Name: a human corneal organ culture model of descemet's stripping only with accelerated healing stimulated by engineered fibroblast growth factor 1
Uploaded: 2022-07-22T13:30:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet's Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1 at JoVE.com

Bu çalışmanın finansmanı Trefoil Therapeutics ve NIH NCATS TRND CRADA #2016-04 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, histopatoloji önerileri ve hizmetleri için Tony Wong'a, konfokal mikroskoplarını kullandıkları için UC San Diego'daki Nikon Görüntüleme Merkezi'ne ve cerrahi teknik konusundaki tavsiyeleri için Dr. Natalie Afshari ve Marian Macsai'ye teşekkür etmek istiyor. Ek olarak, yazarlar kornea sağladıkları için göz bağışçılarına ve göz bankalarına şükranlarını sunarlar.

Bu çalışma, deneklerin tanımlanması olmadan mevcut örnekleri kullanmıştır ve 45 CFR 46.101 (b) (4) uyarınca IRB onayından muaftır.
İnsan donör korneaları ABD'deki çeşitli göz bankalarından elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Kornealar, speküler değerlendirme sonucunda guttae, pleomorfizm, polimegatiz ve/veya düşük EKD gibi bulgulara dayanarak göz bankaları tarafından bireysel olarak distrofik olarak değerlendirildi. Şekil 1 , yara oluşumu sırasında, sıyırmadan hemen sonra ve kültürde 2 hafta sonra korneada Tripan Mavisi lekelenmesini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig01.jpg"> Şekil 1: Yara oluşumu sırasında, sıyırma işleminden hemen sonra ve Trypan Blue tarafından görselleştirildiği gibi kültürde 14 gün sonra korneayı temsil eden diyagram. Bu zaman noktaları arasındaki lekeli alandaki azalma, iyileşme seviyesini belirlemek için ölçüldü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
1. Yara oluşumu
<ol><li>Steril forseps kullanarak, korneayı ortamdan çıkarın ve artık ortamı ve hücre kalıntılarını gidermek için 1x PBS'de durulayın. Duruladıktan sonra, kornea endotel tarafını bir Petri kabının kapağına yerleştirin.</li>
	<li>Pipet, 30 μL Trypan Blue'yu iyi hazırlanmış bir tabağa koyun. Tripan Mavisi'ne yeni bir 4 mm'lik biyopsi yumruğunu batırın ve fazlalıklardan yararlanın.</li>
	<li>Her iki elinizi kullanarak, zımbayı korneanın merkezinin üzerine yerleştirin ve minimum basınç uygulayarak doğrudan endotel yüzeyine indirin.</li>
	<li>Kornea üzerindeki pozisyonu veya basıncı değiştirmeden, yumruğu bir elinize kaydırın ve yeni serbest bırakılan el ile forsepslere uzanın. Biyopsi yumruğunu birkaç kez yaklaşık 90 ° ileri geri bükerken korneayı yerinde tutmak için forsepsleri kullanın.</li>
	<li>Zımbayı korneadan yukarı doğru kaldırın ve bir kenara koyun.</li>
	<li>Fazla Tripan Mavisi'ni çıkarmak için 1x PBS'de bir kez daha durulayın.</li>
</ol>2. Descemet'in sıyırması
<ol><li>Petri kabı kapağındaki kornea'yı diseksiyon kapsamına aktarın. NOT: Korneayı 5 dakikadan daha uzun süre kuru bırakmayın. İşlemi tamamlamak için daha fazla zamana ihtiyaç duyulursa, endoteli yeniden sulandırmak için 1x PBS'de tekrar durulayın.</li>
	<li>Korneayı kavisli forsepslerle yerinde tutarak, biyopsi yumruğunun bıraktığı Trypan Blue halkası boyunca keskin bir 30 G iğnenin ucunu hafifçe sürükleyerek Descemet'in zarını puanlayın. Altta yatan stromayı bozmamak için minimum basınç kullanın.</li>
	<li>Bir Sinskey kancasıyla, lezyonun merkezine doğru çalışarak Descemet'in zarını yara kenarının etrafına kaldırmak ve soymak için nazik kepçe hareketleri kullanın. NOT: Descemet'in zarı çok az direnç göstermelidir. Zorluk yaşanırsa, muhtemelen stroma yukarı çekilir. Bu olursa, yara kenarı boyunca yeni bir noktadan kaldırarak tekrar başlayın.</li>
	<li>Descemet'in zarının çoğunluğu stromadan ayrıldıktan sonra, zarı çıkarmak ve bir kenara koymak için Gorovoy forseps kullanın.</li>
	<li>Kalan membran parçaları için sıyrılmış alanı inceleyin ve Gorovoy forseps ile çıkarın.</li>
</ol>3. Tripan Mavi boyama
NOT: Descemet'in sıyırılmasını takiben, yara bölgesini görselleştirmek için korneayı Tripan Mavisi ile lekeleyin.
<ol><li>Petri kabı kapağındaki korneayı biyogüvenlik kabinine geri koyun ve hücre kalıntılarınıgidermek ve kalan CEC'lerin bozulmamış Descemet zarına sıkı bir şekilde yapışmasını kolaylaştırmak için% 0.01 (w / v) CaCl 2 ve MgCl2 içeren 1x PBS'de durulayın.</li>
	<li>Korneayı iyi hazırlanmış bir kaba koyun ve 30 sn'lik endotel tabakasına 30 sn.<ol>
<li>Tüm endotel yüzeyinin kaplandığından emin olmak için korneayı hafifçe sallamak için forseps kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fazla Tripan Mavisi'ni 1x PBS'de% 0.01 (w / v) CaCl2 ve MgCl2 ile durulayın ve lekeli korneayı 0. Gün zaman noktası için diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin.<ol>
<li>Korneanın dengelendiğinden emin olun, böylece ışık boyunca eşit olarak iletilir ve konumlandırma zaman noktaları arasında tekrarlanabilir. NOT: Forseps, gerekirse görüntüleme sırasında korneayı yerinde tutmak için kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Kültür dönemi
<ol><li>OptiMEM'den oluşan düşük serum içeren altı kuyucuklu bir plakada kültür korneaları; 1x insülin, transferrin ve selenyum; 1x antibiyotik/antimikotik; 0.02 mg/mL CaCl2; 0.2 mg/mL askorbik asit; ve% 0.8 ısı inaktive fetal sığır serumu. Sol korneayı sadece 8 mL düşük serum ortamında ve sağ korneayı 100 ng / mL eFGF1 (NM141) ile desteklenmiş 8 mL düşük serum ortamında kültürleyin.<ol>
<li>Günlük medya değişiklikleri ile 14 gün boyunca% 6 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trypan Blue boyama prosedürünü 3, 6, 9, 12 ve 14. günlerde tekrarlayın ve boyama işleminden hemen sonra her korneayı görüntüleyin. Kamera ayarlarını tüm zaman noktalarında tutarlı tuttuğunuzdan emin olun.</li>
	<li>12. Günde, hem kontrol hem de eFGF1 (NM141) takviyeli ortama 10 μM EdU ekleyin ve çoğalan hücreleri etiketlemek için 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın. 13. günde tekrar eklenen EdU ile medyayı yenileyin.</li>
	<li>14. Günde, EdU, Trypan boyası ve görüntü kornealarının eklenmesinden 48 saat sonra, CaCl 2 ve MgCl2 ile 1x PBSyerine, kalsiyumun Alizarin Kırmızı lekesi ile etkileşime girmesini önlemek için durulamalar için düz 1x PBS kullanın.</li>
</ol>5. Alizarin Kırmızı boyama
<ol><li>14. Günde,% 0.9 tuzlu su çözeltisinde% 5 Alizarin Kırmızısı hazırlayın. NOT: Alizarin Kırmızısı tuzlu su çözeltisi içinde tamamen çözünmeyecektir. Birleştirildikten sonra, vorteks çözeltisi ve en az 1 saat boyunca sallanır. Bir kez daha vorteks yapın ve çözülmemiş parçacıkları çıkarmak için kullanmadan önce filtreleyin.</li>
	<li>Tripan boyama ve görüntüleme tamamlandıktan sonra, korneaları iyi bir kaba aktarın ve her korneanın endotel yüzeyine 200 μL Alizarin Kırmızısı ekleyin.<ol>
<li>2 dakika bekletin, ardından iki 5 dakikalık yıkama için 8 mL 1x PBS ile önceden doldurulmuş altı kuyucuklu bir tabağa yerleştirmeden önce fazla Alizarin Kırmızısı'nı çıkarmak için her korneayı 1x PBS'lik bir Petri kabında durulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İkinci yıkamadan sonra, her korneanın soyulmuş bölgesini diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin. NOT: Trypan görüntülemeden farklı olarak, kornealar, işlem sırasında kurumasını önlemek için Alizarin boyamasını görüntülemek için 1x PBS'de bırakılabilir.</li>
</ol>6. Fiksasyon ve geçirgenlik
<ol><li>Alizarin görüntüleri yakalandıktan sonra, korneaları 12 delikli bir plakaya aktarın ve fiksasyondan önce dokudan herhangi bir parçacığı çıkarmak için% 0.05 Tween-20 (PBS-T) içeren 4 mL 1x PBS'de 30 dakika boyunca yıkayın.</li>
	<li>Korneaları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 PFA'nın 4 mL'sinde sabitleyin.</li>
	<li>% 1 Triton X-100 içeren 4 mL 1x PBS'de hücreleri 5 dakika geçirgenleştirin, ardından her biri 30 dakika boyunca 4 mL düz 1x PBS'de üç kez yıkayın.</li>
</ol>7. İmmünohistokimya
<ol><li>Korneaları, %2 sığır serum albümini ve %2 keçi serumu içeren 4 mL 1x PBS'de 37°C'de 1 saat boyunca bloke edin.</li>
	<li>37°C'de 1 saat boyunca 2,5 μg/mL primer antikor fare anti-ZO-1 içeren 1 mL'lik bloke edici solüsyonda inkübe edin, ardından her biri 30 dakika boyunca 4 mL 1x PBS'de üç kez yıkayın. NOT: Plaka, gerekli reaktiflerin hacmini en aza indirmek için antikor boyama sırasında eğilebilir. Sadece tüm korneanın tamamen antikor çözeltisine batırıldığından emin olun.</li>
	<li>0,88 mg/mL askorbik asit, 0,26 mg/mL CuSO 4 ve 2,5 μM Alexa Fluor488 azid içeren bir kokteyl kullanarak EdU Click-iT reaksiyonunu gerçekleştirin.<ol>
<li>Reaksiyon bileşenlerini hazırlama<ol>
<li>Çözünene kadar 88 mg askorbik asit ve vortekse 500 μL 1x PBS ekleyin.</li>
			<li>44 mgCuSO 4'e 840 μL deiyonize su ekleyin ve çözünene kadar vorteks.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aşağıdaki reaktifleri bu sırayla 6 mL'lik 1x PBS'ye ekleyerek, her eklemeden sonra karıştırmak üzere tüpü ters çevirerek kokteyl hazırlayın: 30 μL askorbik asit çözeltisi, 30 μL CuSO4 çözeltisi ve ardından 15 μL Alexa Fluor 488 NOT: Bir kez hazırlandıktan sonra, bu çözelti ışığa duyarlıdır. Protokolün geri kalanı için, kornealar mümkün olduğunca ışıktan korunmalıdır.</li>
		<li>Her korneaya 1 mL EdU reaksiyon kokteyli ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat reaksiyona sokun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her korneaya 4 mL 10 μg / mL Hoechst 33342 ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika reaksiyona girin, ardından her biri 30 dakika boyunca 1x PBS-T'de üç kez yıkayın.</li>
	<li>2 μg/mL Alexa Fluor 555 etiketli keçi fare karşıtı IgG içeren 1 mL'lik bloke edici çözeltiyi 37°C'de 1 saat boyunca inkübe edin, ardından her biri 30 dakika boyunca 1x PBS-T'de üç kez yıkayın.</li>
	<li>Korneaları 4 °C'de 4 mL'lik 1x PBS'de %1 anti/anti, %0,1 siprofloksasin ve %0,1 Amfoterisin B ile depolayarak mikrobiyal büyümeyi önleyin.</li>
	<li>Konfokal görüntüleme yaparken, tüm korneaları 200 μL montaj ortamına, kapak kayması düzleştirmek için bantlanmış cam slaytlara monte edin.</li>
</ol>8. Trypan Görüntü Analizi
<ol><li>NIH'nin açık kaynaklı yazılımı ImageJ'yi kullanarak tüm görüntü analizlerini gerçekleştirin. Dosya > Aç'ı kullanarak bir görüntü açın ve Görüntü > Renk eşiğini ayarla>yı tıklatın.</li>
