Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والعلوم والتنمية التكنولوجية في جمهورية صربيا رقم العقد رقم 451-03-9 / 2021-14 / 200178 ، ومشروع مجموعة التعليم والتدريب FENS - NENS "الدورة الثلاثية حول الخلايا الدبقية في الالتهاب العصبي" ، ومنحة EC H2020 MSCA RISE #778405. نشكر ماريا أدزيتش ومينا بيريتش على تزويدهما بصور الكيمياء الهيستولوجية المناعية ودانييلا باتافيليتش للمساعدة في الكتابة الورقية.

تم إجراء جميع التجارب وفقا لتوجيهات الاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات للأغراض العلمية وبإذن من اللجنة الأخلاقية لكلية الأحياء بجامعة بلغراد (رقم الموافقة EK-BF-2016/08). فيما يتعلق بمواد المريض (الأمصال ل IgGs) ، تم جمعها للفحص السريري الروتيني بموافقة المريض المستنيرة وفقا لمدونة أخلاقيات ?...

يقدم هذا البحث طريقة زراعة الخلايا الأولية كأداة سريعة و "على الميزانية" لدراسة الجوانب المختلفة لفسيولوجيا الخلية (المرضية) مثل ALS في نموذج الفئران hSOD1G93A . وبالتالي فإن هذه التقنية مناسبة للدراسات على مستوى الخلية الواحدة التي يمكن استقرائها والتحقيق فيها بشكل أكبر على مستوى أعلى م?...

