Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologische Ontwikkeling, contract nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, het FENS - NENS Education and Training Cluster-project "Trilaterale cursus over glia in neuro-inflammatie" en de EC H2020 MSCA RISE-subsidie # 778405. We bedanken Marija Adžić en Mina Perić voor het leveren van de immunohistochemische beelden en Danijela Bataveljić voor hulp bij het schrijven van papier.

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijnen inzake de bescherming van dieren voor wetenschappelijke doeleinden en met toestemming van de Ethische Commissie van de Faculteit Biologie, Universiteit van Belgrado (goedkeuringsnummer EK-BF-2016/08). Met betrekking tot patiëntenmateriaal (sera voor IgG's) werd het verzameld voor routinematig klinisch onderzoek met toestemming van de geïnformeerde patiënt in overeenstemming met de ethische code van de World Medical Association (Verklaring van...

Dit artikel presenteert de methode van primaire celkweek als een snelle en "on the budget" tool voor het bestuderen van verschillende aspecten van cel (patho)fysiologie zoals ALS in het rat hSOD1G93A model. De techniek is dus geschikt voor studies op het niveau van één cel die kunnen worden geëxtrapoleerd en verder kunnen worden onderzocht op een hoger organisatieniveau (d.w.z. in weefselplakken of bij een levend dier). Celkweek als techniek heeft echter een paar kanttekeningen. Het is het meest cruciaal om...