	<li>Yalnızca mavi aralığı kapsayacak şekilde "Ton" kaydırıcılarını kullanın ve lekeli alanın daha fazlasını içerecek şekilde üst "Parlaklık" kaydırıcısını sola doğru ayarlayın. NOT: Bu eylem, görüntünün Trypan lekeli olmayan bölümlerinin dahil edilmesine neden olursa, "Parlaklık" kaydırıcısı orijinal düzeyine döndürülebilir.</li>
	<li>Eşik lekeli alanı doğru bir şekilde özetleyene kadar üst "Doygunluk" kaydırıcısını yavaşça ayarlayın. NOT: Bu işlem sırasında başvurmak üzere orijinal görüntünün bir kopyasının açık olması yararlı olacaktır.</li>
	<li>Renk eşiği menüsündeki Seç düğmesini tıklayın, sonra alınan yaranın dışındaki alanların seçimini kaldırmak için seçim fırçası aracını kullanın.</li>
	<li>Lekeli alanı piksel cinsinden bildirmek için Analiz > Ölçü'yü tıklayın.</li>
	<li>> Seçimini Düzenle'yi kullanarak tümünün seçimini kaldırın > Hiçbirini Seçme'yi seçin ve limbüse mümkün olduğunca yakın oturması için oval seçim aracını kullanın, ardından korneanın alanını piksel cinsinden raporlamak için > Ölçüyü Analiz Et'i tıklayın. NOT: Görüntünün bu kısmı çok karanlıksa limbusun görselleştirilmesine yardımcı olmak için parlaklık geçici olarak açılabilir.</li>
	<li>Alan değerlerini kaydedin ve lekeli bölgeyi tüm korneanın alanına bölün, ardından lekeli yüzdeyi hesaplamak için 100 ile çarpın.</li>
	<li>Bu işlemi her görüntü için iki kez daha tekrarlayın, ardından üç ölçümün ortalamasını alın.</li>
</ol>9. İstatistiksel Analiz
<ol><li>Tüm görüntüler analiz edildikten sonra, kalan iyileşmemiş alanı belirlemek için 14. Günde boyanan ortalama yüzdeyi 0. Günde lekelenen yüzdeye bölün. 14 gün içinde iyileşen soyulmuş alanın yüzdesini hesaplamak için bu miktarı% 100'den çıkarın.</li>
	<li>Kontrol ve tedavi grupları arasındaki yüzde iyileşmiş değerleri karşılaştırmak için eşleştirilmiş bir t-testi kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eghrari, A. O., Gottsch, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuchs'+corneal+dystrophy.">Fuchs' corneal dystrophy.</a> Expert Review of Ophthalmology. 5 (2), 147-159 (2010).</li><li>Ku, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+loss+in+penetrating+keratoplasty,+endothelial+keratoplasty,+and+deep+anterior+lamellar+keratoplasty.">Endothelial cell loss in penetrating keratoplasty, endothelial keratoplasty, and deep anterior lamellar keratoplasty.</a> Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (4), 199 (2017).</li><li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+survey+of+corneal+transplantation+and+eye+banking.">Global survey of corneal transplantation and eye banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Braunstein, R. E., Airiani, S., Chang, M. A., Odrich, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+edema+resolution+after+&amp;#34;descemetorhexis&amp;#34.">Corneal edema resolution after &amp;#34;descemetorhexis&amp;#34.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 29 (7), 1436-1439 (2003).</li><li>Pan, J. C., Eong, K. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+resolution+of+corneal+oedema+after+inadvertent+'descemetorhexis'+during+cataract+surgery.">Spontaneous resolution of corneal oedema after inadvertent 'descemetorhexis' during cataract surgery.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 34 (9), 896-897 (2006).</li><li>Shah, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+corneal+clearing+after+Descemet's+stripping+without+endothelial+replacement.">Spontaneous corneal clearing after Descemet's stripping without endothelial replacement.</a> Ophthalmology. 119 (2), 256-260 (2012).</li><li>Ziaei, M., Barsam, A., Mearza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+corneal+clearance+despite+graft+removal+in+Descemet+stripping+endothelial+keratoplasty+in+Fuchs+endothelial+dystrophy.">Spontaneous corneal clearance despite graft removal in Descemet stripping endothelial keratoplasty in Fuchs endothelial dystrophy.</a> Cornea. 32 (7), 164-166 (2013).</li><li>Huang, M. J., Kane, S., Dhaliwal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Descemetorhexis+without+endothelial+keratoplasty+versus+DMEK+for+treatment+of+fuchs+endothelial+corneal+dystrophy.">Descemetorhexis without endothelial keratoplasty versus DMEK for treatment of fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Cornea. 37 (12), 1497 (2018).</li><li>Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+corneal+clearance+with+the+use+of+a+rho-kinase+inhibitor+after+descemetorhexis+without+endothelial+keratoplasty+for+Fuchs+endothelial+corneal+dystrophy.">Pilot study of corneal clearance with the use of a rho-kinase inhibitor after descemetorhexis without endothelial keratoplasty for Fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Cornea. 40 (7), 899-902 (2021).</li><li>Macsai, M. S., Shiloach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+topical+rho+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+Fuchs+dystrophy+after+Descemet+stripping+only.">Use of topical rho kinase inhibitors in the treatment of Fuchs dystrophy after Descemet stripping only.</a> Cornea. 38 (5), 529-534 (2019).</li><li>Moloney, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Descemetorhexis+without+grafting+for+Fuchs+endothelial+dystrophy-supplementation+with+topical+ripasudil.">Descemetorhexis without grafting for Fuchs endothelial dystrophy-supplementation with topical ripasudil.</a> Cornea. 36 (6), 642-648 (2017).</li><li>Thalmann-Goetsch, A., Engelmann, K., Bednarz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+the+effects+of+different+growth+factors+on+migration+of+bovine+corneal+endothelial+cells+during+wound+healing.">Comparative study on the effects of different growth factors on migration of bovine corneal endothelial cells during wound healing.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 75 (5), 490-495 (1997).</li><li>Landshman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cat+corneal+endothelium+induced+in+vivo+by+fibroblast+growth+factor.">Regeneration of cat corneal endothelium induced in vivo by fibroblast growth factor.</a> Experimental Eye Research. 45 (6), 805-811 (1987).</li><li>Lee, J., Blaber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+functional+half-life+of+fibroblast+growth+factor-1+by+recovering+a+vestigial+disulfide+bond.">Increased functional half-life of fibroblast growth factor-1 by recovering a vestigial disulfide bond.</a> Journal of Proteins &amp; Proteomics. 1, 37-42 (2010).</li><li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+cysteine-free+form+of+human+fibroblast+growth+factor-1+for+&amp;#34;second+generation&amp;#34;+therapeutic+application.">Engineering a cysteine-free form of human fibroblast growth factor-1 for &amp;#34;second generation&amp;#34; therapeutic application.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (4), 1444-1453 (2016).</li><li>Eveleth, D., Pizzuto, S., Weant, J., Jenkins-Eveleth, J., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+human+corneal+endothelia+in+organ+culture+stimulated+by+wounding+and+the+engineered+human+fibroblast+growth+factor+1+derivative+TTHX1114.">Proliferation of human corneal endothelia in organ culture stimulated by wounding and the engineered human fibroblast growth factor 1 derivative TTHX1114.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: the Official Journal of the. 36 (9), 686-696 (2020).</li><li>TTHX1114(NM141) in Combination With DWEK/DSO. ClinicalTrials.gov Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04676737?term=TTHX1114&amp;draw=2&amp;rank=2">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04676737?term=TTHX1114&amp;draw=2&amp;rank=2</a> (2020)</li><li>Soh, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicative+factors+for+corneal+endothelial+cell+migration).">Predicative factors for corneal endothelial cell migration).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (2), 338-348 (2016).</li><li>van Dooren, B. T. H., Beekhuis, W. H., Pels, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+trypan+blue+with+human+corneal+cells.">Biocompatibility of trypan blue with human corneal cells.</a> Archives of Ophthalmology. 122, (2004).</li><li>Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+Factors+for+Corneal+Clearance+After+Descemetorhexis+Without+Endothelial+Keratoplasty.">Predictive Factors for Corneal Clearance After Descemetorhexis Without Endothelial Keratoplasty.</a> Cornea. 37 (2), 736-742 (2018).</li><li>Borkar, D. S., Veldman, P., Colby, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Fuchs+endothelial+dystrophy+by+Descemet+stripping+without+endothelial+keratoplasty.">Treatment of Fuchs endothelial dystrophy by Descemet stripping without endothelial keratoplasty.</a> Cornea. 35 (10), 1267-1273 (2016).</li><li>Amano, S., Mimura, T., Yamagami, S., Osakabe, Y., Miyata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+corneas+reconstructed+with+cultured+human+corneal+endothelial+cells+and+human+corneal+stroma.">Properties of corneas reconstructed with cultured human corneal endothelial cells and human corneal stroma.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 49 (6), 448-452 (2005).</li><li>Rolev, K., O&#700;Donovan, D. G., Coussons, P., King, L., Rajan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+of+human+corneal+endothelial+cell+transplantation+using+an+in+vitro+human+corneal+model.">Feasibility study of human corneal endothelial cell transplantation using an in vitro human corneal model.</a> Cornea. 37 (6), 778-784 (2018).</li><li>Spinozzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+and+transplantation+of+human+corneal+endothelial+cells+cultured+on+biocompatible+carriers.">In vitro evaluation and transplantation of human corneal endothelial cells cultured on biocompatible carriers.</a> Cell Transplantation. 29, 1-11 (2020).</li><li>Garcin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-month+storage+of+human+corneas+in+an+active+storage+machine.">Three-month storage of human corneas in an active storage machine.</a> Transplantation. 104 (6), 1159-1165 (2020).</li></ol>

