Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Undervisningsministeriets kontrakt nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, FENS - NENS Education and Training Cluster-projektet "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" og EC H2020 MSCA RISE-bevilling #778405. Vi takker Marija Adžić og Mina Perić for at levere immunhistokemiske billeder og Danijela Bataveljić for hjælp til papirskrivning.

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med EU's direktiver om beskyttelse af dyr til videnskabelige formål og med tilladelse fra den etiske kommission ved Det Biologiske Fakultet, Beograd Universitet (godkendelsesnummer EK-BF-2016/08). Med hensyn til patientmateriale (sera for IgG'er) blev det indsamlet til rutinemæssig klinisk undersøgelse med informeret patients samtykke i overensstemmelse med Verdenslægeforeningens etiske kodeks (Helsinki-erklæringen) for forsøg, der involverede mennesker. Protokollen blev...

Dette papir præsenterer metoden til primær celledyrkning som et hurtigt og "på budgettet" værktøj til at studere forskellige aspekter af celle (pato) fysiologi såsom ALS i rotte hSOD1G93A-modellen . Teknikken er således velegnet til undersøgelser på enkeltcelleniveau, der kan ekstrapoleres og undersøges yderligere på et højere organisationsniveau (dvs. i vævsskiver eller i et levende dyr). Celledyrkning som teknik har dog et par forbehold. Det er mest kritisk at isolere hjernevævet og dissociere ...