Celkweektechnieken hebben geleid tot tal van vooruitgang op verschillende gebieden van cellulaire neurofysiologie in gezondheid en ziekte. Met name primaire celculturen, vers geïsoleerd uit het neuronale weefsel van een proefdier, stellen de experimentator in staat om het gedrag van diverse cellen in verschillende biochemische media en fysiologische opstellingen nauwkeurig te bestuderen. Het gebruik van verschillende fluorescerende fysiologische indicatoren zoals de Ca2+-gevoelige kleurstoffen in combinatie met time-lapse videomicroscopie geeft in real time beter inzicht in de cellulaire biofysische en biochemische processen.
ALS is een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die de bovenste en onderste motorneuronenaantast 1. De ziekte heeft een complexe pathogenese van het familiale type, maar meestal van de sporadische vorm (90% van de gevallen)2. Het is bekend dat niet-cel autonome mechanismen bijdragen aan de PATHOFYSIOLOGIE VAN ALS, voornamelijk vanwege de essentiële rol van gliacellen3. ALS wordt ook goed gekarakteriseerd als een neuro-inflammatoire ziekte met betrokkenheid van humorale en cellulaire ontstekingsfactoren.
Immunoglobuline G wordt veel gebruikt als moleculaire marker bij ALS en andere neurodegeneratieve ziekten. Het bestuderen van het serumniveau van deze marker kan wijzen op de aanwezigheid en het stadium van neuro-inflammatie bij de ziekte 4,5,6, terwijl de aanwezigheid ervan in het hersenvocht kan wijzen op een doorbraak van de bloed-hersenbarrière7. IKG's werden ook geïdentificeerd als afzettingen in de motorneuronen van het ruggenmerg van ALS-patiënten7. Niettemin heeft deze benadering enkele inconsistenties aangetoond in de correlatie van het niveau van IgG's met het stadium en de kenmerken van de ziekte6.
IgG geïsoleerd uit de sera van ALS-patiënten (ALS IgG) kan een calciumrespons induceren in naïeve astrocyten8 en glutamaatafgifte in neuronen, wat wijst op een excitotoxisch effect - een kenmerk van ALS-pathologie9. Studies naar het hSOD1G93A ALS-rattenmodel (met meerdere kopieën van de menselijke SOD1-mutatie10) toonden echter een aantal markers van oxidatieve stress in gekweekte neurogliale cellen11, weefsels 12,13,14 of levende dieren 13. Het is opmerkelijk dat de astrocyten gekweekt uit het ALS-rattenmodel meer vatbaar waren voor oxidatieve stress veroorzaakt door peroxide dan de astroglia van niet-transgene nestgenoten11.
Microgliale cellen in cultuur worden op een minder duidelijke manier beïnvloed door ALS IgG. Een BV-2 microgliale cellijn vertoonde namelijk een stijging van het signaal van fluorescerende markers van oxidatieve stress als reactie op de toepassing van slechts 4/11 ALS IgG-patiëntenmonsters15. Het is bekend dat microglia deelnemen aan vele neuro-inflammatoire pathologieën, wat bijdraagt aan oxidatieve stress en late progressiefase in het niet-cel autonome mechanisme van ALS 16,17. Niettemin gaven de gegevens met ALS IgG's aan dat deze cellen mogelijk niet zo reactief zijn als astrocyten op deze humorale factoren van ALS-ontsteking. Er zijn verschillende studies uitgevoerd met primaire astrocyten van ALS-muizenmodellen, niet alleen bij pups maar ook bij symptomatische dieren, hetzij op de hersenen of op het ruggenmerg 18,19,20,21. Dit geldt ook voor microgliale primaire culturen, hoewel in mindere mate dan astrocyten en meestal uit hersengebieden in het embryonale stadium 22,23,24.
We gebruiken time-lapse video beeldvorming van Ca2+ op cellen in cultuur voornamelijk als een middel om intracellulaire transiënten van dit ion te volgen als een fysiologische marker van excitotoxiciteit. Dus door biofysische karakterisering van deze transiënten (amplitude, gebied onder transiënt, rise-time, frequentie) kan de onderzoeker experimentele diagnostische parameters verkrijgen uit verschillende cellulaire modellen van neurodegeneratie. Deze techniek biedt dus een voordeel van een kwantitatieve fysiologische beoordeling van IKG's als ziektebiomarkers. Er is een grote hoeveelheid literatuur over de rol van IgG's en Ca2+ bij de inductie van ALS. De meeste van deze studies werden uitgevoerd door ALS te induceren door patiënt IgG's in proefdierente injecteren 25,26,27,28,29, die vervolgens intracellulaire Ca2+ verhoging en IgG-afzettingen vertoonden. Een reeks studies onderzocht het effect van ALS IKG's op de motorische synaps in vitro 30,31,32. In de bovenstaande context legt de hier gepresenteerde techniek de focus op de gliacellen als belangrijke spelers in het niet-cel autonome mechanisme van ALS en kwantificeert hun potentiële excitotoxische reactie op IgG's als humorale factoren van neuro-inflammatie. Deze aanpak kan een bredere toepassing hebben bij het testen van andere humorale factoren zoals hele sera, CSF of cytokines in verschillende celkweeksystemen en in cellulaire modellen van algemene ontsteking.
Dit artikel beschrijft hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen verder kunnen worden gebruikt om ALS-pathofysiologie te bestuderen met van sera afgeleide IgG van patiënten. Protocollen zijn gedetailleerd voor het laden van kleurstof van gekweekte cellen (figuur 1) en de opnames van Ca2+ veranderingen in time-lapse videobeeldvormingsexperimenten. Voorbeelden van video-opnames zullen laten zien hoe gliacellen reageren op ALS IgG in vergelijking met ATP, waarbij de laatste purinerge membraanreceptoren activeert. Voor het eerst wordt een voorbeeld getoond over hoe astrocyten geïsoleerd uit de hSOD1G93A ALS-rattenhersenen reageren met een meer uitgesproken Ca2+ respons op ALS IgG in vergelijking met niet-transgene controles en hoe dit proces te relateren aan de verschillen in Ca2+ winkelwerking. Ook is een voorbeeld getoond van calciumbeeldvorming in microgliale cellen die acuut worden uitgedaagd met ALS IgG, met slechts een bescheiden respons van intracellulair calcium.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