DDE, SP, GD ve JW, Trefoil Therapeutics, Inc.'in çalışanlarıdır ve bu şirketlerde özkaynağa sahiptir.

Birçok göz doktorunun DSO'yu hastalarına iki ana nedenden dolayı önerme konusunda endişeleri vardır: 1) uzun iyileşme süreci ve 2) veri eksikliği (DSO, oftalmik cerrahi alanında yeni bir kavramdır). Sunduğumuz araştırma, bu endişelerin her ikisini de hafifletmek için büyük fayda sağlayacaktır. Bu çalışmadan ve diğerlerinden elde edilen verilere dayanarak, FDA, eFGF1'in (NM141) DSO17 uygulanan hastalara değişen doz programlarında uygulanacağı bir Faz 2 klinik çalışmasını onaylamıştır.
Yukarıda tarif edilen yöntem, Soh ve ark. tarafından yapılan ve kornea endotel iyileşmesinin hem çizilmiş hem de soyulmuş yaralarda ROCK inhibitörü Y-27632 ile ve ROCK inhibitörü olmadan değerlendirildiği bir çalışmadan sonra modellenmiştir18. Y-27632, Descemet'in zarı hala sağlam olan endotel rejenerasyonunu hızlandırırken, sıyrılmış yaralarda tedaviyle bile önemli bir iyileşme bulunamadı. Benzer bir sıyırma tekniğini ve ardından eFGF1 (NM141) ile veya eFGF1 (NM141) olmadan tedavi kullanarak, bulduğumuz gözlemler Soh ve meslektaşlarınınkilerle tutarlı değildi. 14. Günde tedavi edilen birçok korneada Tripan Mavisi boyamasının olmaması ve reforme edilmiş endotel tabakası içinde ZO-1 pozitif sıkı kavşakların varlığı, CEC'nin doğal fonksiyonunun bir parçası olan sağlam bir bariyerin hem normal hem de distrofik kornealarda restore edildiğini savunmaktadır. Bu çalışmada nicelleştirilmemiş olsa da, soyulmuş alanın içinde ve çevresinde EdU-pozitif hücrelerin varlığı, daha önce kurduğumuz bir iyileşme mekanizması olarak proliferasyonun, yaralı kornealarda eFGF1 (NM141) tarafından uyarılabileceğini düşündürmektedir. İstatistiksel analiz, eFGF1 (NM141) ile yapılan tedavinin, DSO'dan önemli ölçüde daha fazla iyileşme ile sonuçlandığını, 14 günlük zaman diliminde kontrol kornealarının ortalama iki katından daha yüksek olduğunu göstermiştir. İyileşme oranları bireyler arasında orta derecede değişmekle birlikte - donör korneaların tipik bir özelliği - sonuçların büyük örneklem büyüklükleri üzerinde tekrarlanabilirliği de oldukça ölçülebilir bir yöntem olduğunu kanıtlamaktadır. Bildiğimiz kadarıyla literatürde ex vivo Descemet'in sıyırma modelinin başka bir örneği yoktur.
DSO'yu inceleyen diğer araştırmacılar için değerli olacak protokolün kendisinin temel bileşenleri, çıplak stromayı tespit etmek için Trypan Blue'nun kullanılması ve lekeli alanı ölçmek için kullanılan görüntü işleme tekniğidir. Tripan Mavisi, oftalmik cerrahide, özellikle canlı olmayan hücreleri tespit etmek ve dokunun görünürlüğüne yardımcı olmak için Descemet'in zarıyla çalışırken yaygın olarak kullanılır. Bu protokolde yer alan boyama zaman noktaları, korneaları Trypan Blue'ya aşırı maruz bırakmadan etkili tekrar boyama yapılmasına izin verdi, çünkü yüksek konsantrasyonlarda CEC'ler için toksik olduğu gösterilmiştir19. Alizarin Red ve immünohistokimya tarafından göç edilen CEC'lerin sonucu olduğu doğrulanan tüm kornealarda lekeli alanın 14 gün boyunca azaltılması, iyileşmeyi ölçmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem göstermektedir. ImageJ'nin renk eşiği menüsünü kullanarak, birden fazla analist standart sapmaları sürekli olarak %1'in altında olan verileri topladı (veriler gösterilmedi). Alternatif programlar benzer şekilde performans gösterebilse de, ImageJ iyileşmeyi izlemek için doğru alan ölçümleri üretebilen açık kaynaklı bir yazılımdır.
Bununla birlikte, sıyırma protokolünün, yara oluşumu için her ikisini de gerekli bulduğumuz, ancak genel iyileşme sürecine engel olan bir yönü vardır. Descemet'in zarını biyopsi yumruğunun bıraktığı iz boyunca puanlamak için keskin, 30 G'lik bir iğne kullanmak, klinisyenler tarafından daha hızlı iyileşmeyi desteklemek için not edilen pürüzsüz, dairesel bir yaranın oluşturulmasını sağlar10. Aynı zamanda, bu adım korneaya zarar verir, çünkü stromal liflerde stromal hücre ölümüne neden olan gözyaşları oluşturabilir, endotel hücrelerinin yara kenarı boyunca göçünü engelleyebilir ve ameliyat sonrası daha kalıcı ödem ile sonuçlanan nodüllerin oluşumunu indükleyebilir20. DSO uygulayan klinisyenler tipik olarak yarayı başlatmak için ters bir Sinskey kancası kullanırlar, ancak korneayı gergin tutan herhangi bir göz içi basıncı olmadan, bu araç ex vivo modelinde daha az etkilidir. Altta yatan stromaya zarar vermeden Descemet'in zarını yırtabilen alternatif bir alet, örneğin Macsai ve Shiloach10 tarafından önerilen sulama ve aspirasyon el aleti gibi protokolü geliştirecektir. Bu tekniğin ex vivo modelle uyumlu olup olmadığını belirlemek için daha fazla deneye ihtiyaç duyulacaktır.
Ex vivo modele özgü görünen bir zorluk, özellikle distrofik kornealarda, yaranın periferik bölgesinde CEC ölümünün sık görülmesidir. Bu bazen yara bölgesinin kantitatasyonunu gizler, çünkü lekeli alan korneanın merkezinin ötesine uzandıkça renk eşik aracının doğruluğu daha sınırlı hale gelir ve eğriliği eşit olmayan ışık dağılımına neden olur. Bununla birlikte, bu değişken ölçümler öncelikle periferik boyama, hasarlı CEC'ler temizlendikçe ve komşu hücreler onları değiştirmek için gerildikçe, göç ettikçe veya çoğaldıkça yavaş yavaş geri çekilmeden önce daha erken zaman noktalarında meydana geldi. Son 14 günlük zaman noktasında, lekeli alan korneanın merkezine geri dönmüştü ve tüm görüntüler ölçülebilirdi. Benzer bir gözlem, 14 normal korneadan beşinin, kültür periyodu18'in başlarında 'Prematüre Kültür Yetmezliği' (PCF) olarak adlandırdıkları şeyi sundukları Soh ve ark. tarafından karşılaştırılabilir sıklıkta yapılmıştır. Hasar kornealarımızda zamanla tersine dönmüş ve yine de vakalarında kalıcı olsa da, bu, yöntemlerinin korneanın daha geniş bir alanını yaralamayı gerektirdiği gerçeğine bağlanabilir. Distrofik kornealarda daha yaygın periferik Tripan boyamasının gözlenmesi, distrofik korneaların endotel hücre ölümüne sağlıklı kornealardan daha duyarlı olduğunu gösterebilir. Bu hücre ölümünün kesin nedeni henüz aydınlatılamamış olsa da, bu konunun in vivo olarak insan kornealarıyla ilgili olmasının muhtemel olmadığına inanıyoruz. Periferik endotel hasarı, DSO'nun bildiğimiz kadarıyla herhangi bir klinik vaka çalışmasında bildirilmemiştir, bu da bu fenomenin donör kornealara özgü olduğunu düşündürmektedir. ex vivo 6,8,10,11,21. Sadece kontrol kornealarının boyandığı iki örnek dışında, periferik boyamanın tüm gözlemleri eşleştirildi, bu nedenle nedenin eFGF1'e (NM141) maruz kalması muhtemel değildir. Bununla birlikte, bu gibi durumlarda tedavinin, aksi takdirde her iki korneada periferik lekelenmeye neden olacak hasara karşı koruyucu bir etki sağlamış olması mümkündür. Bu hipotez üzerinde daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Bu yöntemin bir başka sınırlaması, DSO'nun amaçlandığı FECD fenotipini temsil eden donör korneaların tedarik edilmesidir. Her türlü donör kornea azdır, bu nedenle donör doku kullanımından kaçınan bir ameliyata ihtiyaç vardır. Bizim amaçlarımız için, mevcut tek kornea, çeşitli nedenlerle nakilden reddedilenlerdir. Göz bankaları ayrıca bu korneaları gutta varlığı, düşük veya ölçülemeyen ECD ve düzensiz CEC morfolojisi gibi kriterlere göre normal veya distrofik olarak sınıflandırır. Bir göz bankasından doku kabul etmeden önce distrofik bir tanıyı doğrulamak da neredeyse imkansızdır, çünkü çoğu donörün tıbbi öyküsü geçmiş oküler öyküyü içermez ve sağlanan tek bilgi ECD değeri, teknisyenin notları ve bazı durumlarda temsili bir speküler görüntüdür. Bu çalışma için elde edilen distrofik kornealar, kültür periyodu tamamlandıktan sonra yapılan konfokal mikroskopi üzerine konfluent santral guttae göstermedi, bu da FECD'nin "erken" aşamalarını temsil edebileceğini düşündürmektedir. Bunun çalışmanın etkileri üzerinde önemli bir etkisi olmasını beklemiyoruz, çünkü DSO'nun amacı, sağlıklı periferik hücrelerin içe doğru göç etmesine izin vererek guttae'nin akıcı alanlarını çıkarmaktır.
Bu yöntem, CEC proliferasyonunu ve göçünü etkileyebilecek ajanları değerlendirmek için oldukça uygulanabilir ve tekrarlanabilir bir teknik sağlar. Model, insan kornea dokusu grefti22,23,24'e tohumlandığında bile, kültürlenmiş CEC'leri içeren in vitro modellerden fizyolojik olarak daha alakalı kılan çeşitli özelliklere sahiptir. İlk olarak, uyarılacak CEC'ler tam olarak hastanın gözünde olduğu gibi tek katmanlı bir tabakadadır ve klinik DSO'dan sonra olduğu gibi kornea stroması boyunca göç ederler. Söz konusu stroma, CEC'lerle aynı hastadandır, bu nedenle FECD ile ilişkili potansiyel stromal farklılıkları kontrol eder. Kültürleme işlemi sırasında CEC'lerin kültürlerini Endotelyal - Mezenkimal Geçiş (EnMT) için ilişkili zorluklar ve potansiyel ile genişletmeye, ayrıştırmaya ve genişletmeye gerek yoktur. Tarif edilen protokolün kendisi klinik DSO prosedürüne çok benzer. Kültür ve genişleme adımlarını atlarken, bu yöntem, epitel tabakası korunmadığı için çalışma süresinin kornea şişmesi ile sınırlandırılması sınırlamasına sahiptir. Bu, soyulmuş alanı kaplamak için göç eden CEC'lerin morfolojisini araştırmamızı engeller ve sonunda bu modelde altıgen bir diziye yeniden düzenlenip düzenlenmeyeceklerini belirsiz bırakır. Garcin ve ark., geleneksel organ kültüründe tutulan kornealardan önemli ölçüde daha az ödem ile korneaları kültürde 3 aya kadar tuttuğu gösterilen bir cihaz olan aktif depolama makineleri (ASM) ile potansiyel bir çözüm geliştirmişlerdir25. Böyle bir cihaz, bu çalışmanın çoğaltılmasında ve genişletilmesinde yardımcı olabilir.
Bu model, diğer yara iyileştirici tedavileri (örneğin, ROCK inhibitörleri) test etmede, cerrahi teknikteki modifikasyonları değerlendirmede ve farklı donör popülasyonları veya hastalık aşamaları arasındaki iyileşmeyi karşılaştırmada potansiyel faydaya sahiptir. Bu araştırmanın, ortaya çıkan klinik çalışma verileriyle birlikte, klinisyenleri DSO'yu uygun FECD hastaları için değerli bir tedavi seçeneği olarak görmeye teşvik ettiğini umuyoruz.