Cellekulturteknikker har givet anledning til adskillige fremskridt inden for forskellige områder af cellulær neurofysiologi inden for sundhed og sygdom. Især primære cellekulturer, der er frisk isoleret fra et laboratoriedyrs neuronale væv, giver eksperimentatoren mulighed for nøje at studere forskellige cellers adfærd i forskellige biokemiske medier og fysiologiske opsætninger. Brug af forskellige fluorescerende fysiologiske indikatorer såsom Ca2+-følsomme farvestoffer i kombination med time-lapse videomikroskopi giver bedre indsigt i de cellulære biofysiske og biokemiske processer i realtid.
ALS er en ødelæggende neurodegenerativ sygdom, der påvirker øvre og nedre motorneuroner1. Sygdommen har en kompleks patogenese af den familiære type, men for det meste af den sporadiske form (90% af tilfældene)2. Det er velkendt, at ikke-celle autonome mekanismer bidrager til ALS patofysiologi, primært på grund af gliaceller3. ALS er også godt karakteriseret som en neuroinflammatorisk sygdom med involvering af humorale og cellulære faktorer af inflammation.
Immunoglobulin G anvendes i vid udstrækning som en molekylær markør i ALS og andre neurodegenerative sygdomme. At studere serumniveauet af denne markør kan indikere tilstedeværelsen og stadiet af neuroinflammation i sygdommen 4,5,6, mens dets tilstedeværelse i cerebrospinalvæsken kan indikere et brud på blodhjernebarrieren7. IgG'er blev også identificeret som aflejringer i rygmarvsmotorneuronerne hos ALS-patienter7. Ikke desto mindre har denne tilgang vist nogle uoverensstemmelser i sammenhængen mellem niveauet af IgG'er og sygdommens stadium og egenskaber6.
IgG isoleret fra sera af ALS-patienter (ALS IgG) kan inducere et calciumrespons i naive astrocytter8 og glutamatfrigivelse i neuroner, hvilket peger på en excitotoksisk virkning - et kendetegn ved ALS-patologi9. Undersøgelser af hSOD1G93A ALS-rottemodellen (indeholdende flere kopier af den humane SOD1-mutation10) viste imidlertid en række markører for oxidativ stress i dyrkede neuroglialceller11, væv 12,13,14 eller levende dyr 13. Det er bemærkelsesværdigt, at astrocytterne dyrket fra ALS-rottemodellen var mere tilbøjelige til oxidativ stress induceret af peroxid end astroglia fra ikke-transgene kuldkammerater11.
Mikroglialceller i kultur påvirkes af ALS IgG på en mindre tilsyneladende måde. En BV-2 mikroglialcellelinje viste nemlig en stigning i signalet fra fluorescerende markører for oxidativ stress som reaktion på anvendelsen af kun 4/11 ALS IgG-patientprøver15. Det er velkendt, at microglia deltager i mange neuroinflammatoriske patologier, hvilket øger oxidativ stress og sen progressionsfase i den ikke-celle autonome mekanisme af ALS16,17. Ikke desto mindre viste dataene med ALS IgG'er, at disse celler muligvis ikke er så reaktive som astrocytter til disse humorale faktorer af ALS-inflammation. Flere undersøgelser er blevet udført med primære astrocytter fra ALS murine modeller, ikke kun hos hvalpe, men også i symptomatiske dyr, enten på hjernen eller på rygmarven 18,19,20,21. Dette gælder også for mikroglial primære kulturer, men i mindre grad end astrocytter og for det meste fra hjerneområder på fosterstadiet22,23,24.
Vi bruger time-lapse videobilleddannelse af Ca2+ på celler i kultur primært som et middel til at følge intracellulære transienter af denne ion som en fysiologisk markør for excitotoksicitet. Ved biofysisk karakterisering af disse transienter (amplitude, areal under forbigående, stigningstid, frekvens) kan forskeren således opnå eksperimentelle diagnostiske parametre fra forskellige cellulære modeller af neurodegeneration. Denne teknik giver således en fordel ved en kvantitativ fysiologisk vurdering af IgG'er som sygdomsbiomarkører. Der er en stor mængde litteratur om IgGs og Ca2+ rolle i induktionen af ALS. De fleste af disse undersøgelser blev udført ved at inducere ALS ved at injicere patient IgG'er i forsøgsdyr 25,26,27,28,29, som derefter viste intracellulær Ca 2+ elevation og IgG depositioner. En række undersøgelser undersøgte effekten af ALS IgGs på motorsynapsen in vitro30,31,32. I ovenstående sammenhæng sætter teknikken, der præsenteres her, fokus på gliaceller som vigtige aktører i ALS's ikke-celleautonome mekanisme og kvantificerer deres potentielle excitotoksiske respons på IgG'er som humorale faktorer for neuroinflammation. Denne tilgang kan have en bredere anvendelse til test af andre humorale faktorer såsom hele sera, CSF eller cytokiner i forskellige cellekultursystemer og i cellulære modeller af generel inflammation.
Dette papir beskriver, hvordan man forbereder primære kulturer af gliaceller, astrocytter og microglia fra cortices af Sprague Dawley rotter, og hvordan man yderligere kan bruge disse celler til at studere ALS patofysiologi med patient sera-afledt IgG. Protokoller er detaljerede for farvelægning af dyrkede celler (figur 1) og optagelser af Ca2+ ændringer i time-lapse videobilleddannelseseksperimenter. Eksempler på videooptagelser vil vise, hvordan gliaceller reagerer på ALS IgG sammenlignet med ATP, hvor sidstnævnte aktiverer purinerge membranreceptorer. Vist for første gang er et eksempel på, hvordan astrocytter isoleret fra hSOD1G93A ALS rottehjerne reagerer med et mere udtalt Ca 2+ respons på ALS IgG sammenlignet med ikke-transgene kontroller, og hvordan man relaterer denne proces til forskellene i Ca2+ butiksdrift. Også vist er et eksempel på calciumbilleddannelse i mikroglialceller, der er akut udfordret med ALS IgG, med kun et beskedent respons af intracellulært calcium.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

