Name: a human corneal organ culture model of descemet's stripping only with accelerated healing stimulated by engineered fibroblast growth factor 1
Uploaded: 2022-07-22T13:30:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet's Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1 at JoVE.com

Støtten til dette arbeidet ble støttet av Trefoil Therapeutics og NIH NCATS TRND CRADA #2016-04. Forfatterne vil takke Tony Wong for hanstopatologi råd og tjenester, Nikon Imaging Center ved UC San Diego for bruk av deres konfiskering mikroskop, og Drs. Natalie Afshari og Marian Macsai for deres råd om kirurgisk teknikk. I tillegg utvider forfatterne sin takknemlighet til donorer av øyne og øyebanker for å gi hornhinnene.

Dette arbeidet benyttet eksisterende prøver uten identifisering av emner og er unntatt fra IRB-godkjenning under 45 CFR 46.101(b)(4).
Human donor corneas ble hentet fra ulike øyebanker over hele USA (se Tabell over materialer). Corneas ble individuelt dømt dystrofisk av øyebankene basert på funn som guttae, pleomorfisme, polymegathisme og/eller lav ED ved spektrisk evaluering. Figur 1 presenterer Trypan Blue-flekker i hornhinnen under såroppretting, umiddelbart etter stripping, og etter 2 uker i kultur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig01.jpg"> Figur 1: Diagram som representerer hornhinnen under såroppretting, umiddelbart etter stripping, og etter 14 dager i kultur som visualisert av Trypan Blue. Reduksjonen i farget område mellom disse tidspunktene ble målt for å bestemme nivået av helbredelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
1. Såropprettelse
<ol><li>Bruk sterile tang, fjern hornhinnen fra media og skyll i 1x PBS for å fjerne gjenværende medier og cellerester. Etter skylling, plasser hornhinnen endotelsiden opp på lokket på en Petri-tallerken.</li>
	<li>Pipette 30 μL Trypan Blue i en godt oppvaskmiddel. Dypp en ny 4 mm biopsi punch i Trypan Blue og trykk av overflødig.</li>
	<li>Bruk begge hender, plasser slaget over midten av hornhinnen og senk det rett ned på endoteloverflaten, og påfør minimalt trykk.</li>
	<li>Uten å endre posisjonen eller trykket på hornhinnen, flytt slaget til en hånd og strekk etter tang med den nylig frigjorte hånden. Bruk tangene til å holde hornhinnen på plass mens du forsiktig vrir biopsistansen ca. 90° frem og tilbake flere ganger.</li>
	<li>Løft slaget rett opp fra hornhinnen og sett til side.</li>
	<li>Skyll igjen i 1x PBS for å fjerne overflødig Trypan Blue.</li>
</ol>2. Descemets stripping
<ol><li>Overfør hornhinnen på et Petri parabolen lokk til en dissekering omfang. MERK: Ikke la hornhinnen tørke lenger enn 5 min. Hvis det er behov for mer tid til å fullføre prosessen, skyll igjen i 1x PBS for å rehydrere endotelet.</li>
	<li>Hold hornhinnen på plass med buede tang, score Descemets membran ved å lett dra spissen av en skarp 30 G nål langs ringen av Trypan Blue igjen av biopsi punch. Bruk minimalt trykk for å unngå å forstyrre den underliggende stromaen.</li>
	<li>Med en Sinskey krok, bruk milde scooping bevegelser for å løfte og skrelle tilbake Descemets membran rundt sårkanten, arbeider mot midten av lesjonen. MERK: Descemets membran skal komme opp med svært liten motstand. Hvis vanskeligheter oppleves, trekker man sannsynligvis opp stroma. Hvis dette skjer, start igjen, løft fra et nytt punkt langs sårkanten.</li>
	<li>Når flertallet av Descemets membran er skilt fra stroma, bruk Gorovoy tang for å fjerne membranen og sette til side.</li>
	<li>Undersøk det stripete området for eventuelle gjenværende biter av membran og fjern med Gorovoy tang.</li>
</ol>3. Trypan Blå flekker
MERK: Etter descemets stripping, flekk hornhinnen med Trypan Blue for å visualisere sårområdet.
<ol><li>Returner hornhinnen på et Petri-parabolens lokk til biosikkerhetsskapet og skyll i 1x PBS som inneholder 0,01% (w / v) CaCl2 og MgCl2 for å fjerne celleavfall og lette tett overholdelse av gjenværende CED-er til den intakte Descemets membran.</li>
	<li>Legg hornhinnen i en godt utstyrt tallerken og pipette 30 μL Trypan Blue på endotellaget i 30 s.<ol>
<li>Bruk tang for å forsiktig rocke hornhinnen for å sikre at hele endoteloverflaten er dekket.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skyll av overflødig Trypan Blue i 1x PBS med 0,01% (w/ v) CaCl2 og MgCl2 og bilde den fargede hornhinnen under et dissekerende mikroskop for dag 0-tidspunktet.<ol>
<li>Pass på at hornhinnen er balansert slik at lyset er jevnt overført gjennom og posisjonering er repliserbar på tvers av tidspunkter. MERK: Tang kan brukes til å holde hornhinnen på plass under avbildning om nødvendig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Kulturperiode
<ol><li>Kultur corneas i en seks-brønns plate som inneholder lav-serum media bestående av OptiMEM; 1x insulin, transferrin og selen; 1x antibiotika / antimykotisk; 0,02 mg/ml CaCl2; 0,2 mg/ml askorbinsyre; og 0,8 % varmeinaktivert foster bovint serum. Kultur venstre hornhinne i 8 ml lavserummedier alene, og høyre hornhinne i 8 ml lavserummedier supplert med 100 ng/ml eFGF1 (NM141).<ol>
<li>Inkuber ved 37 °C med 6 % CO2 i 14 dager med daglige medieendringer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gjenta Trypan Blue-fargingsprosedyren på dag 3, 6, 9, 12 og 14, og bilde hver hornhinne umiddelbart etter farging. Sørg for å holde kamerainnstillingene konsekvente på tvers av alle tidspunkter.</li>
	<li>På dag 12 legger du til 10 μM EdU i både kontroll og eFGF1 (NM141)-supplert medium og inkuberer i 48 timer for å merke spredningsceller. Forny medier med EdU lagt til på nytt på dag 13.</li>
	<li>På dag 14, 48 h etter tilsetning av EdU, Trypan flekk og bilde corneas som vanlig, bortsett fra i stedet for 1x PBS med CaCl2 og MgCl2, bruk vanlig 1x PBS for skylling for å forhindre kalsium fra å samhandle med Alizarin Red flekken.</li>
</ol>5. Alizarin Rød farging
<ol><li>På dag 14, forbered 5% Alizarin Red i 0,9% saltløsning. MERK: Alizarin Red vil ikke oppløses helt i saltløsning. Ved kombinering, virvelløsning og stein i minst 1 time. Virvel igjen og filtrer før bruk for å fjerne uløste partikler.</li>
	<li>Når Trypan farging og avbildning er fullført, overføre hornhinnen til en godt utstyrt tallerken og tilsett 200 μL Alizarin Red til endoteloverflaten av hver hornhinne.<ol>
<li>Flekk i 2 min, skyll deretter hver hornhinne i en Petri-tallerken på 1x PBS for å fjerne overflødig Alizarin Red før du legger i en seksbrønnsplate ferdigfylt med 8 ml 1x PBS i to 5 min vasker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etter den andre vasken, bilde det stripete området av hver hornhinne under et dissekerende mikroskop. MERK: I motsetning til med Trypan-avbildning, kan hornhinner etterlates i 1x PBS for å avbilde Alizarin-farging for å forhindre at de tørker ut under prosessen.</li>