Dit protocol laat zien hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose (ALS) in het rat hSOD1G93A-model . Ten eerste laat het protocol zien hoe astrocyten en microglia uit postnatale rattencorticosterces kunnen worden geïsoleerd en gekweekt, en vervolgens hoe deze culturen kunnen worden gekarakteriseerd en getest op zuiverheid door immunocytochemie met behulp van de gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) marker van astrocyten en de geïoniseerde calciumbindende adaptermolecuul 1 (Iba1) microgliale marker. In de volgende fase worden methoden beschreven voor het laden van kleurstoffen (calciumgevoelige Fluo 4-AM) van gekweekte cellen en de opnames van Ca2+ veranderingen in videobeeldexperimenten op levende cellen.
De voorbeelden van video-opnames bestaan uit: (1) gevallen van Ca2+ beeldvorming van gekweekte astrocyten die acuut zijn blootgesteld aan immunoglobuline G (IgG) geïsoleerd van ALS-patiënten, met een karakteristieke en specifieke respons in vergelijking met de respons op ATP zoals aangetoond in hetzelfde experiment. Voorbeelden tonen ook een meer uitgesproken voorbijgaande stijging van de intracellulaire calciumconcentratie opgewekt door ALS IgG in hSOD1G93A astrocyten in vergelijking met niet-transgene controles; (2) Ca2+ beeldvorming van gekweekte astrocyten tijdens een uitputting van calciumvoorraden door thapsigargin (Thg), een niet-competitieve remmer van het endoplasmatisch reticulum Ca2+ ATPase, gevolgd door opgeslagen calciuminvoer opgewekt door de toevoeging van calcium in de opnameoplossing, wat het verschil aantoont tussen Ca2+ winkelwerking in hSOD1G93A en in niet-transgene astrocyten; (3) Ca2+ beeldvorming van de gekweekte microglia die voornamelijk een gebrek aan respons op ALS IgG laat zien, terwijl ATP-toepassing een Ca2+ verandering veroorzaakte. Dit artikel benadrukt ook mogelijke kanttekeningen en waarschuwingen met betrekking tot kritische celdichtheid en zuiverheid van culturen, waarbij de juiste concentratie van de Ca2 + kleurstof- en kleurstoflaadtechnieken wordt gekozen.

Karakterisering van verschillende gliaceltypen in cultuur Het duurt meestal 15-21 dagen om astrocyten te produceren voor experimenten, terwijl microgliale cellen 10-15 dagen nodig hebben om te groeien. Immunostaining werd uitgevoerd om de celzuiverheid van de kweek te beoordelen. Figuur 1 toont de expressie van dubbele labeling van de astrocytische marker GFAP en de microgliale marker Iba1 in respectievelijke culturen.
Van calciumbeeldvorming i...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

We presenteren hier een protocol over het voorbereiden van primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia uit rattencorticosterces voor time-lapse videobeeldvorming van intracellulaire Ca2+ voor onderzoek naar pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose in het hSOD1G93A-rattenmodel .

Primaire culturen van rat astrocyten en microglia en hun gebruik in de studie van amyotrofische laterale sclerose

