen controlehoornvliezen werden gekleurd, werden alle waarnemingen van perifere kleuring gepaard, dus het is onwaarschijnlijk dat de oorzaak blootstelling aan eFGF1 (NM141) was. Het is echter mogelijk dat in die gevallen de behandeling een beschermend effect heeft gehad tegen de schade die anders perifere vlekken in beide hoornvliezen zou hebben veroorzaakt. Verder onderzoek naar deze hypothese is nodig.
Een andere beperking van deze methode is het inkopen van donorhoornvliezen die representatief zijn voor het FECD-fenotype waarvoor DSO is bedoeld. Donorhoornvliezen van welke aard dan ook zijn schaars, vandaar de noodzaak van een operatie die het gebruik van donorweefsel vermijdt. Voor onze doeleinden zijn de enige beschikbare hoornvliezen die om verschillende redenen worden afgewezen voor transplantatie. Oogbanken classificeren deze hoornvliezen verder als normaal of dystrofisch op basis van criteria zoals de aanwezigheid van guttae, lage of niet-meetbare ECD en onregelmatige CEC-morfologie. Het bevestigen van een dystrofische diagnose voorafgaand aan het accepteren van weefsel uit een oogbank is ook bijna onmogelijk, omdat de medische geschiedenis van de meeste donoren geen oculaire geschiedenis in het verleden omvat en de enige verstrekte informatie de ECD-waarde, de aantekeningen van de technicus en in sommige gevallen een representatief spiegelbeeld is. De dystrofische hoornvliezen verkregen voor deze studie vertoonden geen confluente centrale guttae na confocale microscopie uitgevoerd nadat de kweekperiode was voltooid, wat suggereert dat ze "vroege" stadia van FECD kunnen vertegenwoordigen. We verwachten niet dat dit een significante impact zal hebben op de implicaties van de studie, omdat het doel van DSO is om confluente gebieden van guttae te verwijderen, waardoor gezonde perifere cellen naar binnen kunnen migreren.
Deze methode biedt een zeer toepasbare en reproduceerbare techniek om agentia te evalueren die van invloed kunnen zijn op cec-proliferatie en -migratie. Het model heeft verschillende kenmerken die het fysiologisch relevanter maken dan in vitro modellen waarbij gekweekte CECs betrokken zijn, zelfs wanneer het wordt gezaaid op menselijk hoornvliesweefseltransplantaat 22,23,24. Ten eerste bevinden de te stimuleren LMOE's zich in een monolaag precies zoals ze in het oog van de patiënt bestaan en migreren ze over het hoornvliesstroma zoals ze zouden doen na klinische DSO. Het stroma in kwestie is van dezelfde patiënt als de LMO's, waardoor wordt gecontroleerd op mogelijke FECD-gerelateerde stromale verschillen. Het is niet nodig om culturen van LMOE's te explanten, te dissociëren en uit te breiden met de bijbehorende uitdagingen en potentieel voor endotheel naar mesenchymale overgang (EnMT) tijdens het kweekproces. Het beschreven protocol lijkt zelf sterk op de klinische DSO-procedure. Hoewel het de kweek- en expansiestappen omzeilt, heeft deze methode de beperking dat de duur van het onderzoek wordt beperkt door zwelling van het hoornvlies, omdat de epitheellaag niet wordt gehandhaafd. Dit belemmert ons om de morfologie te onderzoeken van CECs die zijn gemigreerd om het gestripte gebied te bedekken, waardoor het onduidelijk is of ze uiteindelijk zullen herschikken in een zeshoekige array in dit model. Garcin et al. hebben één mogelijke oplossing ontwikkeld met hun actieve opslagmachine (ASM), een apparaat waarvan is aangetoond dat het hoornvliezen tot 3 maanden in cultuur houdt met aanzienlijk minder oedeem dan hoornvliezen die in traditionele orgaancultuur worden onderhouden25. Een dergelijk apparaat kan nuttig zijn bij het repliceren en uitbreiden van dit werk.
Dit model heeft potentieel nut bij het testen van andere wondgenezingstherapieën (bijv. ROCK-remmers), het evalueren van wijzigingen in de chirurgische techniek en het vergelijken van genezing tussen verschillende donorpopulaties of stadia van de ziekte. We hopen dat dit onderzoek, in combinatie met klinische onderzoeksgegevens zoals het naar buiten komt, clinici aanmoedigt om DSO te beschouwen als een waardevolle behandelingsoptie voor hun in aanmerking komende FECD-patiënten.

Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) is een ziekte die wordt gekenmerkt door een verloren pompfunctie in cornea-endotheelcellen (CECs) en de overmatige opbouw van collageen en andere extracellulaire matrixeiwitten op het oppervlak van het membraan van Descemet, waardoor cornea-guttae1 wordt gevormd. De enige bekende behandeling voor FECD is endotheel keratoplastiek in verschillende vormen, die allemaal gepaard gaan met een risico op afstoting en endotheelcelverlies2. Hoewel vooruitgang in oogheelkundige chirurgie deze procedures in staat heeft gesteld om in de loop van de tijd minder invasief te worden, komt elke vorm van transplantatie met het risico van afstoting en de mogelijkheid van levenslang gebruik van steroïden, een behandeling met zijn eigen gelijktijdige bijwerkingen. Bovendien is het wereldwijde tekort aan donorweefsel zodanig dat er slechts één donorhoornvlies beschikbaar is voor elke 70 patiënten in nood3. Gezien deze uitdagingen onderzoeken onderzoekers en clinici chirurgische methoden die de behoefte aan donorweefsel helemaal vermijden. Een van deze experimentele technieken is Descemet's Stripping Only (DSO) of Descemetorhexis without Endothelial Keratoplasty (DWEK), waarbij FECD-patiënten met guttae gelokaliseerd in het midden van het hoornvlies een centrale cirkel van 4 mm van Descemet's membraan laten strippen zonder transplantaatplaatsing. De verwijdering van guttae moedigt gezonde perifere cellen aan om naar binnen te migreren en de endotheel monolaag te hervormen, waardoor uiteindelijk stromaal oedeem wordt omgedraaid en het gezichtsvermogen wordt verbeterd. Het concept werd oorspronkelijk beschreven in een reeks casestudy's waarin patiënten een operatie ondergingen die werd gecompliceerd door loslating van het membraan van Descemet, maar CEC-herbevolking vond nog steeds plaats 4,5,6,7. Hoewel er veel voordelen zijn aan deze methode, is het genezingsproces langdurig en inconsistent, omdat sommige patiënten een reddingstransplantatie nodig hebben als er geen genezing wordt gezien in de maanden na operatie8. Om deze redenen kan een geneesmiddel dat een snellere migratie en proliferatie van LMO's stimuleert, gunstig zijn in het herstelproces van FECD-patiënten die DSO hebben ondergaan.
Verschillende recente studies hebben ROCK-remmers geëvalueerd als een aanvullende behandeling voor patiënten die DSO ondergingen, en vonden dat behandelde patiënten sneller herstelden en hogere centrale endotheelceldichtheden (ECD) hadden dan die in de DSO alleen groep 9,10,11. Vanwege kleine steekproefgroottes en verschillen tussen doseringsregimes zijn echter meer gegevens nodig om de werkzaamheid van ROCK-remmers in deze omgeving beter te begrijpen.
Van fibroblastgroeifactoren is ook aangetoond dat ze de regeneratie van het cornea-endotheel stimuleren, zowel in vitro met runder-LMC's als in vivo in feline hoornvliezen12,13. eFGF1 (NM141) is een gemanipuleerde versie van FGF-1 die verschillende aminozuursubstituties bevat om het molecuul te stabiliseren, in tegenstelling tot de inheemse FGF-1, die een veel kortere halfwaardetijd heeft14,15. We hebben eerder het vermogen van eFGF1 (NM141) aangetoond om de proliferatie van LMOE's ex vivo in gevierendeelde menselijke hoornvliezen te stimuleren16. Deze studie probeerde dat werk te verbeteren door het eerste succesvolle ex vivo model van DSO in zowel normale als dystrofische hoornvliezen vast te stellen om te bepalen of aanvullende behandelingen zoals eFGF1 (NM141) de genezing in deze toepassing versnellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2&#181;m sterile 1000 mL filter units</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2&#181;m sterile 250 mL filter units</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2&#181;m sterile 500 mL filter units</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL aspirating pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>310 direct heat CO2 incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>13-998-082</td>
			<td>Set to 37&#176;C, 6% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896, -898,&#160; -900, -902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 azide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5533-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td>R200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic &#38; Antimycotic 100x (anti-anti)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-magnetic stainless steel forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>7-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470134-946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9700-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>1B1110-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chex-all II sterilzation pouches</td>
			<td>Propperman&#160;</td>
			<td>24008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cirpofloxacin hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>469130-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry vacuum pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2019B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A31606-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted micro slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy miniStar microcentrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C1413, VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemo-Sol detergent</td>
			<td>Haemo-Sol International LLC</td>
			<td>026-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human corneas</td>
			<td>Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>Version 1.52a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinity 3s microscopy camera</td>
			<td>Lumenera</td>
			<td>1URCAP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinity analyze software</td>
			<td>Lumenera</td>
			<td>Version 6.5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium (ITS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L- Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual single channel pipet</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>&#160;17014-392, -391, -382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle PrecisionGlide 30G</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Met141 TTHX1114</td>
			<td>Biopharmaceutical Development Program</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion Star A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9258-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpette plus pipet controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75856-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision water bath 188</td>
			<td>Precision Scientific Incorporated</td>
			<td>WB05</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Class II model biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>36213043726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel size 22 stainless steel&#160;</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>446479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2041-2.5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0404-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard solid refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10820-402</td>
			<td>Set to 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilmatic autoclave</td>
			<td>Market Forge</td>
			<td>STM-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube rocker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M48725Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>96-1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrance antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories Inc.</td>
			<td>H-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VistaVision cover glasses, no. 1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a human corneal organ culture model of descemet's stripping only with accelerated healing stimulated by engineered fibroblast growth factor 1

Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) is het gevolg van disfunctionele cornea-endotheelcellen (CECs) en wordt momenteel behandeld door transplantatie van het hele hoornvlies of het membraan van Descemet. Recente ontwikkelingen in de oogchirurgie hebben Descemet's Stripping Only (DSO) tot stand gebracht, een chirurgische techniek waarbij een centrale cirkel van guttae-dicht Descemet-membraan wordt verwijderd om de migratie van CECs naar het gladde stroma mogelijk te maken, waardoor de functie en het gezichtsvermogen van het hoornvlies worden hersteld. Hoewel deze potentiële behandelingsoptie van groot belang is op het gebied van oogheelkundig onderzoek, zijn er geen succesvolle ex vivo modellen van DSO vastgesteld en zijn de klinische gegevens beperkt. Dit werk presenteert een nieuw wondgenezingsmodel dat DSO simuleert in menselijke donorhoornvliezen. Met behulp van deze benadering om de werkzaamheid van de door de mens ontworpen FGF1 (NM141) te evalueren, ontdekten we dat de behandeling de genezing versnelde door stimulatie van migratie en proliferatie van CECs. Deze bevinding werd bevestigd in 11 paren menselijke hoornvliezen met tekenen van dystrofie gemeld door de oogbanken om te verifiëren dat deze resultaten kunnen worden gerepliceerd bij patiënten met Fuchs' Dystrofie, als de doelpopulatie van de DSO-procedure.