</ol>6. Fiksering og permeabilisering
<ol><li>Når Alizarin-bilder er tatt, overfør hornhinner til en 12-brønns plate og vask i 4 ml 1x PBS som inneholder 0,05% Tween-20 (PBS-T) i 30 minutter for å fjerne eventuelle partikler fra vev før fiksering.</li>
	<li>Fest hornhinnene i 4 ml 4% PFA i 30 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Permeabiliser celler i 5 min i 4 ml 1x PBS som inneholder 1% Triton X-100, vask deretter tre ganger i 4 ml vanlig 1x PBS i 30 minutter hver.</li>
</ol>7. Immunohistokjemi
<ol><li>Blokker hornhinner i 1 time ved 37 °C i 4 ml 1x PBS som inneholder 2 % bovint serumalbumin og 2 % geitserum.</li>
	<li>Inkuber i 1 ml blokkeringsløsning som inneholder 2,5 μg/ml primær antistoffmus anti-ZO-1 i 1 time ved 37 °C, og vask deretter tre ganger i 4 ml 1x PBS i 30 minutter hver. MERK: Platen kan vippes under antistofffarging for å minimere volumet av reagenser som trengs. Bare sørg for at hele hornhinnen er helt nedsenket i antistoffoppløsning.</li>
	<li>Utfør EdU Click-iT-reaksjonen med en cocktail som inneholder 0,88 mg/ml askorbinsyre, 0,26 mg/ml CuSO4 og 2,5 μM Alexa Fluor 488 azide.<ol>
<li>Klargjøre reaksjonskomponenter<ol>
<li>Tilsett 500 μL 1x PBS til 88 mg askorbinsyre og virvel til oppløst.</li>
			<li>Tilsett 840 μL deionisert vann til 44 mg CuSO4 og virvel til det er oppløst.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forbered cocktail ved å legge til følgende reagenser til 6 ml 1x PBS i denne rekkefølgen, inverter røret for å blande etter hvert tillegg: 30 μL askorbinsyreoppløsning, 30 μL CuSO4-løsning og deretter 15 μL Alexa Fluor 488 MERK: Når den er klargjort, er denne løsningen lysfølsom. For resten av protokollen bør hornhinnen beskyttes mot lys når det er mulig.</li>
		<li>Tilsett 1 ml EdU reaksjonscocktail til hver hornhinne og reager i 1 time ved romtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tilsett 4 ml 10 μg/ml Hoechst 33342 i hver hornhinne og reager i 2 minutter ved romtemperatur, og vask deretter tre ganger i 1x PBS-T i 30 minutter hver.</li>
	<li>Inkuber i 1 ml blokkeringsløsning som inneholder 2 μg/ml Alexa Fluor 555 merket geit antimus IgG i 1 time ved 37 °C, og vask deretter tre ganger i 1x PBS-T i 30 minutter hver.</li>
	<li>Oppbevar hornhinner ved 4 °C i 4 ml 1x PBS med 1 % anti/anti, 0,1 % ciprofloxacin og 0,1 % ampostericin B for å forhindre mikrobiell vekst.</li>
	<li>Når du utfører konfektavbildning, monterer du hele hornhinnen i 200 μL monteringsmedium på glasssklier med deksler teipet ned for å flate ut.</li>
</ol>8. Prøv bildeanalyse
<ol><li>Utfør all bildeanalyse ved hjelp av NIHs programvare ImageJ med åpen kildekode. Åpne et bilde ved hjelp av Fil > Åpne , og klikk Bilde > Juster > fargeterskel.</li>
	<li>Bruk skyvekontrollene "Hue" til å omfatte bare det blå området og juster den øvre "Lysstyrke" -glidebryteren helt til venstre for å inkludere mer av det fargede området. MERK: Hvis denne handlingen fører til at deler av bildet som ikke er Trypan-farget, inkluderes, kan glidebryteren "Lysstyrke" returneres til det opprinnelige nivået.</li>
	<li>Juster den øvre "Metning"-glidebryteren langsomt til tersklene nøyaktig skisserer det fargede området. MERK: Det er nyttig å ha en kopi av det opprinnelige bildet åpent for å referere til under denne prosessen.</li>
	<li>Klikk Velg-knappen på menyen for fargeterskel, og bruk deretter penselverktøyet til å avvelte områder utenfor såret som ble plukket opp.</li>
	<li>Klikk Analyser > Mål for å rapportere det fargede området i piksler.</li>
	<li>Fjern merkingen ved hjelp av Rediger > markering > Velg ingen og bruk det ovale markeringsverktøyet til å passe til limousinen så nært som mulig, og klikk deretter Analyser > mål for å rapportere området i hornhinnen i piksler. MERK: Lysstyrken kan slås opp midlertidig for å hjelpe til med visualiseringen av limbussen hvis denne delen av bildet er for mørk.</li>
	<li>Registrer arealverdier og del det fargede området med området av hele hornhinnen, og multipliser deretter med 100 for å beregne prosentandelen farget.</li>
	<li>Gjenta denne prosessen to ganger til for hvert bilde, og ta deretter gjennomsnittet av de tre målingene.</li>
</ol>9. Statistisk analyse
<ol><li>Når alle bildene er analysert, deler du den gjennomsnittlige prosenten som er farget på dag 14, med prosenten som er farget på dag 0 for å bestemme det gjenværende uhelbredede området. Trekk dette beløpet fra 100 % for å beregne prosentandelen av det stripete området som er helbredet i løpet av 14 dager.</li>
	<li>Bruk en parvis t-test til å sammenligne prosentvise helbredede verdier mellom kontroll- og behandlingsgrupper.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eghrari, A. O., Gottsch, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuchs'+corneal+dystrophy.">Fuchs' corneal dystrophy.</a> Expert Review of Ophthalmology. 5 (2), 147-159 (2010).</li><li>Ku, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+loss+in+penetrating+keratoplasty,+endothelial+keratoplasty,+and+deep+anterior+lamellar+keratoplasty.">Endothelial cell loss in penetrating keratoplasty, endothelial keratoplasty, and deep anterior lamellar keratoplasty.</a> Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (4), 199 (2017).</li><li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+survey+of+corneal+transplantation+and+eye+banking.">Global survey of corneal transplantation and eye banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Braunstein, R. E., Airiani, S., Chang, M. A., Odrich, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+edema+resolution+after+&amp;#34;descemetorhexis&amp;#34.">Corneal edema resolution after &amp;#34;descemetorhexis&amp;#34.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 29 (7), 1436-1439 (2003).</li><li>Pan, J. C., Eong, K. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+resolution+of+corneal+oedema+after+inadvertent+'descemetorhexis'+during+cataract+surgery.">Spontaneous resolution of corneal oedema after inadvertent 'descemetorhexis' during cataract surgery.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 34 (9), 896-897 (2006).</li><li>Shah, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+corneal+clearing+after+Descemet's+stripping+without+endothelial+replacement.">Spontaneous corneal clearing after Descemet's stripping without endothelial replacement.