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Dit protocol maakt het mogelijk om intercellulair calciumsignaleringspatroon te onthullen dat de reactie van elk celtype in gezondheid en ziekte karakteriseert. Deze techniek maakt een snelle en gedetailleerde biofysische karakterisering van complex cellulair gedrag mogelijk. We zijn van plan om deze IgG-geïnduceerde calciumsignalering te gebruiken als vingerafdruk voor gepersonaliseerde geneeskunde van neuro-inflammatoire ziekten.In het echte leven is het niet gemakkelijk om alle processen en gebeurtenissen te zien en te volgen, vooral die onder de microscoop. Daarom zijn de visuele gegevens belangrijk. Na het onthoofden van een tot drie dagen oude pups, legt u de schedel bloot door de huid open te snijden met een kleine schuine schaar.Open vervolgens de schedel door het foramen magnum naar de banen te snijden en maak een loodrechte middellijnsnede. Verwijder de hersenen uit de schedel en plaats deze in een petrischaal met PBS. Gebruik de punt van de tang om de verbindingen tussen beide hemisferen te scheuren en scheid de hemisferen met een gebogen tang door zachtjes een halve bol van het midden naar de zijkant te duwen.Gebruik een rechte en gebogen tang om de hersenvliezen te verwijderen door ze voorzichtig te scheuren. Verwijder vervolgens de hippocampus door deze met een gebogen tang te knijpen en weg te gooien of te gebruiken voor een ander celkweekpreparaat. Breng vervolgens de cortex over in een buis van 15 milliliter met drie milliliter koude PBS en homogeniseer het weefsel door 10 tot 15 keer op en neer te pipetteren met een punt van één milliliter.Centrifugeer de cellen op 500 g gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in drie milliliter koude PBS door te pipetteren met een punt van één milliliter. Centrifugeer nogmaals en resuspendeer de pellet in twee milliliter complete DMEM aangevuld met 10% FBS en antibiotica.Nadat u het homogenaat in een buis van twee milliliter hebt overgebracht, passeert u het homogenaat door naalden van 21 en 23 gauge om een suspensie van enkele cellen te maken. Giet de celsuspensie bereid vanuit één cortex in een petrischaaltje van 60 millimeter met drie milliliter volledige DMEM en schud de petrischaal lichtjes, zodat de suspensie gelijkmatig wordt verdeeld. Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide en 95% lucht bij 37 graden Celsius.Om de groei van astrocyten te bevorderen, verwijdert u de oude media en wast u de cel met voorverwarmde PBS om de losjes gehechte gliacellen en sporen van FBS te verwijderen zodra ze 70 tot 80% samenvloeiing bereiken. Trypsinize vervolgens de onderliggende laag astrocyten door één milliliter voorverwarmde trypsine-oplossing toe te voegen en gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius te incuberen. Gebruik een microscoop om te controleren of de cellen beginnen los te komen en voeg vier milliliter volledige DMEM toe.Verzamel de celsuspensie en breng deze over naar een buis van 15 milliliter. Centrifugeer vervolgens de buis op 500 g gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in één milliliter volledig medium.Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Bereid vervolgens het cultuurgerecht en voeg cultuurmedium toe. Plaats de cellen opnieuw met een dichtheid van 10 tot de vierde cellen per vierkante centimeter in vijf milliliter verse volledige DMEM en was de cellen met volledige DMEM voordat elke media vervangt.Na het bereiken van 70 tot 80% confluentie, herhaal trypsinisatie en zaad vijf keer 10 tot de derde astrocyten op een zeven millimeter poly-L-lysine-gecoate cirkelvormige glazen afdekslip. Laat ze 10 minuten hechten en voeg volledige DMEM toe. Gebruik ze in experimenten na 48 uur.Na het bereiden van de microgliale culturen, om microglia te bevorderen, laten de gliacellen confluent worden en verschijnen de microglia na 10 tot 15 dagen bovenop de astrocytenlaag. Schud de petrischaal op een orbitale shaker gedurende twee uur bij 220 RPM. Was nu de losgemaakte en losjes bevestigde cellen lichtjes door het supernatant aan te zuigen met een pipetpunt van één milliliter.Doseer het supernatant meerdere keren voorzichtig op de cellaag en zorg ervoor dat het hele oppervlak van de cellaag tijdens deze wasstap wordt bedekt. Verzamel het medium met de losgemaakte cellen en breng het over naar een buis van 15 milliliter. Centrifugeer, resuspendeer en tel de cellen zoals eerder aangetoond.Zaai vijf keer 10 tot de derde microglia op een zeven millimeter poly-L-lysine-gecoate