Dit experiment werd aanvankelijk uitgevoerd in 10 paar normale onderzoekshoornvliezen, omdat ze het gemakkelijkst beschikbaar zijn. Zodra de methode succesvol bleek te zijn, werd de studie gerepliceerd in 11 paren dystrofische hoornvliezen - als zodanig gelabeld door oogbanken op basis van spiegelende evaluatie - om de effecten van eFGF1 (NM141) in hoornvliezen te bestuderen die representatief zijn voor de FECD-patiëntenpopulatie. Voor een grotere klinische relevantie vertegenwoordigen de cijfers in dit werk gegevens die zijn verzameld uit dystrofische hoornvliezen, tenzij anders vermeld.
Na het simuleren van de chirurgische uitkomst van DSO, werd Trypan Blue-kleuring uitgevoerd en herhaald gedurende de 14-daagse kweekperiode, en de vermindering van positieve kleuring gekwantificeerd om wondgenezing te evalueren (figuur 2). Alizarin Red-kleuring werd ook uitgevoerd op dag 14 om celranden af te bakenen. Donkerrode gebieden zonder duidelijk zichtbaar patroon (hierna negatieve kleuring genoemd) verschenen consequent in het niet-genezen gedeelte van de laesie en in andere delen van het hoornvlies waar cellen vermoedelijk beschadigd of ontbrekend waren. Gebieden die op dag 14 positief kleurden voor Trypan Blue kwamen goed overeen met negatieve kleuring door Alizarin Red (figuur 2). Alle dystrofische hoornvliezen behandeld met eFGF1 (NM141) vertoonden een grotere genezing op dag 14 in vergelijking met de onbehandelde partner. Gemiddeld vertoonden behandelde hoornvliezen 91% genezing in tegenstelling tot 38% in controlehoornvliezen, en dit verschil was statistisch significant (p < 0,001) (figuur 3A). Dit is vergelijkbaar met de resultaten verkregen van 20 normale hoornvliezen, waar controles een gemiddelde genezing van 32% lieten zien en behandelde hoornvliezen 81% bereikten, wat opnieuw statistisch significant was (p < 0,001) (aanvullende figuur 1). Het genas percentage werd vergeleken tussen normale en dystrofische hoornvliezen met behulp van twee monster t-tests die uitgaan van gelijke variantie, en er werd geen significant verschil gezien in de controle- of behandelingsgroepen (gegevens niet getoond).
Donorinformatie verstrekt door oogbanken (tabel 1) voor zowel normale als dystrofische hoornvliezen werd geanalyseerd om te bepalen of kenmerken zoals leeftijd, dagen opgeslagen in Optisol, overlijden tot verzamelingsinterval, celdichtheid en geslacht correleren met genezing. Pearson's correlatiecoëfficiënt (r) werd gebruikt om alle factoren behalve geslacht te onderzoeken, die werd geëvalueerd met behulp van een ongepaarde t-test om genezing tussen mannen en vrouwen te vergelijken. De absolute waarde van r was in alle gevallen lager dan 0,25, wat aangeeft dat eventuele correlaties tussen genezing en leeftijd, dagen opgeslagen in Optisol, sterfte tot verzamelingsinterval of celdichtheid als verwaarloosbaar werden beschouwd. Het verschil in genezing tussen mannen en vrouwen was niet statistisch significant (p = 0,53).
Vergelijkbaar met de normale dataset, presenteerden 10 van de 22 dystrofische hoornvliezen opmerkelijke Trypan-kleuring buiten het gestripte gebied dat verbonden was met het gekleurde gebied in de laesie in ten minste één tijdstip (meestal dag 3) - een observatie die we perifere kleuring noemden (figuur 4A). Van die 10 waren er slechts twee controlehoornvliezen waarvan de behandelde tegenhangers niet hetzelfde effect vertoonden. De overige acht waren allemaal gematchte paren en presenteerden zich met een vergelijkbare ernst tussen hoornvliezen van hetzelfde individu. Hoewel kleuringspatronen vergelijkbaar waren tussen normale en dystrofische hoornvliezen, was de frequentie van perifere kleuring hoger in de dystrofische dataset met 45% van de hoornvliezen positief, vergeleken met 25% in de normale groep. Figuur 4A toont een paar dat als positief werd beschouwd voor perifere kleuring, omdat het gekleurde gebied buiten de laesie de wondrand ontmoette in de dag 6-beelden en geleidelijk terugtrok. In de overeenkomstige Alizarin Red-afbeeldingen leken cellen in gebieden met perifere Trypan-kleuring vergroot en abnormaal gevormd, net als de cellen die naar het gestripte gebied migreerden, en negatieve kleuring correleerde met de gebieden waar Trypan Blue aanwezig was op dag 14. Ondanks het grote deel van het hoornvlies dat gedurende de kweekperiode werd aangetast, vond gedeeltelijke of volledige verwijdering van de gekleurde periferie plaats in alle 10 hoornvliezen. Bovendien lag het uiteindelijke percentage genezen op dag 14 binnen het normale bereik, respectievelijk voor de behandelingsgroep, voor alle hoornvliezen op één na. De uitschieter (0811L, afgebeeld in figuur 4A) retourneerde een negatief percentage genezen waarde als gevolg van de overblijfselen van perifere kleuring die nog steeds verbonden waren met het laesiegebied op dag 14 (figuur 3A en figuur 4A). Een tweede kleuringspatroon, aangeduid als perifere kleuring, werd vastgelegd in de Alizarin Red-afbeeldingen uit figuur 4B, maar was ook zichtbaar in Trypan Blue-afbeeldingen gedurende de cultuurperiode in veel hoornvliezen (figuur 4B). Deze waarneming wordt gekenmerkt door een ring van donkere vlekken rond de limbus, wat wijst op gecompromitteerd endotheel. Ondanks de term kwam dit patroon zo vaak voor in zowel normale als dystrofische hoornvliezen dat ze niet als positief werden geteld voor perifere kleuring. Op deze afbeeldingen vertoonde het controle-hoornvlies levendigere en uitgebreidere kleuring op dag 14, ondanks dat beide hoornvliezen een vergelijkbare ernst en patroon van kleuring vroeg in de kweekperiode hadden. Ook opgemerkt in het behandelde hoornvlies was een schijnbaar groter aantal cellen, die compacter en zeshoekiger leken in vergelijking met controle, hoewel deze waarnemingen niet kwantitatief werden gemeten. Vanwege de kromming in de periferie werd alleen Trypan-kleuring binnen en direct rond het gestripte gebied opgenomen in de kwantitatieve analyse. Wanneer procentuele gekleurde waarden werden gemiddeld over alle dystrofische hoornvliezen, resulteerde de opkomst van perifere kleuring in een aanvankelijke toename ten opzichte van die van dag 0, in tegenstelling tot de gestage afname die werd waargenomen in normale hoornvliezen waar perifere kleuring minder voorkwam (figuur 3B).