</a> Ophthalmology. 119 (2), 256-260 (2012).</li><li>Ziaei, M., Barsam, A., Mearza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+corneal+clearance+despite+graft+removal+in+Descemet+stripping+endothelial+keratoplasty+in+Fuchs+endothelial+dystrophy.">Spontaneous corneal clearance despite graft removal in Descemet stripping endothelial keratoplasty in Fuchs endothelial dystrophy.</a> Cornea. 32 (7), 164-166 (2013).</li><li>Huang, M. J., Kane, S., Dhaliwal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Descemetorhexis+without+endothelial+keratoplasty+versus+DMEK+for+treatment+of+fuchs+endothelial+corneal+dystrophy.">Descemetorhexis without endothelial keratoplasty versus DMEK for treatment of fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Cornea. 37 (12), 1497 (2018).</li><li>Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+corneal+clearance+with+the+use+of+a+rho-kinase+inhibitor+after+descemetorhexis+without+endothelial+keratoplasty+for+Fuchs+endothelial+corneal+dystrophy.">Pilot study of corneal clearance with the use of a rho-kinase inhibitor after descemetorhexis without endothelial keratoplasty for Fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Cornea. 40 (7), 899-902 (2021).</li><li>Macsai, M. S., Shiloach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+topical+rho+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+Fuchs+dystrophy+after+Descemet+stripping+only.">Use of topical rho kinase inhibitors in the treatment of Fuchs dystrophy after Descemet stripping only.</a> Cornea. 38 (5), 529-534 (2019).</li><li>Moloney, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Descemetorhexis+without+grafting+for+Fuchs+endothelial+dystrophy-supplementation+with+topical+ripasudil.">Descemetorhexis without grafting for Fuchs endothelial dystrophy-supplementation with topical ripasudil.</a> Cornea. 36 (6), 642-648 (2017).</li><li>Thalmann-Goetsch, A., Engelmann, K., Bednarz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+the+effects+of+different+growth+factors+on+migration+of+bovine+corneal+endothelial+cells+during+wound+healing.">Comparative study on the effects of different growth factors on migration of bovine corneal endothelial cells during wound healing.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 75 (5), 490-495 (1997).</li><li>Landshman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cat+corneal+endothelium+induced+in+vivo+by+fibroblast+growth+factor.">Regeneration of cat corneal endothelium induced in vivo by fibroblast growth factor.</a> Experimental Eye Research. 45 (6), 805-811 (1987).</li><li>Lee, J., Blaber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+functional+half-life+of+fibroblast+growth+factor-1+by+recovering+a+vestigial+disulfide+bond.">Increased functional half-life of fibroblast growth factor-1 by recovering a vestigial disulfide bond.</a> Journal of Proteins &amp; Proteomics. 1, 37-42 (2010).</li><li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+cysteine-free+form+of+human+fibroblast+growth+factor-1+for+&amp;#34;second+generation&amp;#34;+therapeutic+application.">Engineering a cysteine-free form of human fibroblast growth factor-1 for &amp;#34;second generation&amp;#34; therapeutic application.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (4), 1444-1453 (2016).</li><li>Eveleth, D., Pizzuto, S., Weant, J., Jenkins-Eveleth, J., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+human+corneal+endothelia+in+organ+culture+stimulated+by+wounding+and+the+engineered+human+fibroblast+growth+factor+1+derivative+TTHX1114.">Proliferation of human corneal endothelia in organ culture stimulated by wounding and the engineered human fibroblast growth factor 1 derivative TTHX1114.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: the Official Journal of the. 36 (9), 686-696 (2020).</li><li>TTHX1114(NM141) in Combination With DWEK/DSO. ClinicalTrials.gov Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04676737?term=TTHX1114&amp;draw=2&amp;rank=2">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04676737?term=TTHX1114&amp;draw=2&amp;rank=2</a> (2020)</li><li>Soh, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicative+factors+for+corneal+endothelial+cell+migration).">Predicative factors for corneal endothelial cell migration).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (2), 338-348 (2016).</li><li>van Dooren, B. T. H., Beekhuis, W. H., Pels, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+trypan+blue+with+human+corneal+cells.">Biocompatibility of trypan blue with human corneal cells.</a> Archives of Ophthalmology. 122, (2004).</li><li>Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+Factors+for+Corneal+Clearance+After+Descemetorhexis+Without+Endothelial+Keratoplasty.">Predictive Factors for Corneal Clearance After Descemetorhexis Without Endothelial Keratoplasty.</a> Cornea. 37 (2), 736-742 (2018).</li><li>Borkar, D. S., Veldman, P., Colby, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Fuchs+endothelial+dystrophy+by+Descemet+stripping+without+endothelial+keratoplasty.">Treatment of Fuchs endothelial dystrophy by Descemet stripping without endothelial keratoplasty.</a> Cornea. 35 (10), 1267-1273 (2016).</li><li>Amano, S., Mimura, T., Yamagami, S., Osakabe, Y., Miyata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+corneas+reconstructed+with+cultured+human+corneal+endothelial+cells+and+human+corneal+stroma.">Properties of corneas reconstructed with cultured human corneal endothelial cells and human corneal stroma.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 49 (6), 448-452 (2005).</li><li>Rolev, K., O&#700;Donovan, D. G., Coussons, P., King, L., Rajan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+of+human+corneal+endothelial+cell+transplantation+using+an+in+vitro+human+corneal+model.">Feasibility study of human corneal endothelial cell transplantation using an in vitro human corneal model.</a> Cornea. 37 (6), 778-784 (2018).</li><li>Spinozzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+and+transplantation+of+human+corneal+endothelial+cells+cultured+on+biocompatible+carriers.">In vitro evaluation and transplantation of human corneal endothelial cells cultured on biocompatible carriers.</a> Cell Transplantation. 29, 1-11 (2020).</li><li>Garcin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-month+storage+of+human+corneas+in+an+active+storage+machine.">Three-month storage of human corneas in an active storage machine.</a> Transplantation. 104 (6), 1159-1165 (2020).</li></ol>