Denne protokol demonstrerer, hvordan man forbereder primære kulturer af gliaceller, astrocytter og microglia fra cortices af Sprague Dawley rotter, og hvordan man bruger disse celler med det formål at studere patofysiologien af amyotrofisk lateral sklerose (ALS) i rotte hSOD1G93A modellen. For det første viser protokollen, hvordan man isolerer og dyrker astrocytter og microglia fra postnatale rottekortika, og derefter hvordan man karakteriserer og tester disse kulturer for renhed ved immuncytokemi ved hjælp af glialfibrillary acidic protein (GFAP) markør for astrocytter og den ioniserede calciumbindende adaptermolekyle 1 (Iba1) mikroglial markør. I næste fase beskrives metoder til farvestofbelastning (calciumfølsom Fluo 4-AM) af dyrkede celler og optagelser af Ca2+ ændringer i videobilleddannelseseksperimenter på levende celler.
Eksemplerne på videooptagelser består af: (1) tilfælde af Ca2+ billeddannelse af dyrkede astrocytter, der er akut eksponeret for immunoglobulin G (IgG) isoleret fra ALS-patienter, hvilket viser et karakteristisk og specifikt respons sammenlignet med responsen på ATP som vist i samme eksperiment. Eksempler viser også en mere udtalt forbigående stigning i intracellulær calciumkoncentration fremkaldt af ALS IgG i hSOD1G93A astrocytter sammenlignet med ikke-transgene kontroller; (2) Ca 2+ billeddannelse af dyrkede astrocytter under en udtømning af calciumlagre af thapsigargin (Thg), en ikke-konkurrencedygtig hæmmer af det endoplasmatiske retikulum Ca 2+ ATPase, efterfulgt af lagerdrevet calciumindgang fremkaldt af tilsætning af calcium i registreringsopløsningen, hvilket viser forskellen mellem Ca2+ butiksdrift i hSOD1G93A og i ikke-transgene astrocytter; (3) Ca 2+-billeddannelse af den dyrkede microglia, der overvejende viser manglende respons på ALS IgG, mens ATP-applikationen fremkaldte en Ca2+-ændring. Dette papir understreger også mulige forbehold og advarsler vedrørende kritisk celletæthed og renhed af kulturer ved at vælge den korrekte koncentration af Ca2+ farvestof og farvestofbelastningsteknikker.

Karakterisering af forskellige gliacelletyper i kultur Det tager normalt 15-21 dage at producere astrocytter til eksperimenter, mens mikroglialceller tager 10-15 dage at vokse. Immunostaining blev udført for at vurdere kulturens cellerenhed. Figur 1 viser ekspressionen af dobbelt mærkning af den astrocytiske markør GFAP og mikroglialmarkøren Iba1 i respektive kulturer.
Calciumbilleddannelse er kendt for at afsløre forskellene i cellefysiol...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Vi præsenterer her en protokol om, hvordan man forbereder primære kulturer af gliaceller, astrocytter og microglia fra rottekortika til time-lapse videobilleddannelse af intracellulær Ca2+ til forskning i patofysiologi af amyotrofisk lateral sklerose i hSOD1G93A rottemodellen.

Primære kulturer af rotteastrocytter og microglia og deres anvendelse i undersøgelsen af amyotrofisk lateral sklerose