Fuchs Endotelyal Kornea Distrofisi (FECD), kornea endotel hücrelerinde (CEC'ler) pompa fonksiyonunun kaybı ve Descemet zarının yüzeyinde kollajen ve diğer hücre dışı matriks proteinlerinin aşırı birikmesi ile karakterize bir hastalıktır ve kornea guttae1'i oluşturur. FECD için bilinen tek tedavi, hepsi rejeksiyon ve endotel hücre kaybı riski taşıyan çeşitli formlarda endotelyal keratoplastidir2. Oftalmik cerrahideki ilerlemeler bu prosedürlerin zamanla daha az invaziv hale gelmesini sağlamış olsa da, herhangi bir transplantasyon şekli reddedilme riski ve yaşam boyu steroid kullanımı olasılığı, kendi eşlik eden advers olayları olan bir tedavi ile birlikte gelir. Ayrıca, küresel donör doku sıkıntısı,3 ihtiyacı olan her 70 hasta için sadece bir donör kornea bulunabilecek şekildedir. Bu zorluklar göz önüne alındığında, araştırmacılar ve klinisyenler donör dokuya olan ihtiyacı tamamen önleyen cerrahi yöntemleri araştırıyorlar. Bu deneysel tekniklerden biri, korneanın merkezine lokalize guttalı FECD hastalarının greft yerleştirilmeden sıyrılmış merkezi 4 mm'lik bir Descemet zarı çemberine sahip olduğu Endotelyal Keratoplasti (DWEK) olmadan Descemet'in Sadece Sıyırma (DSO) veya Endotelyal Keratoplasti (DWEK) olmadan Dessemetorheksi'dir. Guttaların çıkarılması, sağlıklı periferik hücreleri içe doğru göç etmeye ve endotel tek tabakasını reforme etmeye, sonunda stromal ödemi tersine çevirmeye ve vizyonu iyileştirmeye teşvik eder. Kavram başlangıçta hastaların Descemet zarının ayrılmasıyla komplike olan bir ameliyat geçirdikleri bir dizi vaka çalışmasında tanımlanmıştır, ancak CEC yeniden popülasyonu hala 4,5,6,7 olmuştur. Bu yöntemin birçok avantajı olmasına rağmen, iyileşme süreci uzun ve tutarsızdır, çünkü bazı hastalar ameliyatı takip eden aylarda iyileşme görülmezse kurtarma nakline ihtiyaç duyarlar8. Bu nedenlerden dolayı, CEC'lerin daha hızlı göç etmesini ve çoğalmasını uyaran bir ilaç, DSO geçiren FECD hastalarının iyileşme sürecinde faydalı olabilir.
Son zamanlarda yapılan birkaç çalışma, DSO uygulanan hastalar için ek bir tedavi olarak ROCK inhibitörlerini değerlendirmiş ve tedavi edilen hastaların DSO'nun sadece 9,10,11 grubundakilerden daha hızlı iyileştiğini ve daha yüksek merkezi endotel hücre yoğunluğuna (ECD) sahip olduğunu bulmuştur. Bununla birlikte, küçük numune boyutları ve dozlama rejimleri arasındaki farklılıklar nedeniyle, bu ortamda ROCK inhibitörlerinin etkinliğini daha iyi anlamak için daha fazla veriye ihtiyaç vardır.
Fibroblast Büyüme Faktörlerinin kornea endotelinin rejenerasyonunu hem sığır CEC'leri ile in vitro hem de in vivo in feline korneas12,13 ile uyardığı gösterilmiştir. eFGF1 (NM141), çok daha kısa bir yarı ömre sahip olan 14,15 olan doğal FGF-1'in aksine, molekülü stabilize etmek için birkaç amino asit ikamesi içeren FGF-1'in tasarlanmış bir versiyonudur. Daha önce eFGF1'in (NM141) çeyrek insan kornealarında CEC'lerin ex vivo proliferasyonunu uyarma yeteneğini göstermiştik16. Bu çalışma, eFGF1 (NM141) gibi yardımcı tedavilerin bu uygulamada iyileşmeyi hızlandırıp hızlandırmadığını belirlemek için hem normal hem de distrofik kornealarda DSO'nun ilk başarılı ex vivo modelini kurarak bu çalışmayı geliştirmeye çalışmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2&#181;m sterile 1000 mL filter units</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2&#181;m sterile 250 mL filter units</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2&#181;m sterile 500 mL filter units</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL aspirating pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>310 direct heat CO2 incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>13-998-082</td>
			<td>Set to 37&#176;C, 6% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896, -898,&#160; -900, -902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well tissue culture treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 azide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5533-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td>R200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic &#38; Antimycotic 100x (anti-anti)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-magnetic stainless steel forceps</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>7-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470134-946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9700-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>1B1110-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chex-all II sterilzation pouches</td>
			<td>Propperman&#160;</td>
			<td>24008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cirpofloxacin hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>469130-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry vacuum pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2019B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A31606-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted micro slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy miniStar microcentrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C1413, VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemo-Sol detergent</td>
			<td>Haemo-Sol International LLC</td>
			<td>026-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human corneas</td>
			<td>Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>Version 1.52a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinity 3s microscopy camera</td>
			<td>Lumenera</td>
			<td>1URCAP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinity analyze software</td>
			<td>Lumenera</td>
			<td>Version 6.5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium (ITS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L- Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual single channel pipet</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>&#160;17014-392, -391, -382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle PrecisionGlide 30G</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Met141 TTHX1114</td>
			<td>Biopharmaceutical Development Program</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion Star A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9258-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpette plus pipet controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75856-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision water bath 188</td>
			<td>Precision Scientific Incorporated</td>
			<td>WB05</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Class II model biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>36213043726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel size 22 stainless steel&#160;</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>446479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2041-2.5K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0404-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard solid refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10820-402</td>
			<td>Set to 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilmatic autoclave</td>
			<td>Market Forge</td>
			<td>STM-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube rocker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>M48725Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>96-1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrance antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories Inc.</td>
			<td>H-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VistaVision cover glasses, no. 1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a human corneal organ culture model of descemet's stripping only with accelerated healing stimulated by engineered fibroblast growth factor 1

Fuchs Endotelyal Kornea Distrofisi (FECD), disfonksiyonel kornea endotel hücrelerinden (CEC'ler) kaynaklanır ve şu anda tüm kornea veya Descemet zarının nakli ile tedavi edilmektedir. Oküler cerrahideki son gelişmeler, CEC'lerin pürüzsüz stroma üzerine göçüne izin vermek, korneaya fonksiyon ve vizyonu geri kazandırmak için guttae-yoğun Descemet zarının merkezi bir çemberinin çıkarıldığı cerrahi bir teknik olan Descemet's Stripping Only (DSO) 'yi kurmuştur. Bu potansiyel tedavi seçeneği oftalmik araştırmalar alanında büyük ilgi görmesine rağmen, DSO'nun başarılı bir ex vivo modeli oluşturulmamıştır ve klinik veriler sınırlıdır. Bu çalışma, insan donör kornealarında DSO'yu simüle eden yeni bir yara iyileştirme modeli sunmaktadır. İnsan mühendisliği FGF1'in (NM141) etkinliğini değerlendirmek için bu yaklaşımı kullanarak, tedavinin göçün uyarılması ve CEC'lerin çoğalması yoluyla iyileşmeyi hızlandırdığını bulduk. Bu bulgu, bu sonuçların DSO prosedürünün hedef popülasyonu olarak Fuchs Distrofisi olan hastalarda çoğaltılabileceğini doğrulamak için göz bankaları tarafından bildirilen distrofi belirtileri olan 11 çift insan korneasında doğrulandı.