Immunohistochemie gevisualiseerd door confocale beeldvorming onthult semi-georganiseerde expressie van ZO-1, een functionele marker van CEC tight junctions, in en rond de laesierand (figuur 5), een patroon dat op dezelfde manier wordt aangetoond door de Alizarin Red-kleuring (figuur 2 en figuur 4). Pleomorfisme en polymegathisme zijn zichtbaar door ZO-1 in de meeste dystrofische hoornvliezen; deze waarneming kan echter worden toegeschreven aan hun zieke toestand en werd opgemerkt door de oogbank bij spiegelend onderzoek van de hoornvliezen voorafgaand aan het kweken. Ongeorganiseerde ZO-1-expressie wordt waargenomen in het laesiegebied van behandelde hoornvliezen waar cellen naar binnen waren gemigreerd, ook in overeenstemming met de Alizarin Red-patronen. EdU-integrerende cellen kunnen worden gezien rond de rand van de laesie en binnenin het laesiegebied in controle en behandelde hoornvliezen (figuur 5). Het patroon van gemigreerde LMOE's weerspiegelt ook de Resultaten van Trypan Blue, waarbij in controle cornea's de meeste cellen werden aangetroffen binnen twee velden van de laesierand, terwijl CECs in behandelde hoornvliezen in het hele gestripte gebied te zien zijn (figuur 2).
EdU-etikettering werd uitgevoerd als een kwalitatieve maatstaf in deze studie om te bevestigen dat proliferatie bijdroeg aan genezing. Kwantificering van cellen met EdU kon echter niet systematisch worden uitgevoerd vanwege zwelling van het hoornvlies waardoor consistente, repliceerbare beelden niet in en rond de laesie konden worden vastgelegd. Als surrogaat is kwantitatieve analyse uitgevoerd in een studie uitgevoerd voorafgaand aan de oprichting van het DSO-model opgenomen om de effecten van eFGF-1 (NM141) op proliferatie aan te tonen (figuur 6). Normale menselijke donorhoornvliezen werden met behulp van een scalpel in vieren gesneden en gekweekt in aanwezigheid van EdU, met of zonder eFGF1 (NM141) gedurende 48 uur zoals eerder beschreven (Eveleth, 2020)16. Beeldvorming en daaropvolgende analyse van Hoechst 33342 en EdU-gelabelde cellen werd afzonderlijk uitgevoerd in de ongestoorde middenzone van de kwartalen en in de randzone, binnen drie velden van waaruit het hoornvlies werd gesneden. In de middelste zone was het percentage cellen met EdU laag en zeer variabel over de 10 geanalyseerde hoornvliezen. Gemiddeld hadden kwartalen behandeld met eFGF1 (NM141) hogere niveaus van EdU-opname in de midzone (4,1% ± 7,9%) in vergelijking met controles (1,8% ± 2,9%), hoewel dit verschil niet statistisch significant was (p = 0,239). Aan de wondrand vertoonden behandelde kwartalen gestimuleerd met eFGF1 (NM141) significant hogere percentages van EdU-opname wanneer gemiddeld (18,1% ± 11,5%) in vergelijking met controlekwartalen (10% ± 9,6%, p = 0,012).
Tabel 1: Donorinformatie voor 22 dystrofische en 20 normale hoornvliezen die in deze studie werden gebruikt, evenals 10 normale hoornvliezen die eerder werden gebruikt voor EdU-kwantificering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/Table%201_Donor%20info.zip" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig02.jpg"> Figuur 2: Vitale kleurstofkleuring van hoornvliezen na het strippen van Descemet. Dystrofische menselijke hoornvliezen werden ontdaan van de centrale 4 mm van het membraan van Descemet en geïncubeerd met of zonder eFGF1 (NM141) (100 ng/ ml) gedurende 14 dagen. Laesies werden gevisualiseerd door Trypan Blue-kleuring op dag 0, 3, 6, 9, 12 en 14. CEC-randen werden gevisualiseerd door Alizarin Red-kleuring op dag 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig03v2.jpg"> Figuur 3: Dystrofische menselijke hoornvliezen vertonen significant grotere genezing van DSO wanneer gekweekt met eFGF1 (NM141). (A) Procent genezing werd bepaald door het gekleurde gebied op dag 14 te meten met behulp van ImageJ en dat te vergelijken met het percentage gekleurd op dag 0. (B) Het gemiddelde percentage gekleurd in de loop van de tijd toont een consistente afname van normale hoornvliezen terwijl het piekt op dag 3 in dystrofische hoornvliezen als gevolg van de hogere prevalentie van perifere kleuring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig03largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig04.jpg"> Figuur 4: Vitale kleurstofkleuring van dystrofische hoornvliezen met perifere kleuring. (A) Trypan-kleuring van het intacte membraan van Descemet kan worden gezien terwijl het naar het midden oprukt en vervolgens na verloop van tijd opruimt in zowel controle- als behandelde hoornvliezen. (B) Alizarinepatronen rond de limbus vertegenwoordigen een typische waarneming van perifere schade en ongeorganiseerd herstel van het endotheel dat wordt gezien in veel donorhoornvliezen - in dit geval dystrofisch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig05.jpg"> Figuur 5: Stimulering van migratie en proliferatie van LMOE's door eFGF1 (NM141) in gestripte dystrofische hoornvliezen. Confocale microfoto's van Descemet's gestripte hoornvliezen gekleurd voor ZO-1 (rood), EdU (groen) en Hoechst 33342 (blauw). De stippellijn vertegenwoordigt de laesierand met het gestripte gebied aan de linkerkant van de afbeelding en het intacte membraan van Descemet aan de rechterkant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig06v2.jpg"> Figuur 6: Kwantificering van prolifererende cellen uit normale hoornvliezen gevierendeeld met behulp van een scalpel en geïncubeerd in media die EdU bevatten met of zonder eFGF-1 (NM141) gedurende 48 uur. Kwartalen werden in drievoud afgebeeld op de ongestoorde middenzone en langs de snijrand, en tellingen werden gemiddeld om het percentage cellen te bepalen dat EdU in de midden- en randzones bevatte. Figuur gewijzigd uit Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, gebruikt met toestemming16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig06largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Normale menselijke hoornvliezen vertonen een significant grotere genezing van DSO wanneer gekweekt met eFGF1 (NM141). ImageJ werd gebruikt om de gekleurde gebieden te meten en % genezing te bepalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet's Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1 at JoVE.com