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Denne protokol gør det muligt at afsløre intercellulært calciumsignalmønster, der karakteriserer hver celletyperespons i sundhed såvel som i sygdom. Denne teknik tillader hurtig og detaljeret biofysisk karakterisering af kompleks cellulær adfærd. Vi planlægger at bruge denne IgG-inducerede calciumsignalering som et fingeraftryk til personlig medicin af neuroinflammatoriske sygdomme.I det virkelige liv er det ikke let at se og følge alle processer og begivenheder, især dem, der sker under mikroskopet. Derfor er de visuelle data vigtige. Efter halshugning af en til tre dage gammel hvalp skal du udsætte kraniet ved at skære huden op ved hjælp af en lille vinklet saks.Åbn derefter kraniet ved at skære foramen magnum mod banerne og lav et vinkelret midterlinjesnit. Fjern hjernen fra kraniet, og læg den i en petriskål, der indeholder PBS. Brug spidsen af tangen til at rive forbindelserne mellem begge halvkugler, og adskil halvkuglerne med buede tang ved forsigtigt at skubbe en halvkugle fra midten til siden.Brug lige og buede tang til at fjerne hjernehinderne ved forsigtigt at rive dem. Fjern derefter hippocampus ved at klemme den med buede tang, og kassér eller brug den til et andet cellekulturpræparat. Overfør derefter cortex til et 15 milliliter rør indeholdende tre milliliter kold PBS og homogeniser vævet ved at pipettere op og ned 10 til 15 gange med en en-milliliter spids.Centrifuge cellerne ved 500 g i fem minutter. Kassér supernatanten og suspender pelleten i tre milliliter kold PBS ved at pipettere med en en milliliter spids. Centrifuge igen, og resuspend pellet i to milliliter komplet DMEM suppleret med 10% FBS og antibiotika.Efter overførsel af homogenatet til et to-milliliter rør, føres homogenatet gennem 21 og 23-gauge nåle for at lave en suspension af enkeltceller. Hæld cellesuspensionen fremstillet fra en cortex i en 60 millimeter petriskål indeholdende tre milliliter komplet DMEM, og ryst petriskålen let, så suspensionen fordeles ensartet. Inkubere cellerne i en befugtet inkubator med 5% kuldioxid og 95% luft ved 37 grader Celsius.For at fremme astrocytvækst skal du fjerne de gamle medier og vaske cellen med forvarmet PBS for at fjerne de løst vedhæftede gliaceller og spor af FBS, når de når 70 til 80% sammenløb. Prøv derefter det underliggende lag af astrocytter ved at tilføje en milliliter forvarmet trypsinopløsning og inkubere ved 37 grader Celsius i to til fem minutter. Brug et mikroskop til at kontrollere, om cellerne begynder at løsne sig, og tilsæt fire milliliter komplet DMEM.Saml cellesuspensionen, og overfør den til et 15 ml rør. Centrifuger derefter røret ved 500 g i fem minutter. Kassér supernatanten og suspender pelleten i en milliliter komplet medium.Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Forbered derefter kulturskålen og tilføj kulturmedium. Replate cellerne med en tæthed på 10 til de fjerde celler pr. Kvadratcentimeter i fem milliliter frisk komplet DMEM og vask cellerne med komplet DMEM før hver medieudskiftning.Efter at have nået 70 til 80% sammenløb, gentag trypsinisering og frø fem gange 10 til den tredje astrocytter på en syv millimeter poly-L-lysinbelagt cirkulær glasdæksel. Lad dem vedhæfte i 10 minutter, og tilføj komplet DMEM. Brug dem i eksperimenter efter 48 timer.Efter at have forberedt mikroglialkulturerne, for at fremme microglia, lad gliacellerne blive sammenflydende, og microglia vises oven på astrocytlaget efter 10 til 15 dage. Ryst petriskålen på en orbital shaker i to timer ved 220 o / min. Vask nu let de løsrevne og løst fastgjorte celler ved at opsuge supernatanten med en en milliliter pipettespids.Dispenser forsigtigt supernatanten på cellelaget flere gange, og sørg for at dække hele cellelagets overflade under dette vasketrin. Saml mediet med de løsrevne celler, og overfør det til et 15 milliliter rør. Centrifuge, resuspender og tæl cellerne som vist tidligere.Frø fem gange 10 til den tredje microglia på en syv millimeter poly-L-lysinbelagt cirkulær glasdæksel. Lad dem vedhæfte i 10 minutter og tilføj komplet DMEM. Brug dem i eksperimenter efter 48 timer.For at vaske den komplette DMEM skal du overføre en dækseddel til en skål med ekstracellulær opløsning. Forbered farvestofbelastningsopløsningen ved at fortynde en millimolar Fluo-4 AM med ekstracellulær opløsning for at opnå den endelige koncentration af fem mikromolar. Anbring dækselsedlen med celler i farvestofbelastningsopløsningen