أدت تقنيات زراعة الخلايا إلى العديد من التطورات في مجالات متنوعة من الفيزيولوجيا العصبية الخلوية في الصحة والمرض. على وجه الخصوص ، تسمح مزارع الخلايا الأولية ، المعزولة حديثا من الأنسجة العصبية لحيوان المختبر ، للمجرب بدراسة سلوك الخلايا المتنوعة عن كثب في وسائط كيميائية حيوية وإعدادات فسيولوجية مختلفة. يوفر استخدام مؤشرات فسيولوجية فلورية مختلفة مثل الأصباغ الحساسة ل Ca2+ مع الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني رؤية أفضل للعمليات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية الخلوية في الوقت الفعلي.
ALS هو مرض تنكسي عصبي مدمر يؤثر على الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية1. هذا المرض لديه إمراض معقد من النوع العائلي ولكن في الغالب من شكل متقطع (90 ٪ من الحالات)2. من المعروف أن الآليات المستقلة غير الخلوية تساهم في الفيزيولوجيا المرضية لمرض التصلب الجانبي الضموري ، ويرجع ذلك أساسا إلى الدور الأساسي للخلايا الدبقية3. كما يتميز مرض التصلب الجانبي الضموري بأنه مرض التهابي عصبي مع تورط عوامل الالتهاب الخلطية والخلوية.
يستخدم الغلوبولين المناعي G على نطاق واسع كعلامة جزيئية في ALS والأمراض التنكسية العصبية الأخرى. يمكن أن تشير دراسة مستوى مصل هذه العلامة إلى وجود ومرحلة الالتهاب العصبي في المرض4،5،6 ، في حين أن وجودها في السائل النخاعي يمكن أن يشير إلى خرق حاجز الدم في الدماغ7. تم تحديد IgGs أيضا كرواسب في الخلايا العصبية الحركية للحبل الشوكي لمرضى ALS7. ومع ذلك ، فقد أظهر هذا النهج بعض التناقضات في ارتباط مستوى IgGs بمرحلة وخصائص المرض6.
يمكن أن يؤدي IgG المعزول من أمصال مرضى ALS (ALS IgG) إلى استجابة الكالسيوم في الخلايا النجمية الساذجة8 وإطلاق الغلوتامات في الخلايا العصبية ، مما يشير إلى تأثير السمية المثيرة - وهي السمة المميزة لعلم أمراض ALS9. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات التي أجريت على نموذج الفئران hSOD1G93A ALS (الذي يحتوي على نسخ متعددة من طفرة SOD1 البشرية10) عددا من علامات الإجهاد التأكسدي في الخلايا العصبية المستزرعة 11 ، أو الأنسجة 12،13،14 ، أو الحيوانات الحية 13. من الجدير بالذكر أن الخلايا النجمية المستزرعة من نموذج الفئران ALS كانت أكثر عرضة للإجهاد التأكسدي الناجم عن البيروكسيد من الخلايا النجمية من فضلات القمامة غير المعدلة وراثيا11.
تتأثر الخلايا الدبقية الصغيرة في المزرعة ب ALS IgG بطريقة أقل وضوحا. وبالتحديد ، أظهر خط الخلايا الدبقية الصغيرة BV-2 ارتفاعا في الإشارة من علامات الفلورسنت للإجهاد التأكسدي استجابة لتطبيق عينات مرضى 4/11 ALS IgG فقط15. من المعروف أن الخلايا الدبقية الصغيرة تشارك في العديد من الأمراض الالتهابية العصبية ، مما يزيد من الإجهاد التأكسدي ومرحلة التقدم المتأخر في آلية مستقلة غير خلية من ALS16،17. ومع ذلك ، أشارت البيانات مع ALS IgGs إلى أن هذه الخلايا قد لا تكون متفاعلة مثل الخلايا النجمية لهذه العوامل الخلطية لالتهاب ALS. تم إجراء العديد من الدراسات مع الخلايا النجمية الأولية من نماذج ALS الفئران ، ليس فقط في الجراء ولكن أيضا في الحيوانات التي تظهر عليها أعراض ، إما على الدماغ أو على الحبل الشوكي18،19،20،21. وينطبق هذا أيضا على الثقافات الأولية الدبقية الصغيرة ، وإن كان بدرجة أقل من الخلايا النجمية ومعظمها من مناطق الدماغ في المرحلة الجنينية22،23،24.
نحن نستخدم تصوير فيديو الفاصل الزمني ل Ca2+ على الخلايا في الثقافة في المقام الأول كوسيلة لمتابعة العابرين داخل الخلايا لهذا الأيون كعلامة فسيولوجية للسمية الإثارة. وبالتالي ، من خلال التوصيف الفيزيائي الحيوي لهذه العابرين (السعة ، المنطقة تحت الزوال ، وقت الارتفاع ، التردد) يمكن للباحث الحصول على معلمات تشخيصية تجريبية من نماذج خلوية متنوعة للتنكس العصبي. وبالتالي ، توفر هذه التقنية ميزة التقييم الفسيولوجي الكمي ل IgGs كمؤشرات حيوية للمرض. هناك مجموعة كبيرة من الأدبيات حول دور IgGs و Ca2+ في تحريض ALS. تم إجراء معظم هذه الدراسات عن طريق تحفيز ALS عن طريق حقن المريض IgGs في التجارب25،26،27،28،29 ، والتي أظهرت بعد ذلك ارتفاع Ca 2+ داخل الخلايا وترسبات IgG. استكشفت مجموعة من الدراسات تأثير ALS IgGs على المشبك الحركي في المختبر30،31،32. في السياق أعلاه ، تركز التقنية المقدمة هنا على الخلايا الدبقية كلاعبين مهمين في الآلية المستقلة غير الخلوية ل ALS وتحدد استجابتها السمية المحتملة ل IgGs كعوامل خلطية للالتهاب العصبي. قد يكون لهذا النهج تطبيق أوسع في اختبار العوامل الخلطية الأخرى مثل الأمصال الكاملة أو السائل الدماغي الشوكي أو السيتوكينات في أنظمة زراعة الخلايا المختلفة وفي النماذج الخلوية للالتهاب العام.
تصف هذه الورقة كيفية تحضير الثقافات الأولية للخلايا الدبقية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة فئران Sprague Dawley وكيفية استخدام هذه الخلايا بشكل أكبر لدراسة الفيزيولوجيا المرضية ALS باستخدام IgG المشتق من الأمصال للمريض. تم تفصيل البروتوكولات لتحميل صبغ الخلايا المستزرعة (الشكل 1) وتسجيلات تغييرات Ca2+ في تجارب تصوير الفيديو بفاصل زمني. ستوضح أمثلة تسجيلات الفيديو كيف تتفاعل الخلايا الدبقية مع ALS IgG مقارنة ب ATP ، حيث يقوم الأخير بتنشيط مستقبلات الغشاء البيورينجي. يظهر لأول مرة مثال على كيفية تفاعل الخلايا النجمية المعزولة من دماغ الفئران hSOD1G93A ALS مع استجابة Ca 2+ أكثر وضوحا ل ALS IgG مقارنة بالضوابط غير المعدلة وراثيا وكيفية ربط هذه العملية بالاختلافات في تشغيل متجر Ca2+. يظهر أيضا مثال على تصوير الكالسيوم في الخلايا الدبقية الصغيرة التي تواجه تحديا حادا مع ALS IgG ، مع استجابة متواضعة فقط من الكالسيوم داخل الخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