Bu deney başlangıçta 10 çift normal araştırma korneasında gerçekleştirildi, çünkü bunlar en kolay şekilde mevcuttu. Yöntemin başarılı olduğu gösterildikten sonra, çalışma, FECD hasta popülasyonunu temsil eden kornealarda eFGF1'in (NM141) etkilerini incelemek için speküler değerlendirmeye dayalı göz bankaları tarafından bu şekilde etiketlenmiş 11 çift distrofik korneada çoğaltıldı. Daha fazla klinik alaka düzeyi için, bu çalışmada yer alan rakamlar, aksi belirtilmedikçe distrofik kornealardan toplanan verileri temsil etmektedir.
DSO'nun cerrahi sonucu simüle edildikten sonra, Tripan Mavisi boyama yapıldı ve 14 günlük kültür periyodu boyunca tekrarlandı ve pozitif boyamadaki azalma yara iyileşmesini değerlendirmek için ölçüldü (Şekil 2). Alizarin Kırmızı boyama da hücre sınırlarını belirlemek için 14. günde yapıldı. Net bir patern görünmeyen koyu kırmızı alanlar (bundan böyle negatif boyama olarak anılacaktır), lezyonun iyileşmemiş bölümünde ve hücrelerin hasar gördüğü veya eksik olduğu varsayılan korneanın diğer bölgelerinde tutarlı bir şekilde ortaya çıkmıştır. 14. günde Tripan Mavisi için pozitif boyanan alanlar, Alizarin Kırmızısı tarafından negatif boyanma ile iyi bir şekilde uyuşuyordu (Şekil 2). eFGF1 (NM141) ile tedavi edilen tüm distrofik kornealar, tedavi edilmeyen eşe kıyasla 14. günde daha fazla iyileşme gösterdi. Ortalama olarak, tedavi edilen kornealarda kontrol kornealarında %38'e karşılık %91 iyileşme göstermiş ve bu fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.001) (Şekil 3A). Bu, kontrollerin ortalama% 32 iyileşme gösterdiği ve tedavi edilen korneaların% 81'e ulaştığı 20 normal korneadan elde edilen sonuçlarla karşılaştırılabilir, bu da yine istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.001) (Ek Şekil 1). İyileşme yüzdesi, eşit varyans varsayılarak iki örnek t-testi kullanılarak normal ve distrofik kornealar arasında karşılaştırıldı ve kontrol veya tedavi gruplarında anlamlı bir fark görülmedi (veriler gösterilmedi).
Hem normal hem de distrofik kornealar için göz bankaları tarafından sağlanan donör bilgileri (Tablo 1), yaş, Optisol'de saklanan günler, ölümden toplama aralığına, hücre yoğunluğuna ve cinsiyete kadar olan özelliklerin iyileşme ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için analiz edildi. Pearson'ın korelasyon katsayısı (r), erkekler ve kadınlar arasındaki iyileşmeyi karşılaştırmak için eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak değerlendirilen cinsiyet dışındaki tüm faktörleri araştırmak için kullanıldı. R'nin mutlak değeri her durumda 0.25'in altındaydı, bu da iyileşme ve yaş, Optisol'de depolanan günler, toplama aralığına ölüm veya hücre yoğunluğu arasındaki herhangi bir korelasyonun ihmal edilebilir olarak kabul edildiğini gösteriyordu. Erkekler ve kadınlar arasındaki iyileşme farkı istatistiksel olarak anlamlı değildi (p = 0.53).
Normal veri setine benzer şekilde, 22 distrofik korneadan 10'u, lezyon içindeki lekeli bölgeye bağlı soyulmuş alanın dışında, en az bir zaman noktasında (genellikle Gün 3) kayda değer Tripan boyaması ile sunuldu - periferik boyama olarak adlandırdığımız bir gözlem (Şekil 4A). Bu 10 kişiden sadece ikisi, tedavi edilen meslektaşları aynı etkiyi göstermeyen kontrol kornealarıydı. Kalan sekizi eşleşen çiftlerdi ve aynı bireyden kornealar arasında benzer şiddette sunuldular. Boyama paternleri normal ve distrofik kornealar arasında karşılaştırılabilir olmasına rağmen, periferik boyama sıklığı distrofik veri setinde korneaların %45'i pozitif iken normal grupta %25'e kıyasla daha yüksekti. Şekil 4A , lezyonun dışındaki lekeli alanın 6. Gün görüntülerinde yara kenarıyla buluştuğu ve yavaş yavaş geri çekildiği için periferik boyama için pozitif olarak kabul edilen bir çifti göstermektedir. İlgili Alizarin Kırmızısı görüntülerinde, periferik Trypan boyaması olan bölgelerdeki hücreler, soyulmuş bölgeye göç eden hücreler gibi, genişlemiş ve anormal şekilli görünüyordu ve negatif boyama, Trypan Blue'nun 14. Günde bulunduğu alanlarla ilişkiliydi. Kültür dönemi boyunca etkilenen korneanın büyük bir kısmına rağmen, lekeli çevrenin kısmen veya tamamen temizlenmesi 10 korneanın hepsinde meydana geldi. Ek olarak, 14. Günde iyileşen son yüzde, bir kornea hariç herkes için tedavi grubuna bağlı olarak normal aralıktaydı. Aykırı değer (Şekil 4A'da resmedilen 0811L), 14. Günde hala lezyon alanına bağlı olan periferik boyama kalıntıları nedeniyle negatif yüzde iyileşmiş bir değer döndürmüştür (Şekil 3A ve Şekil 4A). Uzak periferik boyama olarak adlandırılan ikinci bir boyama paterni, Şekil 4B'deki Alizarin Kırmızısı görüntülerinde yakalandı, ancak birçok korneada kültür dönemi boyunca Trypan Blue görüntülerinde de belirgindi (Şekil 4B). Bu gözlem, limbüsün etrafında koyu renkli bir lekelenme halkası ile karakterizedir ve tehlikeye atılmış endotel olduğunu gösterir. Terime rağmen, bu model hem normal hem de distrofik kornealarda o kadar yaygındı ki, periferik boyama için pozitif olarak sayılmadılar. Bu görüntülerde, kontrol korneası, her iki korneaların da kültür döneminin başlarında benzer şiddete ve boyama modeline sahip olmasına rağmen, 14. Günde daha canlı ve kapsamlı boyama gösterdi. Tedavi edilen korneada ayrıca, bu gözlemler nicel olarak ölçülmemesine rağmen, kontrole kıyasla daha kompakt ve altıgen görünen görünüşte daha fazla sayıda hücre olduğu belirtildi. Periferideki eğrilik nedeniyle, sadece soyulmuş alanın içinde ve hemen çevresinde Tripan boyama kantitatif analize dahil edildi. Tüm distrofik kornealarda yüzde boyalı değerlerin ortalaması alındığında, periferik boyamanın ortaya çıkışı, periferik boyamanın daha az yaygın olduğu normal kornealarda görülen sabit azalmanın aksine, 0. Gün'den itibaren ilk artışla sonuçlandı (Şekil 3B).