DDE, SP, GD og JW er ansatte i og eier egenkapital i Trefoil Therapeutics, Inc. DDE er oppfinner på patenter som dekker eFGF1 (NM141).

Mange øyeleger har bekymringer for å anbefale DSO til sine pasienter av to hovedgrunner: 1) den lange helbredelsesprosessen, og 2) mangel på data (DSO er et nytt konsept innen oftalmisk kirurgi). Forskningen vi har presentert vil være til stor nytte for å lette begge disse bekymringene. Basert på data fra denne studien og andre, fda har godkjent en fase 2 klinisk studie der eFGF1 (NM141) vil bli administrert i varierende dosering tidsplaner til pasienter som gjennomgår DSO17.
Metoden beskrevet ovenfor ble modellert etter en studie utført av Soh et al., hvor hornhinnen endotelhelial helbredelse ble evaluert med og uten ROCK-hemmeren Y-27632 i både riper og skrellede sår18. Mens Y-27632 akselerert endotelregenerering med Descemets membran fortsatt intakt, ble det ikke funnet noen betydelig helbredelse i stripete sår selv med behandling. Ved hjelp av en lignende strippingsteknikk etterfulgt av behandling med eller uten eFGF1 (NM141), var observasjonene vi fant ikke i samsvar med Soh og kollegers. Fraværet av Trypan Blue farging i mange behandlede hornhinner på dag 14, og tilstedeværelsen av ZO-1 positive tette veikryss i det reformerte endotellaget hevder at en intakt barriere, en del av CECs naturlige funksjon, ble restaurert i både normale og dystrofiske hornhinner. Selv om det ikke kvantifiseres i denne studien, antyder tilstedeværelsen av EdU-positive celler i og rundt det stripete området også spredning som en helbredende mekanisme, en som vi tidligere har etablert, kan stimuleres av eFGF1 (NM141) i skadede hornhinnen16. Statistisk analyse viste at behandling med eFGF1 (NM141) resulterte i betydelig større helbredelse fra DSO, i gjennomsnitt over dobbelt så høy som kontroll corneas på 14 dagers tidspunkt. Selv om helbredelsesraten varierer moderat mellom individer - en typisk egenskap ved donor corneas-resultatenes replikerbarhet over store utvalgsstørrelser, viser også en svært målbar metode. Så vidt vi vet er det ingen andre eksempler på en ex vivo Descemets strippingsmodell i litteraturen.
Viktige komponenter i selve protokollen som vil tjene verdifullt for andre forskere som studerer DSO, er bruken av Trypan Blue for å oppdage bar stroma, og bildebehandlingsteknikken som brukes til å måle det fargede området. Trypan Blue brukes ofte i oftalmisk kirurgi, spesielt når du arbeider med Descemets membran for å oppdage ikke-levedyktige celler og hjelpe til med synligheten av vevet. Fargetidspunktene som er inkludert i denne protokollen tillot effektiv gjentatt farging uten over-eksponerende hornhinner til Trypan Blue, som det har vist seg å være giftig for CED ved høye konsentrasjoner19. Reduksjonen av farget område over 14 dager i alle hornhinner, bekreftet av Alizarin Red og immunohistokjemi som et resultat av migrerte CED-er, demonstrerer en enkel og reproduserbar metode for å måle helbredelse. Ved hjelp av ImageJs fargeterskelmeny samlet flere analytikere inn data med standardavvik konsekvent under 1 % (data vises ikke). Selv om alternative programmer kan fungere på samme måte, er ImageJ en programvare med åpen kildekode som er i stand til å produsere nøyaktige områdemålinger for å spore helbredelse.
Det er imidlertid et aspekt av strippingsprotokollen som vi fant å være begge nødvendige for såroppretting, men likevel obstruktivt for den generelle helbredelsesprosessen. Ved å bruke en skarp, 30 G nål for å score Descemets membran langs merket som er igjen av biopsistansen, gjør det mulig å skape et glatt, sirkulært sår som er notert av klinikere for å støtte raskere helbredelse10. Samtidig er dette trinnet skadelig for hornhinnen, da det kan skape tårer i de stromale fibrene som forårsaker stromal celledød, hindrer migrering av endotelceller over sårkanten og induserer dannelsen av knuter som resulterer i mer vedvarende postoperativt ødem20. Klinikere som utfører DSO bruker vanligvis en omvendt Sinskey-krok for å starte såret, men uten noe intraokulært trykk som holder hornhinnen stram, er dette verktøyet mindre effektivt i ex vivo-modellen . Et alternativt verktøy som er i stand til å rive Descemets membran uten å skade den underliggende stromaen, vil forbedre protokollen, for eksempel vanning og aspirasjonshåndstykke anbefalt av Macsai og Shiloach10. Videre eksperimentering vil være nødvendig for å avgjøre om denne teknikken er kompatibel med ex vivo-modellen .
En utfordring som ser ut til å være iboende i ex vivo-modellen er den hyppige forekomsten av CEC-død i området perifer til såret, spesielt i dystrofiske hornhinnen. Dette tilslørte av og til mengden av sårområdet, siden nøyaktigheten av fargeterskelverktøyet blir mer begrenset etter hvert som det fargede området strekker seg utover sentrum av hornhinnen der krumningen resulterer i ujevn lysfordeling. Disse variable målingene forekom imidlertid hovedsakelig på tidligere tidspunkter før perifer farging gradvis trakk seg tilbake etter hvert som skadede CED-er ble tømt og nabocellene strakte seg, migrerte eller spredte seg for å erstatte dem. Ved det siste 14-dagers tidspunktet hadde det fargede området lokalisert tilbake til sentrum av hornhinnen, og alle bildene var målbare. En lignende observasjon ble gjort med sammenlignbar frekvens av Soh et al., hvor fem av 14 normale hornhinnen presenterte det de kalte 'Premature Culture Failure' (PCF) tidlig i kulturperioden18. Mens skaden snudde seg over tid i hornhinnene våre og likevel var permanent i deres tilfelle, kan dette tilskrives det faktum at deres metode krevde å såre et større område av hornhinnen. Observasjonen av mer utbredt perifer Trypan farging i dystrofiske hornhinnen kan indikere at dystrofiske hornhinnen er mer utsatt for endotelcelledød enn sunne hornhinnen. Selv om den eksakte årsaken til denne celledøden ennå ikke er belyst, tror vi det er usannsynlig at dette problemet vil være relevant for menneskelige hornhinnen in vivo. Skade på perifert endotel har ikke blitt rapportert i noen kliniske casestudier av DSO til vår kunnskap, noe som tyder på at dette fenomenet er unikt for donor hornhinnen dyrket ex vivo 6,8,10,11,21. Bortsett fra to tilfeller der bare kontroll hornhinnen farget, alle observasjoner av perifer farging ble parret, så det er usannsynlig at årsaken var eksponering for eFGF1 (NM141). Det er imidlertid mulig at behandling i disse tilfellene kan ha gitt en beskyttende effekt mot skaden som ellers ville ha forårsaket perifer farging i begge hornhinnene. Videre undersøkelser av denne hypotesen er nødvendig.
En annen begrensning i denne metoden er sourcing donor corneas representant for FECD fenotype som DSO er ment for. Donor corneas av noe slag er knappe, derav behovet for en operasjon som unngår bruk av donorvev. For våre formål er de eneste hornhinnene som er tilgjengelige, de som avvises fra transplantasjon av ulike grunner. Øyebanker klassifiserer disse hornhinnene ytterligere som normale eller dystrofiske basert på kriterier som tilstedeværelse av guttae, lav eller ikke-målbar ECD og uregelmessig CEC-morfologi. Å bekrefte en dystrofisk diagnose før du godtar vev fra en øyebank er også nesten umulig, siden de fleste giveres medisinske historie ikke inkluderer tidligere okulær historie, og den eneste informasjonen som er gitt er ECD-verdien, teknikerens notater og i noen tilfeller et representativt spektrisk bilde. De dystrofiske hornhinnene som ble oppnådd for denne studien viste ikke sammenfallende sentrale guttae ved konfokal mikroskopi utført etter at kulturperioden var fullført, noe som tyder på at de kan representere "tidlige" stadier av FECD. Vi forventer ikke at dette vil ha en betydelig innvirkning på implikasjonene av studien, da formålet med DSO er å fjerne sammenfallende områder av guttae, slik at sunne perifere celler kan migrere innover.
Denne metoden gir en svært anvendelig og reproduserbar teknikk for å evaluere agenter som kan påvirke CEC-spredning og migrasjon. Modellen har flere funksjoner som gjør den mer fysiologisk relevant enn in vitro-modeller som involverer kultiverte CED-er, selv når de frøes på humant hornhinnen vev graft 22,23,24. For det første er CED-ene som skal stimuleres i en monolayer akkurat som de eksisterer i pasientens øye, og migrerer over hornhinnen stroma som de ville etter klinisk DSO. Det aktuelle stromaet er fra samme pasient som cecs, og kontrollerer dermed for potensielle FECD-relaterte stromale forskjeller. Det er ikke nødvendig å utvise, dissosiere og utvide kulturer på CED-er med tilhørende utfordringer og potensial for endotel til Mesenchymal Transition (EnMT) under kulturingsprosessen. Protokollen som er beskrevet er i seg selv svært lik den kliniske DSO-prosedyren. Mens den omgår kultur- og ekspansjonstrinnene, har denne metoden begrensningen at studievarigheten er begrenset av hornhinnen hevelse, da epitellaget ikke opprettholdes. Dette hemmer oss fra å undersøke morfologien til CED-er som har migrert for å dekke det stripete området, slik at det er uklart om de til slutt vil omorganisere seg til en sekskantet matrise i denne modellen. Garcin et al. har utviklet en potensiell løsning med sin aktive lagringsmaskin (ASM), en enhet som er vist å holde hornhinner i kultur i opptil 3 måneder med betydelig mindre ødem enn hornhinner opprettholdt i tradisjonell organkultur25. En slik enhet kan være nyttig for å replikere og utvide dette arbeidet.
Denne modellen har potensielt nytte i å teste andre sårhelingsterapier (f.eks. ROCK-hemmere), evaluere modifikasjoner på kirurgisk teknikk og sammenligne helbredelse på tvers av forskjellige donorpopulasjoner eller sykdomsstadier. Vi håper denne forskningen, sammen med kliniske studiedata når den kommer ut, oppfordrer klinikere til å vurdere DSO som et verdifullt behandlingsalternativ for sine kvalifiserte FECD-pasienter.

Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) er en sykdom preget av tapt pumpefunksjon i hornhinnen endotelceller (CECs) og overdreven oppbygging av kollagen og andre ekstracellulære matriseproteiner på overflaten av Descemets membran, danner hornhinnen guttae1. Den eneste kjente behandlingen for FECD er endotel keratoplasty i forskjellige former, som alle har risiko for avvisning og endotelcelletap2. Mens fremskritt i oftalmisk kirurgi har gjort det mulig for disse prosedyrene å bli mindre invasive over tid, noen form for transplantasjon kommer med risikoen for avvisning og mulighet for livstid steroid bruk, en behandling med sine egne samtidige bivirkninger. Videre er den globale donorvevsmangelen slik at bare en donor hornhinne er tilgjengelig for hver 70 pasienter i nød3. Gitt disse utfordringene utforsker forskere og klinikere kirurgiske metoder som unngår behovet for donorvev helt. En av disse eksperimentelle teknikkene er Descemet's Stripping Only (DSO) eller Descemetorhexis uten Endotelial Keratoplasty (DWEK), der FECD-pasienter med guttae lokalisert til midten av hornhinnen har en sentral 4 mm sirkel av Descemets membran strippet uten graftplassering. Fjerningen av guttae oppfordrer sunne perifere celler til å migrere innover og reformere endotelmonolayeren, til slutt reversere stromal ødem og forbedre synet. Konseptet ble opprinnelig beskrevet i en rekke casestudier der pasienter gjennomgikk kirurgi som ble komplisert ved løsrivelse av Descemets membran, men CEC-repopulering skjedde fortsatt 4,5,6,7. Selv om det er mange fordeler med denne metoden, er helbredelsesprosessen lang og inkonsekvent, da noen pasienter krever redningstransplantasjon hvis ingen helbredelse ses i månedene etter operasjonen8. Av disse grunnene kan et stoff som stimulerer raskere migrasjon og spredning av CPC-er være gunstig i gjenopprettingsprosessen til FECD-pasienter som har gjennomgått DSO.
Flere nyere studier har evaluert ROCK-hemmere som en supplerende behandling for pasienter som gjennomgår DSO, og fant at behandlede pasienter kom seg raskere og hadde høyere sentrale endotelcelletettheter (ECD) enn de i DSO bare gruppe 9,10,11. På grunn av små utvalgsstørrelser og forskjeller mellom doseringsregimer er det imidlertid nødvendig med mer data for å bedre forstå effekten av ROCK-hemmere i denne innstillingen.
Fibroblast vekstfaktorer har også vist seg å stimulere regenerering av hornhinnen endotel både in vitro med bovine CED, og in vivo i feline hornhinnen12,13. eFGF1 (NM141) er en konstruert versjon av FGF-1 som inneholder flere aminosyreerstatninger for å stabilisere molekylet, i motsetning til den innfødte FGF-1, som har en mye kortere halveringstid 14,15. Vi har tidligere demonstrert eFGF1 (NM141) evne til å stimulere spredning av CECs ex vivo i kvartalsvise humane hornhinner16. Denne studien forsøkte å forbedre dette arbeidet ved å etablere den første vellykkede ex vivo-modellen av DSO i både normale og dystrofiske hornhinner for å avgjøre om tilleggsbehandlinger som eFGF1 (NM141) akselererer helbredelse i denne applikasjonen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2&#181;m sterile 1000 mL filter units</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2&#181;m sterile 250 mL filter units</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2&#181;m sterile 500 mL filter units</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL aspirating pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>310 direct heat CO2 incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>13-998-082</td>
			<td>Set to 37&#176;C, 6% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896, -898,&#160; -900, -902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 azide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5533-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td>R200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic &#38; Antimycotic 100x (anti-anti)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-magnetic stainless steel forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>7-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470134-946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9700-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>1B1110-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chex-all II sterilzation pouches</td>
			<td>Propperman&#160;</td>
			<td>24008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cirpofloxacin hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>469130-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry vacuum pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2019B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A31606-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted micro slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy miniStar microcentrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C1413, VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemo-Sol detergent</td>
			<td>Haemo-Sol International LLC</td>
			<td>026-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human corneas</td>
			<td>Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>Version 1.52a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinity 3s microscopy camera</td>
			<td>Lumenera</td>
			<td>1URCAP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinity analyze software</td>
			<td>Lumenera</td>
			<td>Version 6.5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium (ITS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L- Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual single channel pipet</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>&#160;17014-392, -391, -382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle PrecisionGlide 30G</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Met141 TTHX1114</td>
			<td>Biopharmaceutical Development Program</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion Star A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9258-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpette plus pipet controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75856-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision water bath 188</td>
			<td>Precision Scientific Incorporated</td>
			<td>WB05</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Class II model biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>36213043726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel size 22 stainless steel&#160;</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>446479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2041-2.5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0404-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard solid refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10820-402</td>
			<td>Set to 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilmatic autoclave</td>
			<td>Market Forge</td>
			<td>STM-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube rocker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M48725Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>96-1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrance antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories Inc.</td>
			<td>H-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VistaVision cover glasses, no. 1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a human corneal organ culture model of descemet's stripping only with accelerated healing stimulated by engineered fibroblast growth factor 1

Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) er et resultat av dysfunksjonelle hornhinnen endotelceller (CECs) og behandles for tiden ved transplantasjon av hele hornhinnen eller Descemets membran. Nyere utvikling i okulær kirurgi har etablert Descemet's Stripping Only (DSO), en kirurgisk teknikk der en sentral sirkel av guttae-tett Descemets membran fjernes for å tillate migrering av CED-er på glatt stroma, gjenopprette funksjon og visjon til hornhinnen. Selv om dette potensielle behandlingsalternativet er av stor interesse for oftalmisk forskning, er det ikke etablert vellykkede ex vivo-modeller av DSO og kliniske data er begrenset. Dette arbeidet presenterer en ny sårhelingsmodell som simulerer DSO i humane donor corneas. Ved å bruke denne tilnærmingen til å evaluere effekten av den menneskekonstruerte FGF1 (NM141), fant vi at behandlingen akselererte helbredelse via stimulering av migrasjon og spredning av CED. Dette funnet ble bekreftet i 11 par humane hornhinner med tegn på dystrofi rapportert av øyebankene for å verifisere at disse resultatene kan replikeres hos pasienter med Fuchs dystrofi, som målpopulasjonen av DSO-prosedyren.