يوضح هذا البروتوكول كيفية تحضير الثقافات الأولية للخلايا الدبقية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة فئران Sprague Dawley وكيفية استخدام هذه الخلايا لغرض دراسة الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري (ALS) في نموذج الفئران hSOD1G93A . أولا ، يوضح البروتوكول كيفية عزل وزراعة الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة الفئران بعد الولادة ، ثم كيفية توصيف واختبار هذه الثقافات من أجل النقاء عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام علامة البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) للخلايا النجمية وجزيء محول الكالسيوم المتأين 1 (Iba1) علامة الخلايا الدبقية الصغيرة. في المرحلة التالية ، يتم وصف طرق تحميل الصبغة (Fluo 4-AM الحساسة للكالسيوم) للخلايا المستزرعة وتسجيلات تغييرات Ca2+ في تجارب تصوير الفيديو على الخلايا الحية.
تتكون أمثلة تسجيلات الفيديو من: (1) حالات تصوير Ca2+ للخلايا النجمية المستزرعة المعرضة بشكل حاد للغلوبولين المناعي G (IgG) المعزول من مرضى ALS ، مما يدل على استجابة مميزة ومحددة مقارنة بالاستجابة ل ATP كما هو موضح في نفس التجربة. تظهر الأمثلة أيضا ارتفاعا عابرا أكثر وضوحا في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الذي يثيره ALS IgG في الخلايا النجمية hSOD1G93A مقارنة بالضوابط غير المعدلة وراثيا. (2) تصوير Ca 2+ للخلايا النجمية المستزرعة أثناء استنفاد مخازن الكالسيوم بواسطة thapsigargin (Thg) ، وهو مثبط غير تنافسي للشبكة الإندوبلازمية Ca 2+ ATPase ، متبوعا بدخول الكالسيوم الذي يتم تشغيله في المتجر الناتج عن إضافة الكالسيوم في محلول التسجيل ، مما يوضح الفرق بين تشغيل مخزن Ca 2+ في hSOD1G93A وفي الخلايا النجمية غير المعدلة وراثيا ؛ (3) تصوير Ca2+ للخلايا الدبقية الصغيرة المستزرعة يظهر في الغالب عدم الاستجابة ل ALS IgG ، في حين أن تطبيق ATP أثار تغيير Ca2 +. تؤكد هذه الورقة أيضا على المحاذير والتحذيرات المحتملة فيما يتعلق بكثافة الخلايا الحرجة ونقاء الثقافات ، واختيار التركيز الصحيح لصبغة Ca2+ وتقنيات تحميل الصبغة.

توصيف أنواع الخلايا الدبقية المختلفة في الثقافة عادة ما يستغرق إنتاج الخلايا النجمية للتجارب من 15 إلى 21 يوما ، بينما تستغرق الخلايا الدبقية الصغيرة من 10 إلى 15 يوما لتنمو. تم إجراء التلوين المناعي لتقييم نقاء الخلايا في الثقافة. يوضح الشكل 1 التعبير عن وضع العلام?...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

نقدم هنا بروتوكولا حول كيفية تحضير الثقافات الأولية للخلايا الدبقية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة الفئران لتصوير فيديو الفاصل الزمني ل Ca2+ داخل الخلايا للبحث في الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري في نموذج الفئران hSOD1G93A .

الثقافات الأولية للخلايا النجمية للفئران والخلايا الدبقية الصغيرة واستخدامها في دراسة التصلب الجانبي الضموري