A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet's Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1

Descemet's Stripping Only is een experimentele procedure waarbij patiënten met centrale cornea guttae als gevolg van Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy het membraan van Descemet laten strippen voor perifere cellen om de endotheellaag te regenereren. We presenteren een nieuwe methodologie die DSO simuleert in dystrofische menselijke hoornvliezen ex vivo met versnelde genezing gestimuleerd door eFGF1 (NM141).

Een menselijk hoornvliesorgaancultuurmodel van Descemet's strippen alleen met versnelde genezing gestimuleerd door gemanipuleerde fibroblastgroeifactor 1

Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) results from dysfunctional corneal endothelial cells (CECs) and is currently treated by transplantation of the ...

Het doel van deze video is om een menselijk hoornvliesorgaancultuurmodel van Descemet's Stripping Only te beschrijven met versnelde genezing, gestimuleerd door gemanipuleerde fibroblastgroeifactor één. Fuch's Endothelial Corneal Dystrophy, of FECD, is een ziekte die wordt gekenmerkt door een verloren pompfunctie in cornea-endotheelcellen en de overmatige opbouw van collageen en andere extracellulaire matrixeiwitten op het oppervlak van het membraan van Descemet, waardoor cornea-guttae wordt gevormd. De enige bekende behandeling voor FECD is endotheel keratoplastiek in verschillende vormen, die allemaal gepaard gaan met een risico op afstoting en endotheelcelverlies.Hoewel vooruitgang in oogheelkundige chirurgie deze procedures in staat heeft gesteld om in de loop van de tijd minder invasief te worden, komt elke vorm van transplantatie met het risico van afstoting en de mogelijkheid van levenslang gebruik van steroïden. Descemet's Stripping Only, of DSO, is een experimenteel alternatief waarbij FECD-patiënten met guttae gelokaliseerd in het midden van het hoornvlies de centrale vier millimeter cirkel van Descemet's membraan laten verwijderen zonder transplantaatvervanging. De verwijdering van guttae moedigt gezonde perifere cellen aan om naar binnen te migreren en de endotheelmonolaag te hervormen, waardoor uiteindelijk het stromale oedeem wordt omgedraaid en het gezichtsvermogen wordt verbeterd.Hoewel er veel voordelen aan deze methode zijn, is het genezingsproces langdurig en inconsistent en sommige patiënten hebben een reddingstransplantatie nodig als er geen genezing wordt gezien in de volgende operatie van de maand. Een behandeling die een snellere wondgenezing na DSO stimuleert, kan de procedure een meer haalbare optie maken voor patiënten met FECD. Dit protocol modelleert de klinische DSO-procedure in een orgaankweekformaat met behulp van menselijke donorhoornvliezen, met als doel behandelingen te testen om de wondgenezing na DSO te verbeteren, om DSO een meer haalbare optie te maken voor patiënten met FECD.Ons laboratorium gebruikt dit model om wondgenezing te testen in hoornvliezen die zijn behandeld met een gemanipuleerde fibroblastgroeifactor waarvoor we later in deze video representatieve resultaten zullen laten zien. In dit deel van de procedure zal een biopsiestoot worden gebruikt om het vier millimeter wondgebied te markeren waaruit het membraan van Descemet zal worden gestript. Verwijder met behulp van een steriele tang het hoornvlies uit de media en spoel af in 1X PBS om resterende media en celresten te verwijderen.Plaats na het spoelen de endotheelzijde van het hoornvlies naar boven op het deksel van een petrischaaltje. Doop een nieuwe vier millimeter biopsiestoot in trypanblauw in een lasschaal en tik overtollig af. Plaats de stoot met beide handen boven het midden van het hoornvlies en laat deze recht naar beneden op het endotheeloppervlak zakken, waarbij minimale druk wordt uitgeoefend.Zonder de positie of druk op het hoornvlies te veranderen, verplaatst u de stoot naar één hand en grijpt u met de nieuwe vrije hand naar een tang. Gebruik de tang om het hoornvlies op zijn plaats te houden terwijl je de biopsiestoot verschillende keren ongeveer 90 graden heen en weer draait. Til de biopsiestoot recht omhoog van het hoornvlies en zet apart.Spoel nogmaals in 1X PBS om overtollige trypan blauw te verwijderen. Breng het hoornvlies op het deksel van de petrischaal over in een ontleedkijker. Door het hoornvlies op zijn plaats te houden met een gebogen tang, wordt het membraan van Descemet gescoord door de punt van een scherpe naald van 30 gauge lichtjes langs de ring van trypan blauw te slepen die door de biopsiestoot is achtergelaten.Gebruik minimale druk om te voorkomen dat het onderliggende stroma wordt verstoord. Gebruik met een sinskey-haak zachte schepbewegingen om het membraan van Descemet rond de wondrand op te tillen en af te pellen. Werken naar het midden van de laesie.Het membraan van Descemet zou met zeer weinig weerstand moeten komen. Als je problemen ondervindt, trek je waarschijnlijk stroma op. Als dit gebeurt, begin dan opnieuw en til vanaf een nieuw punt langs de wondrand.Zodra het grootste deel van het membraan van Descemet van het stroma is gescheiden, gebruikt u gorovoy-tangen om het membraan te verwijderen en opzij te zetten. Onderzoek het gestripte gebied op eventuele resterende stukjes membraan en verwijder met gorovoy-tang. Na het strippen van Descemet bevlekt u het hoornvlies met trypanblauw om het wondgebied te visualiseren.Spoel het hoornvlies in 1X PBS met 0,01% calciumchloride en magnesiumchloride om celresten te verwijderen die kunnen interageren met trypanblauw en een strakke hechting van de resterende CECs aan het intacte Descemet-membraan te vergemakkelijken. Plaats het hoornvlies in een gelaste schaal en pipetteer 30 microliter trypanblauw op de endotheellaag gedurende 30 seconden. Gebruik een tang om het hoornvlies