Dette eksperimentet ble opprinnelig utført i 10 par normale forsknings corneas, da de er lettest tilgjengelige. Når metoden viste seg å være vellykket, ble studien replikert i 11 par dystrofiske hornhinner merket som sådan av øyebanker basert på spektrisk evaluering-for å studere effekten av eFGF1 (NM141) i hornhinnen representant for FECD pasientpopulasjonen. For større klinisk relevans representerer tallene som inngår i det nåværende arbeidet data samlet inn fra dystrofiske hornhinnen med mindre annet er angitt.
Etter å ha simulert det kirurgiske utfallet av DSO, ble Trypan Blue farging utført og gjentatt gjennom hele 14 dagers kulturperiode, og reduksjonen i positiv farging kvantifisert for å evaluere sårheling (figur 2). Alizarin Rød farging ble også utført på dag 14 for å avgrense cellekantlinjer. Mørkerøde områder uten klart mønster synlig (referert til heretter som negativ farging) dukket opp konsekvent innenfor den uhelbredede delen av lesjonen og i andre områder av hornhinnen der celler ble antatt å være skadet eller mangler. Områder som farget positivt for Trypan Blue på dag 14, korresponderte godt med negativ farging av Alizarin Red (figur 2). Alle dystrofiske hornhinnen behandlet med eFGF1 (NM141) viste større helbredelse på dag 14 sammenlignet med den ubehandlede kompisen. I gjennomsnitt viste behandlede hornhinnener 91% helbredelse i motsetning til 38% i kontroll hornhinnen, og denne forskjellen var statistisk signifikant (p < 0,001) (figur 3A). Dette kan sammenlignes med resultater hentet fra 20 normale hornhinnen, hvor kontroller viste et gjennomsnitt på 32% helbredelse og behandlet hornhinnen nådde 81%, som igjen var statistisk signifikant (p < 0,001) (Supplerende figur 1). Prosentandelen helbredet ble sammenlignet mellom normale og dystrofiske hornhinner ved hjelp av to utvalg t-tester forutsatt lik varians, og ingen signifikant forskjell ble sett i verken kontroll- eller behandlingsgruppene (data ikke vist).
Donorinformasjon gitt av øyebanker (tabell 1) for både normale og dystrofiske hornhinner ble analysert for å avgjøre om egenskaper inkludert alder, dager lagret i Optisol, død til innsamlingsintervall, celletetthet og kjønn korrelerer med helbredelse. Pearsons korrelasjonskoeffisient (r) ble brukt til å undersøke alle faktorer unntatt kjønn, som ble evaluert ved hjelp av en uparret t-test for å sammenligne helbredelse mellom menn og kvinner. Den absolutte verdien av r var under 0,25 i alle tilfeller, noe som indikerer at eventuelle sammenhenger mellom helbredelse og alder, dager lagret i Optisol, død til innsamlingsintervall eller celletetthet ble ansett som ubetydelige. Forskjellen i helbredelse mellom menn og kvinner var ikke statistisk signifikant (p = 0,53).
I likhet med det normale datasettet, presenterte 10 av de 22 dystrofiske hornhinnene bemerkelsesverdig Trypan-farging utenfor det stripete området som er koblet til det fargede området innenfor lesjonen i minst ett tidspunkt (vanligvis dag 3) - en observasjon vi kalte perifer farging (figur 4A). Av disse 10 var bare to kontroll corneas hvis behandlede kolleger ikke hadde samme effekt. De resterende åtte var alle matchet par og presentert med lignende alvorlighetsgrad mellom hornhinner fra samme person. Selv om farging mønstre var sammenlignbare mellom normale og dystrofiske hornhinnen, frekvensen av perifer farging var høyere i dystrofiske datasett med 45% av hornhinnen positiv, sammenlignet med 25% i den normale gruppen. Figur 4A viser et par som ble ansett som positive for perifer farging, da det fargede området utenfor lesjonen møtte sårkanten i dag 6-bildene og gradvis trakk seg tilbake. I de tilsvarende Alizarin Red-bildene virket celler i områder med perifer Trypan-farging forstørret og unormalt formet, omtrent som cellene som migrerte inn i det stripete området, og negativ farging korrelert med områdene der Trypan Blue var til stede på dag 14. Til tross for den store delen av hornhinnen som er berørt gjennom hele kulturperioden, skjedde delvis eller fullstendig rydding av den fargede periferien i alle 10 hornhinner. I tillegg var den endelige prosenten helbredet på dag 14 innenfor det normale området, henholdsvis til behandlingsgruppe, for alle unntatt en hornhinne. Den ytterste (0811L, avbildet i figur 4A) returnerte en negativ prosent helbredet verdi på grunn av restene av perifer farging som fortsatt er koblet til lesjonsområdet på dag 14 (figur 3A og figur 4A). Et annet fargemønster, referert til som langt perifer farging, ble tatt i Alizarin Red-bildene fra figur 4B, men var også tydelig i Trypan Blue-bilder gjennom hele kulturperioden i mange hornhinner (figur 4B). Denne observasjonen er preget av en ring av mørk farging rundt limbusen, noe som indikerer kompromittert endotel. Til tross for begrepet var dette mønsteret så vanlig i både normale og dystrofiske hornhinnen at de ikke ble regnet som positive for perifer farging. I disse bildene viste kontroll hornhinnen mer levende og omfattende farging på dag 14, til tross for at begge hornhinner har lignende alvorlighetsgrad og mønster av farging tidlig i kulturperioden. Også bemerket i den behandlede hornhinnen var et tilsynelatende større antall celler, som virket mer kompakte og sekskantede sammenlignet med kontroll, selv om disse observasjonene ikke ble kvantitativt målt. På grunn av krumningen i periferien ble bare Trypan-farging i og umiddelbart rundt det stripete området inkludert i kvantitativ analyse. Når prosentfargede verdier ble gjennomsnittet på tvers av alle dystrofiske hornhinnen, resulterte fremveksten av perifer farging i en innledende økning fra dag 0, i motsetning til den stadige nedgangen sett i normale hornhinnen der perifer farging var mindre utbredt (figur 3B).
Immunhiistokjemi visualisert ved konfokal avbildning avslører semi-organisert uttrykk for ZO-1, en funksjonell markør for CEC tette veikryss, i og rundt lesjonskanten (figur 5), et mønster tilsvarende bevist av Alizarin Red-fargingen (figur 2 og figur 4). Pleomorfisme og polymegathisme er synlige av ZO-1 i de fleste dystrofiske hornhinner; Imidlertid kan denne observasjonen tilskrives deres syke tilstand og ble notert av øyebanken ved spektrisk undersøkelse av hornhinnene før dyrking. Uorganisert ZO-1 uttrykk observeres innenfor lesjonsområdet av behandlede hornhinnen hvor celler hadde migrert innover, også i samsvar med Alizarin Røde mønstre. EdU-inkorporerende celler kan ses rundt lesjonens kant og innsiden av det lesjonerte området i kontroll og behandlede hornhinnener (figur 5). Mønsteret av migrerte CED-er gjenspeiler også Trypan Blue-resultatene, der de fleste celler i kontroll corneas ble funnet innenfor to felt av lesjonskanten, mens CECer i behandlede hornhinner kan ses i hele det stripete området (figur 2).
EdU-merking ble utført som et kvalitativt tiltak i denne studien for å bekrefte at spredning bidro til helbredelse. Kvantifisering av celler som inkorporerte EdU kunne imidlertid ikke utføres systematisk på grunn av hornhinnen hevelse hindrer konsistente, replikerbare bilder fra å bli fanget i og rundt lesjonen. Som surrogat er kvantitativ analyse utført i en studie utført før etablering av DSO-modellen inkludert for å demonstrere effekten av eFGF-1 (NM141) på spredning (figur 6). Normale humane donor hornhinnen ble kuttet i kvartaler ved hjelp av en skalpell og dyrket i nærvær av EdU, med eller uten eFGF1 (NM141) i 48 timer som beskrevet tidligere (Eveleth, 2020)16. Avbildning og påfølgende analyse av Hoechst 33342 og EdU-merkede celler ble utført separat i den uforstyrrede midtsonen i kvartalene og i kantsonen, innen tre felt hvor hornhinnen ble kuttet. I midtsonen var prosentandelen celler som inkorporerte EdU lav og svært variabel på tvers av de 10 hornhinnene som ble analysert. I gjennomsnitt hadde kvartaler behandlet med eFGF1 (NM141) høyere nivåer av EdU-inkorporering i midtsonen (4,1 % ± 7,9 %) sammenlignet med kontroller (1,8 % ± 2,9 %), selv om denne forskjellen ikke var statistisk signifikant (p = 0,239). Ved sårkanten viste behandlede kvartaler stimulert med eFGF1 (NM141) signifikant høyere forekomst av EdU-inkorporering ved gjennomsnitt (18,1 % ± 11,5 %) sammenlignet med kontrollkvartaler (10 % ± 9,6 %, p = 0,012).
Tabell 1: Donorinformasjon for 22 dystrofiske og 20 normale hornhinnen som brukes i denne studien, samt 10 normale hornhinnener som tidligere ble brukt til EdU-kvantifisering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/Table%201_Donor%20info.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig02.jpg"> Figur 2: Vital fargestofffarging av hornhinner etter descemets stripping. Dystrofiske humane hornhinner ble strippet for den sentrale 4 mm av Descemets membran og inkubert med eller uten eFGF1 (NM141) (100 ng/ml) i 14 dager. Lesjoner ble visualisert av Trypan Blue-farging på dag 0, 3, 6, 9, 12 og 14. CEC-grenser ble visualisert av Alizarin Red-farging på dag 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig03v2.jpg"> Figur 3: Dystrofiske humane hornhinnener viser betydelig større helbredelse fra DSO når de dyrkes med eFGF1 (NM141). (A) Prosentheling ble bestemt ved å måle det fargede området på dag 14 ved hjelp av ImageJ og sammenligne det med prosentandelen farget på dag 0. (B) Den gjennomsnittlige prosenten som er farget grafert over tid viser en jevn nedgang i normale hornhinnen mens den topper på dag 3 i dystrofiske hornhinnen på grunn av høyere forekomst av perifer farging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig03largev2.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig04.jpg"> Figur 4: Vital fargestofffarging av dystrofiske hornhinnener med perifer farging. (A) Trypan farging av den intakte Descemets membran kan sees fremover mot midten, og deretter rydde over tid i både kontroll og behandlede hornhinner. (B) Alizarin mønstre rundt limbus representerer en typisk observasjon av perifer skade og uorganisert re-etablering av endotel sett i mange donor hornhinnen-i dette tilfellet dystrofisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig05.jpg"> Figur 5: Stimulering av migrasjon og spredning av CED ved eFGF1 (NM141) i stripete dystrofiske hornhinner. Konfokale mikrografer av Descemets stripete hornhinner farget for ZO-1 (rød), EdU (grønn) og Hoechst 33342 (blå). Den stiplede linjen representerer lesjonskanten med det stripete området på venstre side av bildet og den intakte Descemet-membranen til høyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig06v2.jpg"> Figur 6: Kvantifisering av spredningsceller fra normale hornhinnen kvartalsvis ved hjelp av en skalpell og inkubert i medier som inneholder EdU med eller uten eFGF-1 (NM141) i 48 timer. Kvartalene ble avbildet i triplikat i den uforstyrrede midtsonen og langs kuttkanten, og teller i gjennomsnitt for å bestemme prosentandelen celler som inkorporerer EdU i midt- og kantsonene. Figur endret fra Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, brukt med tillatelse16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig06largev2.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplerende figur 1: Normale humane hornhinnener viser betydelig større helbredelse fra DSO når de dyrkes med eFGF1 (NM141). ImageJ ble brukt til å måle de fargede områdene og bestemme % helbredelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet's Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1 at JoVE.com