Konfokal görüntüleme ile görselleştirilen immünohistokimya, CEC sıkı kavşaklarının fonksiyonel bir belirteci olan ZO-1'in lezyon kenarının içinde ve çevresinde yarı organize ekspresyonunu ortaya koymaktadır (Şekil 5), Alizarin Kırmızı boyama ile benzer şekilde kanıtlanmış bir model (Şekil 2 ve Şekil 4). Pleomorfizm ve polimegatizem, çoğu distrofik korneada ZO-1 tarafından görülebilir; Bununla birlikte, bu gözlem hastalıklı durumlarına bağlanabilir ve kültürlemeden önce korneaların speküler muayenesi üzerine göz bankası tarafından not edilmiştir. Düzensiz ZO-1 ekspresyonu, hücrelerin içeri doğru göç ettiği tedavi edilen korneaların lezyon alanında, Alizarin Kırmızısı desenleriyle de tutarlı olarak gözlenir. EdU içeren hücreler lezyonun sınırının çevresinde ve lezyonlu bölgenin içinde kontrol altında ve tedavi edilen kornealarda görülebilir (Şekil 5). Göç eden CEC'lerin paterni aynı zamanda kontrol kornealarında çoğu hücrenin lezyon kenarının iki alanında bulunduğu, tedavi edilen kornealardaki CEC'lerin soyulmuş alan boyunca görülebildiği Trypan Blue sonuçlarını da yansıtır (Şekil 2).
Bu çalışmada proliferasyonun iyileşmeye katkıda bulunduğunu doğrulamak için nitel bir ölçüt olarak EdU etiketlemesi yapılmıştır. Bununla birlikte, EdU içeren hücrelerin miktarı, lezyonun içinde ve çevresinde tutarlı, tekrarlanabilir görüntülerin yakalanmasını engelleyen kornea şişmesi nedeniyle sistematik olarak gerçekleştirilememiştir. Vekil olarak, DSO modelinin kurulmasından önce yapılan bir çalışmada yapılan nicel analiz, eFGF-1'in (NM141) proliferasyon üzerindeki etkilerini göstermek için dahil edilmiştir (Şekil 6). Normal insan donör korneaları bir neşter kullanılarak dörde bölündü ve daha önce tarif edildiği gibi 48 saat boyunca eFGF1 (NM141) olsun veya olmasın, EdU varlığında kültürlendi (Eveleth, 2020)16. Hoechst 33342 ve EdU etiketli hücrelerin görüntülenmesi ve müteakip analizi, çeyreklerin bozulmamış orta bölgesinde ve kenar bölgesinde, korneanın kesildiği üç alanda ayrı ayrı gerçekleştirildi. Orta bölgede, EdU'yu içeren hücrelerin yüzdesi, analiz edilen 10 kornea boyunca düşük ve oldukça değişkendi. Ortalama olarak, eFGF1 (NM141) ile tedavi edilen çeyrekler, orta bölgede kontrollere (% 1.8 ±% 2.9) kıyasla daha yüksek EdU katılım seviyelerine sahipti (% 4.1 ±% 7.9), ancak bu fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (p = 0.239). Yara kenarında, eFGF1 (NM141) ile uyarılan tedavi edilen çeyrekler, kontrol çeyreklerine kıyasla (% 10 ±% 9.6, p = 0.012) ortalama alındığında (% 18.1 ±% 11.5) anlamlı derecede daha yüksek EdU birleşme oranları göstermiştir.
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan 22 distrofik ve 20 normal kornea ile daha önce EdU kantitasyonu için kullanılan 10 normal kornea için donör bilgileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/Table%201_Donor%20info.zip" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig02.jpg"> Resim 2: Descemet'in sıyırılması sonrası korneaların hayati boya boyaması. Distrofik insan korneaları, merkezi 4 mm'lik Descemet zarından sıyrıldı ve 14 gün boyunca eFGF1 (NM141) (100 ng / mL) ile veya eFGF1 (NM141) olmadan inkübe edildi. Lezyonlar 0, 3, 6, 9, 12 ve 14. günlerde Tripan Blue boyaması ile görüntülendi. CEC sınırları, 14. günde Alizarin Kırmızısı boyama ile görselleştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig03v2.jpg"> Şekil 3: Distrofik insan korneaları, eFGF1 (NM141) ile kültürlendiğinde DSO'dan önemli ölçüde daha fazla iyileşme göstermektedir. (A) İyileşme yüzdesi, ImageJ kullanılarak 14. Günde lekelenmiş alanın ölçülmesi ve bunu 0. Günde boyanan yüzde ile karşılaştırılmasıyla belirlenmiştir. (B) Zaman içinde grafiklendirilen ortalama boyanmış yüzde, normal kornealarda tutarlı bir düşüş gösterirken, periferik boyama prevalansının daha yüksek olması nedeniyle distrofik kornealarda 3. günde zirveye ulaşır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig03largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig04.jpg"> Şekil 4: Distrofik korneaların periferik boyama ile vital boya boyaması. (A) Bozulmamış Descemet zarının tripan boyaması, merkeze doğru ilerlediği, daha sonra hem kontrol hem de tedavi edilen kornealarda zamanla temizlendiği görülebilir. (B) Limbüs çevresindeki Alizarin paternleri, periferik hasarın tipik bir gözlemini ve birçok donör korneada görülen endotelin düzensiz yeniden oluşumunu temsil eder - bu durumda distrofiktir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig05.jpg"> Şekil 5: Soyulmuş distrofik kornealarda eFGF1 (NM141) ile göçün uyarılması ve CEC'lerin çoğalması. Descemet'in soyulmuş kornealarının konfokal mikrografları ZO-1 (kırmızı), EdU (yeşil) ve Hoechst 33342 (mavi) için boyanmıştır. Noktalı çizgi, görüntünün sol tarafında soyulmuş alan ve sağda sağlam Descemet'in zarı ile lezyon kenarını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig06v2.jpg"> Şekil 6: Normal kornealardan çoğalan hücrelerin bir neşter kullanılarak dörde bölündüğü ve 48 saat boyunca eFGF-1 (NM141) olsun veya olmasın EdU içeren ortamlarda inkübe edilmesi. Çeyrekler, bozulmamış orta bölgede ve kesilmiş kenar boyunca üçlü olarak görüntülendi ve orta ve kenar bölgelerinde EdU'yu içeren hücrelerin yüzdesini belirlemek için sayımların ortalaması alındı. Oküler Farmakoloji ve Tedavi Dergisi'nden değiştirilen şekil, izinalınarak kullanılmıştır 16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig06largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Normal insan korneaları, eFGF1 (NM141) ile kültürlendiğinde DSO'dan önemli ölçüde daha fazla iyileşme gösterir. ImageJ lekeli alanları ölçmek ve iyileşme yüzdesini belirlemek için kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet's Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1 at JoVE.com