voorzichtig te laten schommelen om ervoor te zorgen dat het hele endotheeloppervlak bedekt is.Spoel overtollig trypanblauw in PDS af met calcium en magnesium en stel het gekleurde hoornvlies af onder een ontleedmicroscoop voor het dag nul tijdspunt. Nadat deze procedure is voltooid, kweekhoorns in een zes putplaat met lage serummedia bestaande uit de volgende vermelde componenten. Kweek het linker hoornvlies in acht fabrieken van lage serummedia alleen, en het rechter hoornvlies in lage serummedia aangevuld met gemanipuleerde FGF-1 of andere gewenste testbehandelingen.Incubeer de hoornvliezen bij 37 graden Celsius met 6% CO2 gedurende 14 dagen met dagelijkse mediawisselingen. Herhaal de trypankleuringsprocedure op dagen, drie, zes, negen, 12 en 14 en beeld elk hoornvlies onmiddellijk na de kleuring in. Zorg ervoor dat de camera-instellingen consistent blijven op alle tijdstippen.Na de kweekperiode kunnen extra vlekken op de hoornvliezen worden uitgevoerd op basis van onderzoeksinteresses, specifiek voor het experiment. Aanvullende vlekken die relevant zijn voor de onderzoeksinteresses van ons laboratorium zijn alizarinekleuring, evenals fluorescerende kleuring voor EDU-opname en ZO-1 tight junction-eiwitten. Alizarinekleuring wordt uitgevoerd om celranden te visualiseren om trypan-kleuringsresultaten te bevestigen en celmorfologie in het genezen gebied te visualiseren.ZO-1 immunofluorescente kleuring maakt visualisatie van tight junction-vorming tussen CECs mogelijk, wat van bijzonder belang is in en rond het genezen gebied. EdU-etikettering wordt uitgevoerd als een kwalitatieve maat om te bevestigen dat proliferatie bijdraagt aan genezing en kan ook worden gebruikt om prolifererende cellen in sommige contexten te kwantificeren. Meer gedetailleerde instructies over het uitvoeren van deze specifieke kleuringsprocedures zijn opgenomen in het artikel dat overeenkomt met deze video.Hier zijn representatieve afbeeldingen van een paar hoornvliezen die dystrofisch werden beoordeeld door de Eye-Bank en die werden geïncubeerd met of zonder de gemanipuleerde FGF-1 gedurende een periode van 14 dagen. Zoals te zien is op de afbeeldingen, vertoonde het gemanipuleerde met FGF-1 behandelde hoornvlies een versnelde genezing in vergelijking met het onbehandelde controle-hoornvlies. Extra Alizarinekleuring aan het einde van de kweekperiode diende om celgrenzen af te bakenen en bevestigde met deze bevindingen.Deze observatie werd gerepliceerd over 11 paar dystrofische hoornvliezen om het model te valideren in een monster van het hoornvlies dat het meest relevant is voor de klinische DSO-procedure. Beeldverwerkingssoftware, zoals ImageJ, kan worden gebruikt om het gekleurde gebied in deze afbeeldingen te meten om de voortgang van wondgenezing te kwantificeren, zoals hier te zien is. Alle dystrofische cornea's behandeld met gemanipuleerde FGF-1 vertoonden een grotere genezing op dag 14, vergeleken met de onbehandelde partner, wat resulteerde in een gemiddelde genezing van 91% in tegenstelling tot 38% in controle cornea's.En dit verschil was statistisch significant. Aanvullende immunohistochemie gevisualiseerd door confocale beeldvorming onthulde semi-georganiseerde expressie van het ZO-1 tight junction-eiwit, wat eerdere Alizarine-kleuringspatronen weerspiegelt. EDU-etikettering bevestigde de aanwezigheid van prolifererende cellen in en rond het wondgebied en was zichtbaar in hogere niveaus in behandelde hoornvliezen in vergelijking met onbehandelde controles.In sommige hoornvliesparen kan CEC-sterfte zichtbaar perifeer zijn aan het wondgebied, met name in dystrofische hoornvliezen. Hier zijn voorbeeldafbeeldingen van trypan-gekleurde hoornvliezen die aanzienlijke perifere celdood vertonen. Zoals te zien is in de beelden, treedt perifere celdood voornamelijk op eerdere tijdstippen op en keert geleidelijk om gedurende de kweekperiode.Deze perifere kleuring kan de kwantificering van het wondgebied bemoeilijken wanneer het verbinding maakt met de wond, omdat het moeilijk kan zijn om de locatie van de rand van het wondgebied vast te stellen. In alle gevallen was de perifere trypankleuring echter voldoende verdwenen om meetbare beelden te produceren op het laatste dag 14-tijdstip. Wij geloven dat dit fenomeen uniek is voor donorhoornvliezen die ex vivo zijn gekweekt en niet relevant is voor menselijke hoornvliezen in vivo.Aangezien schade aan het perifere endotheel voor zover wij weten in geen enkele klinische case study van DSO is gemeld. Een tweede kleuringspatroon waarnaar wordt verwezen als, verre perifere kleuring, werd vastgelegd in de Alizarin Red-afbeeldingen, maar was ook zichtbaar in trypan-blauwe afbeeldingen gedurende de cultuurperiode. Deze waarneming wordt gekenmerkt door een ring van donkere vlekken rond de limbus die wijzen op gecompromitteerd endotheel.Ondanks de term kwam dit patroon zo vaak voor in zowel normale als dystrofische hoornvliezen dat ze niet als positief werden geteld voor perifere kleuring. Dit protocol stelde ons in staat om verbeterde genezingsresultaten aan te tonen in gekweekte hoornvliezen die werden behandeld met gemanipuleerde FGF-1 na het strippen van Descemet. Bovendien dient dit stripping-protocol als een waardevolle methode voor andere onderzoekers die DSO bestuderen en kan het worden gebruikt voor een breed scala aan toepassingen, waaronder het testen van andere wondgenezingstherapieën, het evalueren van wijzigingen in de chirurgische techniek en het vergelijken van genezing tussen verschillende donorpopulaties of stadia van de ziekte.We hopen dat dit onderzoek en ander onderzoek met behulp van dit protocol clinici aanmoedigt om DSO in de toekomst te beschouwen als een waardevolle behandelingsoptie voor hun in aanmerking komende FECD-patiënten.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