A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet's Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1

Descemet's Stripping Only er en eksperimentell prosedyre der pasienter med sentral hornhinnen guttae som følge av Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy har Descemets membran strippet for perifere celler for å regenerere endotellaget. Vi presenterer ny metodikk som simulerer DSO i dystrofiske menneskelige hornhinner ex vivo med akselerert helbredelse stimulert av eFGF1 (NM141).

En menneskelig hornhinnen organ kultur modell av descemet stripping bare med akselerert healing stimulert av konstruert Fibroblast vekstfaktor 1

Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) results from dysfunctional corneal endothelial cells (CECs) and is currently treated by transplantation of the ...

Hensikten med denne videoen er å beskrive en menneskelig hornhinnen organ kultur modell av Descemet stripping Bare med akselerert helbredelse, stimulert av konstruert fibroblast vekstfaktor en. Fuch's Endothelial Corneal Dystrophy, eller FECD, er en sykdom preget av tapt pumpefunksjon i hornhinnen endotelceller og overdreven oppbygging av kollagen og andre ekstracellulære matriseproteiner på overflaten av Descemets membran, danner hornhinnen guttae. Den eneste kjente behandlingen for FECD er endotel keratoplastikk i forskjellige former, som alle har risiko for avvisning og endotelcelletap.Mens fremskritt i oftalmisk kirurgi har gjort det mulig for disse prosedyrene å bli mindre invasive over tid, noen form for transplantasjon kommer med risikoen for avvisning og mulighet for livstid steroid bruk. Descemet's Stripping Only, eller DSO, er et eksperimentelt alternativ der FECD-pasienter med guttae lokalisert til midten av hornhinnen har den sentrale fire millimeter sirkelen av Descemets membran fjernet uten graft erstatning. Fjerningen av guttae oppfordrer sunne perifere celler til å migrere innover og reformere endotelmonolayeren, til slutt reversere stromal ødem og forbedre synet.Selv om det er mange fordeler med denne metoden, er helbredelsesprosessen lang og inkonsekvent, og noen pasienter krever redningstransplantasjon hvis ingen helbredelse ses i månedens etterfølgende kirurgi. En behandling som stimulerer raskere sårtilheling etter DSO, kan gjøre prosedyren til et mer gjennomførbart alternativ for pasienter med FECD. Denne protokollen modellerer den kliniske DSO-prosedyren i et organkulturformat ved hjelp av humane donor corneas, med sikte på å teste behandlinger for å forbedre sårheling etter DSO, for å gjøre DSO til et mer mulig alternativ for pasienter med FECD.Laboratoriet vårt bruker denne modellen til å teste sårheling i hornhinnen behandlet med en konstruert fibroblast vekstfaktor som vi vil vise representative resultater senere i denne videoen. I denne delen av prosedyren vil en biopsistans bli brukt til å markere det fire millimeter sårområdet som Descemets membran vil bli strippet fra. Bruk sterile tang, fjern hornhinnen fra media og skyll i 1X PBS for å fjerne gjenværende medier og cellerester.Etter skylling, plasser hornhinnen endotelsiden opp på lokket på en Petri-tallerken. Dypp en ny fire millimeter biopsi punch i trypan blå i en sveisefat og trykk av overflødig. Bruk begge hender til å plassere slaget over midten av hornhinnen og senk det rett ned på endoteloverflaten, og påfør minimalt trykk.Uten å endre posisjonen eller trykket på hornhinnen, flytt slaget til en hånd og strekk etter tang med den nylig frie hånden. Bruk tangene til å holde hornhinnen på plass mens du forsiktig vrir biopsi slag ca 90 grader frem og tilbake flere ganger. Løft biopsi slag rett opp fra hornhinnen og sett til side.Skyll igjen i 1X PBS for å fjerne overflødig trypan blå. Overfør hornhinnen på Petri parabolen lokket til en dissekering omfang. Holde hornhinnen på plass med buede tang score Descemet membran ved lett å dra spissen av en skarp 30 gauge nål langs ringen av trypan blå igjen av biopsi punch.Bruk minimalt trykk for å unngå å forstyrre den underliggende stromaen. Med en sinskey krok bruk milde scooping bevegelser for å løfte og skrelle tilbake Descemets membran rundt sårkanten. Arbeider mot midten av lesjonen.Descemets membran skal komme opp med svært liten motstand. Hvis du har problemer, trekker du sannsynligvis opp stroma. Hvis dette skjer, start igjen, løft fra et nytt punkt langs sårkanten.Når flertallet av Descemets membran er skilt fra stroma, bruk Gorovoy tang for å fjerne membranen og sette til side. Undersøk det stripete området for eventuelle gjenværende biter av membran og fjern med Gorovoy tang. Etter Descemets stripping flekker hornhinnen med trypan blå for å visualisere sårområdet.Skyll hornhinnen i 1X PBS som inneholder 0,01% kalsiumklorid og magnesiumklorid for å fjerne celleavfall som kan samhandle med trypanblått og lette tett overholdelse av de resterende CED-ene til den intakte Descemets membran. Legg hornhinnen i en sveiset tallerken og pipette 30 mikroliter trypanblå på endotellaget i 30 sekunder. Bruk tang for å forsiktig rocke hornhinnen for å sikre at hele endoteloverflaten er dekket.Skyll av overflødig trypan blå i PDS med kalsium og magnesium, og bilde den fargede hornhinnen under et dissekerende mikroskop for dagen null tidspunkt. Etter at denne prosedyren er fullført, kultur corneas i en seks brønnplate som inneholder lavt serum media bestående av følgende oppførte komponenter. Kultur venstre hornhinne i åtte møller med lave serummedier alene, og høyre hornhinne i lave serummedier supplert med konstruert fGF-1 eller andre ønskede testbehandlinger.Inkuber hornhinnene ved 37 grader Celsius med 6% CO2 i 14 dager med daglige medieendringer. Gjenta trypan farging prosedyren på dager, tre, seks, ni, 12 og 14, og bilde hver hornhinne umiddelbart etter farging. Sørg for å holde kamerainnstillingene konsekvente på tvers av alle tidspunkter.Etter kulturperioden kan ytterligere flekker utføres på hornhinnene basert på forskningsinteresser, spesielt for eksperimentet. Ytterligere flekker som er relevante for laboratoriets forskningsinteresser