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

يسمح هذا البروتوكول بالكشف عن نمط إشارات الكالسيوم بين الخلايا الذي يميز استجابة كل نوع خلية في الصحة وكذلك في المرض. تسمح هذه التقنية بالتوصيف الفيزيائي الحيوي السريع والمفصل للسلوك الخلوي المعقد. نحن نخطط لاستخدام إشارات الكالسيوم التي يسببها IgG كبصمة للطب الشخصي للأمراض الالتهابية العصبية.في بيئة الحياة الواقعية ، ليس من السهل رؤية ومتابعة جميع العمليات والأحداث ، خاصة تلك التي تحدث تحت المجهر. وبالتالي ، فإن البيانات المرئية مهمة. بعد قطع رأس الجراء الذين تتراوح أعمارهم بين يوم وثلاثة أيام ، فضح الجمجمة عن طريق فتح الجلد باستخدام مقص صغير الزاوية.ثم افتح الجمجمة عن طريق قطع الثقبة العظمى باتجاه المدارات وقم بعمل قطع خط الوسط العمودي. إزالة الدماغ من الجمجمة ، ووضعها في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني. استخدم طرف الملقط لتمزيق الوصلات بين نصفي الكرة الأرضية ، وفصل نصفي الكرة الأرضية بالملقط المنحني عن طريق دفع نصف الكرة برفق من المركز إلى الجانب.استخدم ملقط مستقيم ومنحني لإزالة السحايا عن طريق تمزيقها بعناية. ثم قم بإزالة الحصين عن طريق قرصه بالملقط المنحني ، وتجاهله ، أو استخدمه لإعداد ثقافة خلية أخرى. بعد ذلك ، انقل القشرة إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من PBS البارد وقم بتجانس الأنسجة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل من 10 إلى 15 مرة بطرف ملليلتر واحد.الطرد المركزي للخلايا في 500 غرام لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ثلاثة ملليلتر من PBS البارد عن طريق السحب بطرف ملليلتر واحد. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى ، وإعادة تعليق الحبيبات في ملليلتر من DMEM الكامل المكمل بنسبة 10٪ FBS والمضادات الحيوية.بعد نقل التجانس إلى أنبوب سعة 2 ملليلتر ، مرر التجانس من خلال إبر قياس 21 و 23 لعمل تعليق للخلايا المفردة. صب تعليق الخلية المحضر من قشرة واحدة في طبق بتري 60 ملم يحتوي على ثلاثة ملليلتر من DMEM الكامل ، وهز طبق بتري برفق ، بحيث يتم توزيع التعليق بشكل موحد. احتضان الخلايا في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ من الهواء عند 37 درجة مئوية.لتعزيز نمو الخلايا النجمية ، قم بإزالة الوسائط القديمة ، واغسل الخلية باستخدام PBS الدافئ مسبقا لإزالة الخلايا الدبقية المرتبطة بشكل فضفاض وآثار FBS بمجرد وصولها إلى 70 إلى 80٪ من التقاء. ثم قم بتربسين الطبقة الأساسية من الخلايا النجمية عن طريق إضافة ملليلتر واحد من محلول التربسين الدافئ مسبقا واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. استخدم المجهر للتحقق مما إذا كانت الخلايا تبدأ في الانفصال ، وأضف أربعة ملليلتر من DMEM الكامل.جمع تعليق الخلية ، ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر. ثم الطرد المركزي الأنبوب في 500 غرام لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من الوسط الكامل.عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. بعد ذلك ، قم بإعداد طبق الثقافة وإضافة وسط الثقافة. أعد طلاء الخلايا بكثافة من 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع في خمسة ملليلتر من DMEM الكامل الطازج واغسل الخلايا باستخدام DMEM الكامل قبل كل استبدال للوسائط.بعد الوصول إلى 70 إلى 80٪ من التقاء ، كرر التربسين ، والبذور خمس مرات 10 إلى الخلايا النجمية الثالثة على زلة غطاء زجاجي دائري مطلي ببولي إل ليسين بسبعة ملليمترات. دعهم يعلقون لمدة 10 دقائق ، وأضف DMEM كاملا. استخدمها في التجارب بعد 48 ساعة.بعد تحضير الثقافات الدبقية الصغيرة ، لتعزيز الخلايا الدبقية الصغيرة ، اسمح للخلايا الدبقية بأن تصبح متقاربة وستظهر الخلايا الدبقية الصغيرة أعلى طبقة الخلايا النجمية بعد 10 إلى 15 يوما. هز طبق بتري على شاكر مداري لمدة ساعتين بسرعة 220 دورة في الدقيقة. الآن ، اغسل برفق الخلايا المنفصلة والمرفقة بشكل فضفاض عن طريق استنشاق الطافية بطرف ماصة سعة ملليلتر.قم بتوزيع المادة الطافية برفق على طبقة الخلايا عدة مرات ، مما يضمن تغطية سطح طبقة الخلية بالكامل أثناء خطوة الغسيل هذه. جمع الوسط مع الخلايا المنفصلة ، ونقله إلى أنبوب 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي والإنعاش وعد الخلايا كما هو موضح سابقا.البذور خمس مرات 10 إلى الخلايا الدبقية الصغيرة الثالثة على زلة غطاء زجاجي دائري مطلي ب poly-L-lysine بسبعة ملليمترات. دعهم يعلقون لمدة 10 دقائق وإضافة DMEM كاملة. استخدمها في التجارب بعد 48 ساعة.