A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet's Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1

Descemet's Stripping Only, Fuchs Endotelyal Kornea Distrofisinden kaynaklanan merkezi kornea guttası olan hastalarda, periferik hücrelerin endotel tabakasını yenilemesi için Descemet'in zarının sıyrıldığı deneysel bir prosedürdür. Bu yazıda, eFGF1 (NM141) tarafından uyarılan hızlandırılmış iyileşme ile distrofik insan kornealarında ex vivo'da DSO'yu simüle eden yeni metodoloji sunulmaktadır.

Descemet'in Sadece Mühendislik Fibroblast Büyüme Faktörü 1 Tarafından Uyarılan Hızlandırılmış İyileşme ile Sıyırılmasının İnsan Kornea Organ Kültürü Modeli

Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) results from dysfunctional corneal endothelial cells (CECs) and is currently treated by transplantation of the ...

Bu videonun amacı, Descemet'in Sadece Sıyırma adlı insan kornea organ kültürü modelini, mühendislik fibroblast büyüme faktörü biri tarafından uyarılan hızlandırılmış iyileşme ile tanımlamaktır. Fuch Endotelyal Kornea Distrofisi veya FECD, kornea endotel hücrelerinde pompa fonksiyonunun kaybı ve Descemet zarının yüzeyinde kollajen ve diğer hücre dışı matriks proteinlerinin aşırı birikmesi ile karakterize bir hastalıktır ve kornea guttası oluşturur. FECD için bilinen tek tedavi, hepsi reddedilme ve endotel hücre kaybı riski taşıyan çeşitli formlarda endotelyal keratoplastidir.Oftalmik cerrahideki ilerlemeler bu prosedürlerin zamanla daha az invaziv hale gelmesini sağlamış olsa da, herhangi bir transplantasyon şekli reddedilme riski ve ömür boyu steroid kullanımı olasılığı ile birlikte gelir. Descemet's Stripping Only veya DSO, korneanın merkezine lokalize guttae'li FECD hastalarının, greft replasmanı olmadan Descemet'in zarının merkezi dört milimetrelik çemberinin çıkarıldığı deneysel bir alternatiftir. Guttaların çıkarılması, sağlıklı periferik hücreleri içe doğru göç etmeye ve endotel tek tabakasını reforme etmeye, sonunda stromal ödemi tersine çevirmeye ve vizyonu iyileştirmeye teşvik eder.Bu yöntemin birçok avantajı olmasına rağmen, iyileşme süreci uzun ve tutarsızdır ve bazı hastalar ameliyatı takip eden ayda iyileşme görülmezse kurtarma nakline ihtiyaç duyarlar. DSO'yu takiben daha hızlı yara iyileşmesini uyaran bir tedavi, prosedürü FECD'li hastalar için daha uygun bir seçenek haline getirebilir. Bu protokol, DSO'yu FECD'li hastalar için daha uygun bir seçenek haline getirmek için DSO'yu takiben yara iyileşmesini iyileştirmek için tedavileri test etmek amacıyla, insan donör kornealarını kullanarak klinik DSO prosedürünü bir organ kültürü formatında modellemektedir.Laboratuvarımız bu modeli, bu videonun ilerleyen kısımlarında temsili sonuçlar göstereceğimiz mühendislik ürünü bir fibroblast büyüme faktörü ile tedavi edilen kornealarda yara iyileşmesini test etmek için kullanmaktadır. Prosedürün bu bölümünde, Descemet'in zarının sıyrılacağı dört milimetrelik yara alanını işaretlemek için bir biyopsi punch kullanılacaktır. Steril forseps kullanarak, korneayı ortamdan çıkarın ve artık ortamı ve hücre kalıntılarını gidermek için 1X PBS'de durulayın.Duruladıktan sonra, kornea endotel tarafını bir Petri kabının kapağına yerleştirin. Bir kaynak kabına tripan mavisi renkte yeni bir dört milimetrelik biyopsi yumruğunu batırın ve fazlalıktan yararlanın. Her iki elinizi kullanarak yumruğu korneanın merkezinin üzerine yerleştirin ve minimum basınç uygulayarak doğrudan endotel yüzeyine indirin.Kornea üzerindeki pozisyonu veya basıncı değiştirmeden yumruğu bir ele kaydırın ve yeni serbest elle forsepslere ulaşın. Biyopsi yumruğunu birkaç kez yaklaşık 90 derece ileri geri bükerken korneayı yerinde tutmak için forsepsleri kullanın. Biyopsi yumruğunu doğrudan korneadan yukarı kaldırın ve bir kenara koyun.Fazla tripan mavisini gidermek için 1X PBS'de bir kez daha durulayın. Petri kabı kapağındaki korneayı diseksiyon kapsamına aktarın. Korneayı kavisli forseps ile yerinde tutmak, biyopsi yumruğunun bıraktığı tripan mavisi halkası boyunca keskin bir 30 gauge iğnenin ucunu hafifçe sürükleyerek Descemet'in zarını puanlamaktadır.Altta yatan stromayı bozmamak için minimum basınç kullanın. Bir sinskey kancası ile Descemet'in zarını yara kenarının etrafına kaldırmak ve soymak için nazik kepçe hareketleri kullanın. Lezyonun merkezine doğru çalışmak.Descemet'in zarı çok az dirençle ortaya çıkmalıdır. Zorluk yaşıyorsanız, muhtemelen stromayı yukarı çekiyorsunuzdur. Bu olursa, yara kenarı boyunca yeni bir noktadan kaldırarak tekrar başlayın.Descemet'in zarının çoğunluğu stromadan ayrıldıktan sonra, zarı çıkarmak ve bir kenara koymak için Gorovoy forseps kullanın. Kalan membran parçaları için sıyrılmış alanı inceleyin ve Gorovoy forseps ile çıkarın. Descemet'in sıyırılmasını takiben, yara bölgesini görselleştirmek için korneayı tripan mavisi ile lekeleyin.Korneayı %0.01 kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren 1X PBS'de durulayarak tripan mavisi ile etkileşime girebilecek hücre kalıntılarını giderin ve kalan CEC'lerin bozulmamış Descemet'in zarına sıkı sıkıya yapışmasını kolaylaştırın. Korneayı kaynaklı bir kaba yerleştirin ve 30 saniye boyunca endotel tabakasına 30 mikrolitre tripan mavisi pipet yerleştirin. Tüm endotel yüzeyinin kaplandığından emin olmak için korneayı hafifçe sallamak için forseps kullanın.PDS'deki fazla tripan mavisini kalsiyum ve magnezyum ile durulayın ve lekeli korneayı diseksiyon mikroskobu altında gün sıfır zaman noktası için görüntüleyin. Bu işlem tamamlandıktan sonra, aşağıdaki listelenen bileşenlerden oluşan düşük serum ortamı içeren altı kuyucuklu bir plakada korneaları kültürleyin. Sol korneayı sadece sekiz değirmen düşük serum ortamında ve sağ korneayı, mühendislik FGF-1 veya diğer istenen test tedavileri ile desteklenmiş düşük serum ortamında kültürleyin.Korneaları günlük ortam değişiklikleri ile 14 gün boyunca% 6 CO2 ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Tripan boyama prosedürünü üç, altı, dokuz, 12 ve 14. günlerde tekrarlayın ve boyama işleminden hemen sonra her korneayı görüntüleyin. Kamera ayarlarını tüm zaman noktalarında tutarlı tuttuğunuzdan emin olun.Kültür dönemini takiben, özellikle deneye yönelik araştırma ilgi alanlarına dayanarak kornealarda ek lekeler yapılabilir. Laboratuvarımızın araştırma ilgi alanlarıyla ilgili ek boyamalar arasında Alizarin boyamasının yanı sıra EDU kuruluşu ve ZO-1 sıkı bağlantı proteinleri için floresan boyama yer almaktadır. Alizarin boyama, tripan boyama sonuçlarını doğrulamak ve iyileşen bölgedeki hücre morfolojisini görselleştirmek için hücre sınırlarını görselleştirmek için yapılır.ZO-1 immünofloresan boyama, iyileşen bölgede ve çevresinde özellikle ilgi çekici olan CEC'ler arasındaki sıkı bağlantı oluşumunun görselleştirilmesine izin verir. EdU etiketlemesi, proliferasyonun iyileşmeye katkıda bulunduğunu doğrulamak için kalitatif bir önlem olarak gerçekleştirilir ve bazı bağlamlarda çoğalan hücreleri ölçmek için de kullanılabilir. Bu özel boyama prosedürlerinin nasıl gerçekleştirileceğine dair daha ayrıntılı talimatlar, bu videoya karşılık gelen makalede yer almaktadır.