inkluderer Alizarin-farging, samt fluorescerende farging for EDU-inkorporering og ZO-1 tette koblingsproteiner. Alizarin farging utføres for å visualisere cellekantlinjer for å bekrefte trypan farging resultater og visualisere cellemorfologi i det helbredede området.ZO-1 immunfluorescerende farging muliggjør visualisering av tett koblingsdannelse mellom CED-er som er spesielt interessant for og rundt det helbredede området. EdU-merking utføres som et kvalitativt tiltak for å bekrefte at spredning bidrar til helbredelse og kan også brukes til å kvantifisere spredningsceller i noen sammenhenger. Mer detaljerte instruksjoner om hvordan du utfører disse spesifikke fargingsprosedyrene er inkludert i artikkelen som tilsvarer denne videoen.Her er representative bilder av et par hornhinner dømt dystrofisk av Eye-Bank som ble inkubert med eller uten konstruert FGF-1 over en periode på 14 dager. Som vist på bildene, den konstruerte FGF-1 behandlet hornhinnen demonstrert akselerert helbredelse sammenlignet med ubehandlet kontroll hornhinnen. Ytterligere Alizarin-farging på slutten av kulturperioden, tjente til å avgrense cellegrenser og bekreftet med disse funnene.Denne observasjonen ble replikert over 11 par dystrofiske hornhinner for å validere modellen i en prøve av hornhinnens mest relevante for den kliniske DSO-prosedyren. Bildebehandlingsprogramvare, for eksempel ImageJ, kan brukes til å måle det fargede området i disse bildene for å kvantifisere sårhelingsfremdrift, som det kan ses her. Alle dystrofiske hornhinnen behandlet med konstruert FGF-1 viste større helbredelse på dag 14, sammenlignet med den ubehandlede kompisen, noe som resulterte i et gjennomsnitt på 91% helbredelse i motsetning til 38% i kontroll hornhinnen.Og denne forskjellen var statistisk signifikant. Ytterligere immunhiistokjemi visualisert ved konfektavbildning avslørte semiorganisert uttrykk for ZO-1 tett koblingsprotein, som reflekterer tidligere Alizarin-fargemønstre. EDU-merking bekreftet tilstedeværelsen av spredningsceller i og rundt sårområdet og var synlig på høyere nivåer i behandlede hornhinn sammenlignet med ubehandlede kontroller.I noen hornhinnepar kan CEC-død være synlig perifert for sårområdet, spesielt i dystrofiske hornhinner. Her er eksempelbilder av trypan farget hornhinnen viser betydelig perifer celledød. Som det fremgår av bildene, skjer perifer celledød først og fremst på tidligere tidspunkter og reverserer gradvis over kulturperioden.Denne perifere fargingen kan komplisere mengden av sårområdet når det kobles til såret, da det kan være vanskelig å fastslå plasseringen av sårområdekanten. Men i alle tilfeller, den perifere trypan flekker ryddet nok til å produsere målbare bilder på den siste dagen 14 tidspunkt. Vi tror dette fenomenet er unikt for donor corneas kultivert ex vivo, og er ikke relevant for menneskelige hornhinnen in vivo.Siden skade på det perifere endotelet ikke er rapportert i noen kliniske casestudier av DSO til vår kunnskap. Et annet fargemønster referert til som langt perifer farging, ble tatt i Alizarin Red-bildene, men var også tydelig i trypanblå bilder gjennom hele kulturperioden. Denne observasjonen er preget av en ring av mørk farging rundt limbusen som indikerer kompromittert endotel.Til tross for begrepet var dette mønsteret så vanlig i både normale og dystrofiske hornhinnen at de ikke ble regnet som positive for perifer farging. Denne protokollen tillot oss å demonstrere forbedrede helbredende resultater i dyrkede hornhinner behandlet med konstruert FGF-1 etter Descemets stripping. I tillegg fungerer denne strippingsprotokollen som en verdifull metode for andre forskere som studerer DSO og kan brukes til et bredt spekter av applikasjoner, inkludert testing av andre sårhelingsterapier, evaluering av modifikasjoner på kirurgisk teknikk og sammenligning av helbredelse på tvers av forskjellige donorpopulasjoner eller stadier av sykdom.Vi håper at denne forskningen og annen forskning som bruker denne protokollen oppfordrer klinikere til å vurdere DSO som et verdifullt behandlingsalternativ for sine kvalifiserte FECD-pasienter i fremtiden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murine Hornhinnen Transplantasjon: En modell for å studere den vanligste formen for organtransplantasjon

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Hornhinnen Donor Vevpreparerina for Descemefs Membrane endotel Keratoplasty

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Three Different Protocols of Corneal Collagen Crosslinking in Keratoconus: Conventional, Accelerated and Iontophoresis

Tre ulike protokoller hornhinne Collagen Fornetting i Keratokonus: Konvensjonell, akselerert og iontoforese

Keratoconus is a bilateral and progressive corneal ectasia. In order to slow down its progression, corneal collagen cross-linking (CXL) has recently been ...

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

Heterotop Nedsatt autotransplantasjon i en svinekjøtt Modell: A Step-by-Step-protokollen

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategisk endotelcelle Tube Dannelse analyse: Sammenligning ekstracellulær matriks og Growth Factor Redusert ekstracellulær matriks

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Induksjon av akselerert aterosklerose hos mus: "Wire-Injury" Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Creation of a Rodent Model of Abdominal Aortic Aneurysm by Blocking Adventitial Vasa Vasorum Perfusion

Etableringen av en gnager modell av abdominalt aortaaneurisme blokkerer Adventitial Vasa Vasorum perfusjon

The adventitial vasa vasorum (VV) provides oxygen and nourishment to the aortic wall. Hypoxia in the aortic wall can cause enlarged abdominal aortic ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Undersøker von Willebrand faktor Patofysiologien ved hjelp av en Flow Chamber modell av von Willebrand faktor-Platederivert streng formasjon

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hornhinnen Epithelial slitasje med okulær Burr som modell for hornhinnen sårtilheling

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...