ronde glazen afdekslip. Laat ze 10 minuten hechten en voeg volledige DMEM toe. Gebruik ze in experimenten na 48 uur.Om de volledige DMEM uit te wassen, brengt u één afdekslip over op een schaal met extracellulaire oplossing. Bereid de kleurstofbelastingsoplossing door één millimol Fluo-4 AM te verdunnen met extracellulaire oplossing om de uiteindelijke concentratie van vijf micromolair te bereiken. Plaats de afdekslip met cellen in de kleurstoflaadoplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker en was de cellen gedurende 20 minuten in extracellulaire oplossing.Plaats de afdeksel in de opnamekamer met één milliliter werkoplossing. Kies het gezichtsveld met een consistent aantal cellen in het hele experiment. Start de beeldvorming en bepaal de basislijn door het basale niveau van fluorescentie gedurende drie tot vijf minuten te verkrijgen.Stop vervolgens de stroom van de werkoplossing en schakel over naar de testoplossing voor de gewenste tijdsduur. Was de cellen tussen elke testoplossing met een constante stroom van de werkoplossing gedurende drie tot vijf minuten. Houd het oplossingsvolume in de opnamekamer op één milliliter door een constante zuigkracht van de bovenkant van de oplossing te regelen.Kies het frame met de hoogste signaalintensiteit en omcirkel één cel met de gereedschapstoepassing Veelhoekig. Nadat u alle cellen in het verkregen veld hebt omcirkeld, kiest u vijf interessante gebieden op de achtergrond met het gereedschap Cirkel. Meet vervolgens de gemiddelde signaalintensiteit van een enkele cel en de achtergrond voor elk tijdsbestek.Selecteer alle interessante regio's en gebruik de opdracht Multi-Measure in ROI Manager in ImageJ of een gelijkwaardige opdracht in commerciële software. Na het importeren van de gegevens in MATLAB-software, gemiddeld vijf achtergrond-ROI's en de gemiddelde achtergrond van elk frame aftrekken van de gemiddelde ROI-intensiteit van de frames die tegelijkertijd zijn verkregen. Analyseer later de calciumactiviteit door de amplitude van de calciumpiek te bepalen, de geïntegreerde verandering van de calciumtransiënt, de tijd tot piek, de stijgtijd, de halve breedte en de frequentie.GFAP wordt gebruikt om astrocyten te visualiseren en Iba1 om microglia te visualiseren. hSOD1G93A astrocyten reageren op ALS immunoglobuline G met een grotere amplitude van de calciumtransiënt, een grotere algehele geïntegreerde verandering en een kortere tijd om te pieken dan niet-transgene astrocyten. De respons op ALS immunoglobuline G is te onderscheiden van de respons op ATP.hSOD1G93A astrocyten hadden een hoger niveau van calciumionen in de winkels, zoals onthuld door uitputting van de opslag, wat wijst op een overbelasting van dit ion. Microglia werden gekweekt en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit werd in de loop van de tijd geëxtraheerd. De calciumsporen van drie cellen gaven aan dat slechts één cel reageerde op ALS-immunoglobuline G, terwijl alle cellen reageerden op ATP.De pseudo-kleurenbeelden vertegenwoordigden de fluorescentie-intensiteit en baseline als reactie op ALS, IgG en ATP. De cellen moeten adequaat worden geladen en de parameters van het beeldvormingssysteem moeten op de juiste manier worden aangepast, zodat het signaal tijdens het experiment niet wordt gescheiden. Samen met calciumuitstotend kan patchklem worden uitgevoerd.Zo kan een completer beeld worden verkregen van de correlatie tussen verschillende membraanionstromen en calciumuitstotende. Het begrip van intracellulaire calciumhomeostase is van essentieel belang voor de verkenning van verschillende reacties op natuurlijke en stressvolle en externe stimuli.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Het gebruik van Trace Eyeblink klassieke conditionering te beoordelen Hippocampal dysfunctie in een Rat Model van Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cel-gebaseerde Assay te bestuderen van antilichaam-gemedieerde Tau goedkeuring door Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Gebruik van capillaire elektrofoforese immunoassay om te zoeken naar potentiële biomarkers van amyotrofische laterale sclerose in menselijke bloedplaatjes

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Gebruik van primaire gekweekte hippocampale neuronen om de assemblage van axon-initiële segmenten te bestuderen

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluatie van motorische stoornissen in C. elegans-modellen van amyotrofische laterale sclerose

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...