İşte Göz Bankası tarafından distrofik olarak değerlendirilen ve 14 günlük bir süre boyunca mühendislik FGF-1 ile veya mühendislik FGF-1 olmadan inkübe edilen bir çift korneanın temsili görüntüleri. Görüntülerde görüldüğü gibi, mühendislik ürünü FGF-1 ile tedavi edilen kornea, tedavi edilmeyen kontrol korneasına kıyasla hızlandırılmış iyileşme göstermiştir. Kültür döneminin sonunda ek Alizarin boyaması, hücre sınırlarını tanımlamaya hizmet etmiş ve bu bulgularla doğrulanmıştır.Bu gözlem, klinik DSO prosedürüyle en alakalı kornea örneğindeki modeli doğrulamak için 11 çift distrofik korneada çoğaltıldı. ImageJ gibi görüntü işleme yazılımı, burada görülebileceği gibi, yara iyileşmesi ilerlemesini ölçmek için bu görüntülerdeki lekeli alanı ölçmek için kullanılabilir. Mühendislik FGF-1 ile tedavi edilen tüm distrofik kornealar, 14. günde tedavi edilmeyen eşe kıyasla daha fazla iyileşme gösterdi ve kontrol kornealarında% 38'in aksine% 91'lik bir iyileşme ile sonuçlandı.Ve bu fark istatistiksel olarak anlamlıydı. Konfokal görüntüleme ile görselleştirilen ek immünohistokimya, önceki Alizarin boyama modellerini yansıtan ZO-1 sıkı bağlantı proteininin yarı organize ekspresyonunu ortaya çıkardı. EDU etiketlemesi, yara bölgesinde ve çevresinde proliferasyon yapan hücrelerin varlığını doğruladı ve tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla tedavi edilen kornealarda daha yüksek seviyelerde görülebildi.Bazı kornea çiftlerinde, CEC ölümü, özellikle distrofik kornealarda, yara bölgesinin periferisinde görülebilir. İşte önemli periferik hücre ölümü sergileyen tripan lekeli korneaların örnek görüntüleri. Görüntülerde görüldüğü gibi, periferik hücre ölümü öncelikle daha erken zaman noktalarında meydana gelir ve kültür periyodu boyunca yavaş yavaş tersine döner.Bu periferik boyama, yaraya bağlandığında yara alanının kantitasyonunu zorlaştırabilir, çünkü yara alanı kenarının yerini belirlemek zor olabilir. Bununla birlikte, her durumda, periferik tripan boyaması, son gün 14 zaman noktasında ölçülebilir görüntüler üretecek kadar temizlenmiştir. Bu fenomenin ex vivo kültürlü donör kornealara özgü olduğuna ve in vivo olarak insan kornealarıyla ilgili olmadığına inanıyoruz.Periferik endotel hasarı olarak DSO'nun herhangi bir klinik vaka çalışmasında tarafımıza bildirilmemiştir. Alizarin Kırmızısı görüntülerinde çok periferik boyama olarak adlandırılan ikinci bir boyama paterni yakalandı, ancak kültür dönemi boyunca tripan mavisi görüntülerde de belirgindi. Bu gözlem, limbüsün etrafında tehlikeye atılmış endotel gösteren koyu renkli bir lekelenme halkası ile karakterizedir.Terime rağmen, bu model hem normal hem de distrofik kornealarda o kadar yaygındı ki, periferik boyama için pozitif olarak sayılmadılar. Bu protokol, Descemet'in sıyırılmasını takiben mühendislik ürünü FGF-1 ile tedavi edilen kültürlü kornealarda daha iyi iyileşme sonuçları göstermemizi sağladı. Ek olarak, bu sıyırma protokolü, DSO'yu inceleyen diğer araştırmacılar için değerli bir yöntem olarak hizmet eder ve diğer yara iyileştirme tedavilerini test etmek, cerrahi teknikteki değişiklikleri değerlendirmek ve farklı donör popülasyonları veya hastalığın aşamaları arasında iyileşmeyi karşılaştırmak da dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.Bu araştırmanın ve bu protokolü kullanan diğer araştırmaların klinisyenleri DSO'yu gelecekte uygun FECD hastaları için değerli bir tedavi seçeneği olarak görmeye teşvik edeceğini umuyoruz.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

Yara Şifa murin Modeli

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Sıçangiller Kornea Nakli: Katı Organ Nakli En Yaygın Formu Eğitim için Bir Model

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Descemet Membran endotelyal keratoplasti için Kornea Donör doku hazırlanması

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Three Different Protocols of Corneal Collagen Crosslinking in Keratoconus: Conventional, Accelerated and Iontophoresis

Keratokonus Kornea Kollajen çapraz bağlama Üç Farklı Protokoller: Konvansiyonel, Hızlandırılmış ve İyontoforez

Keratoconus is a bilateral and progressive corneal ectasia. In order to slow down its progression, corneal collagen cross-linking (CXL) has recently been ...

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

Bir Domuz Modeli heterotopik Böbrek Ototransplantasyon: Bir Adım-Adım Protokolü

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Stratejik Endotel Hücre Tüp Oluşumu Testi: Azaltılmış Ekstrasellüler Matrix Ekstrasellüler Matrix ve Büyüme Faktörü Karşılaştırılması

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Farelerde Hızlandırılmış Ateroskleroz Indüksiyonu: "Tel-Yaralanma" Modeli

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Creation of a Rodent Model of Abdominal Aortic Aneurysm by Blocking Adventitial Vasa Vasorum Perfusion

Abdominal aort anevrizması Adventitial Vasa Vasorum perfüzyon engelleyerek kemirgen bir Model oluşturulması

The adventitial vasa vasorum (VV) provides oxygen and nourishment to the aortic wall. Hypoxia in the aortic wall can cause enlarged abdominal aortic ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Soruşturma von Willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası Model von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumu

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Kornea epitel aşınma oküler Burr ile bir Model olarak kornea için yara iyileşme

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...