Muizenmodel van wondgenezing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Muizen hoornvliestransplantatie: een model om de meest voorkomende vorm van een orgaantransplantatie Bestudeer

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Hoornvlies donorweefsel Voorbereiding voor Descemet Endothelial Keratoplastie

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Three Different Protocols of Corneal Collagen Crosslinking in Keratoconus: Conventional, Accelerated and Iontophoresis

Drie verschillende protocollen van hoornvlies Collageen Crosslinking in Keratoconus: Conventioneel, versnelde en Iontoforese

Keratoconus is a bilateral and progressive corneal ectasia. In order to slow down its progression, corneal collagen cross-linking (CXL) has recently been ...

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

Heterotope Renal Autotransplantatie in een Varkens Model: A Step-by-Step Protocol

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Inductie van versnelde atherosclerose bij muizen: het "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Creation of a Rodent Model of Abdominal Aortic Aneurysm by Blocking Adventitial Vasa Vasorum Perfusion

Oprichting van een knaagdier Model van abdominale aorta aneurysma door het blokkeren van Adventitial Vasa Vasorum perfusie

The adventitial vasa vasorum (VV) provides oxygen and nourishment to the aortic wall. Hypoxia in the aortic wall can cause enlarged abdominal aortic ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Onderzoeken van von Willebrand Factor pathofysiologie met behulp van een Flow kamer Model van von Willebrand Factor-bloedplaatjes String vorming

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...