i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke, og vask cellerne i ekstracellulær opløsning i 20 minutter.Anbring dækslet i optagekammeret med en milliliter arbejdsløsning. Vælg det synsfelt, der har et ensartet antal celler i hele eksperimentet. Start billeddannelsen og bestem basislinjen ved at erhverve det basale niveau af fluorescens i tre til fem minutter.Stop derefter arbejdsløsningens flow, og skift til testopløsningen i den ønskede periode. Mellem hver testopløsning vaskes cellerne med en konstant strøm af arbejdsløsningen i tre til fem minutter. Opløsningsvolumenet i optagekammeret holdes på en milliliter ved at arrangere et konstant sug fra toppen af opløsningen.Vælg den højeste signalintensitetsramme, og omkrøl en celle ved hjælp af polygonalværktøjsapplikationen. Når du har omringet alle cellerne i det erhvervede felt, skal du vælge fem områder af interesse i baggrunden ved hjælp af cirkelværktøjet. Mål derefter den gennemsnitlige signalintensitet for en enkelt celle og baggrunden for hver tidsramme.Vælg alle interesseområder, og brug kommandoen Multimåling i ROI Manager i ImageJ eller en tilsvarende kommando i kommerciel software. Efter import af dataene i MATLAB-software skal du i gennemsnit have fem baggrunds-ROI'er og trække den gennemsnitlige baggrund for hver ramme fra den gennemsnitlige ROI-intensitet af de rammer, der er erhvervet samtidigt. Senere analyseres calciumaktiviteten ved at bestemme amplituden af calciumtoppen, den integrerede ændring af calciumtransienten, tid til top, stigningstid, halv bredde og frekvens.GFAP bruges til at visualisere astrocytter og Iba1 til at visualisere microglia. hSOD1G93A astrocytter reagerer på ALS immunoglobulin G med større amplitude af calcium forbigående, en mere betydelig samlet integreret ændring og en kortere tid til at toppe end ikke-transgene astrocytter. Responsen på ALS immunoglobulin G kan skelnes fra responsen på ATP.hSOD1G93A astrocytter havde et højere niveau af calciumioner i butikkerne som afsløret ved butiksudtømning, hvilket indikerer en overbelastning af denne ion. Microglia blev dyrket, og den gennemsnitlige fluorescensintensitet blev ekstraheret over tid. Calciumsporene af tre celler repræsenterede, at kun en celle reagerede på ALS immunoglobulin G, mens alle celler reagerede på ATP.Pseudofarvebillederne repræsenterede fluorescensintensiteten og basislinjen som reaktion på ALS, IgG og ATP. Cellerne skal indlæses tilstrækkeligt, og parametrene i billeddannelsessystemet skal justeres korrekt, så signalet ikke adskilles under eksperimentet. Sammen med calciumemission kan patch fastspænding udføres.Således kan der opnås et mere komplet billede af sammenhængen mellem forskellige membranionstrømme og calciumemittering. Forståelsen af intracellulær calciumhomeostase er af afgørende betydning for udforskningen af flere reaktioner på naturlige såvel som stressende og eksterne stimuli.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokol til tredimensionel Konfokal Morfometrisk Analyse af Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Brugen af Trace Eyeblink klassisk konditionering at vurdere hippocampus dysfunktion i en rotte Model af føtale alkohol spektrum forstyrrelser

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Hurtig og Raffineret CD11b Magnetisk Isolering af Primary Mikroglia med Enhanced Renhed og Alsidighed

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsafhængig stigning i netværksresponset til stimulering af neuronale cellekulturer på mikroelektrodearrayer

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering og Isolation af musen primære mikroglia ved tæthed Gradient centrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Celle-baserede analyse at studere antistof-medieret Tau Clearance af mikroglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

En antistof fodring tilgang til at studere glutamat receptor handel i dissocierede primære hippocampus kulturer

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Brug af kapillær elektroforese Immunoassay at søge efter potentielle biomarkører for amyotrofisk lateral sklerose i humane blodplader

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Brug af primære kulturperler Hippocampal Neuroner til at studere forsamlingen af Axon indledende segmenter

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluering af motorisk svækkelse i C. elegans Modeller af Amyotrofisk Lateral Sklerose

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...