لغسل DMEM الكامل ، انقل زلة غطاء واحدة إلى طبق بمحلول خارج الخلية. تحضير محلول تحميل الصبغة عن طريق تخفيف واحد مليمولار Fluo-4 AM بمحلول خارج الخلية لتحقيق التركيز النهائي لخمسة ميكرومولار. ضع زلة الغطاء مع الخلايا في محلول تحميل الصبغة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، واغسل الخلايا في محلول خارج الخلية لمدة 20 دقيقة.ضع زلة الغطاء في غرفة التسجيل مع ملليلتر واحد من محلول العمل. اختر مجال الرؤية الذي يحتوي على عدد ثابت من الخلايا خلال التجربة. ابدأ التصوير وحدد خط الأساس من خلال الحصول على المستوى الأساسي للتألق لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.ثم أوقف تدفق حل العمل ، وانتقل إلى حل الاختبار لطول الوقت المطلوب. بين كل محلول اختبار ، اغسل الخلايا بتدفق مستمر لمحلول العمل لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. حافظ على حجم المحلول في غرفة التسجيل عند ملليلتر واحد عن طريق ترتيب شفط مستمر من أعلى المحلول.اختر إطار كثافة الإشارة الأعلى، وقم بتطويق خلية واحدة باستخدام تطبيق أداة المضلع. بعد تطويق جميع الخلايا في الحقل المكتسب ، اختر خمس مناطق ذات أهمية في الخلفية باستخدام أداة الدائرة. ثم قم بقياس متوسط شدة الإشارة لخلية واحدة والخلفية لكل إطار زمني.حدد جميع مناطق الاهتمام، واستخدم الأمر Multi-Measure في ROI Manager في ImageJ، أو أي أمر مكافئ في البرامج التجارية. بعد استيراد البيانات في برنامج MATLAB ، متوسط خمسة عائد استثمار في الخلفية وطرح متوسط الخلفية لكل إطار من متوسط كثافة عائد الاستثمار للإطارات المكتسبة في وقت واحد. في وقت لاحق ، قم بتحليل نشاط الكالسيوم عن طريق تحديد سعة ذروة الكالسيوم ، والتغيير المتكامل لعابر الكالسيوم ، والوقت إلى الذروة ، ووقت الارتفاع ، ونصف العرض ، والتردد.يستخدم GFAP لتصور الخلايا النجمية و Iba1 لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة. تستجيب الخلايا النجمية hSOD1G93A للغلوبولين المناعي ALS G بسعة أكبر للكالسيوم العابر ، وتغيير متكامل شامل أكثر أهمية ، ووقت أقصر للذروة من الخلايا النجمية غير المعدلة وراثيا. يمكن تمييز الاستجابة للغلوبولين المناعي ALS G عن الاستجابة ل ATP.كان لدى الخلايا النجمية hSOD1G93A مستوى أعلى من أيونات الكالسيوم في المخازن كما كشف عن استنفاد المخزن ، مما يشير إلى وجود حمل زائد لهذا الأيون. تم استزراع الخلايا الدبقية الصغيرة ، وتم استخراج متوسط شدة التألق بمرور الوقت. تمثل آثار الكالسيوم لثلاث خلايا أن خلية واحدة فقط استجابت للغلوبولين المناعي ALS G ، بينما استجابت جميع الخلايا ل ATP.تمثل الصور ذات الألوان الزائفة شدة التألق وخط الأساس استجابة ل ALS و IgG و ATP. يجب تحميل الخلايا بشكل كاف ويجب تعديل معلمات نظام التصوير بشكل مناسب ، بحيث لا يتم فصل الإشارة أثناء التجربة. جنبا إلى جنب مع انبعاث الكالسيوم ، يمكن إجراء لقط التصحيح.وبالتالي ، يمكن الحصول على صورة أكثر اكتمالا للعلاقة بين التيارات الأيونية الغشائية المختلفة وانبعاث الكالسيوم. يعد فهم توازن الكالسيوم داخل الخلايا ذا أهمية أساسية لاستكشاف العديد من الاستجابات للمنبهات الطبيعية وكذلك للمحفزات الخارجية المجهدة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

استخدام الاشراط الكلاسيكي اييبلينك تتبع لتقييم هيبوكامبال الخلل في نموذج الفئران من اضطرابات طيف الكحول الجنيني

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

عزل المغناطيسي السريع والمكرر CD11b من الابتدائية الخلايا الدبقية الصغيرة مع الطهارة تعزيز وطلاقة

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

تحليل يستند إلى الخلية لدراسة التخليص تاو جسم بوساطة من Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

نهج تغذية الأجسام المضادة لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات في ثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

استخدام الشعيرات الدموية المناعة الكهربائية للبحث عن المؤشرات الحيوية المحتملة للتصلب الجانبي الضموري في الصفائح الدموية البشرية

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

استخدام الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة الأولية لدراسة تجميع الأجزاء الأولية أكسون

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

تقييم ضعف المحرك في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...