Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und technologische Entwicklung Republik Serbien Vertrag Nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, dem FENS - NENS Education and Training Cluster-Projekt "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" und dem EC H2020 MSCA RISE Grant #778405 unterstützt. Wir danken Marija Adžić und Mina Perić für die Bereitstellung der immunhistochemischen Bilder und Danijela Bataveljić für die Hilfe beim Schreiben von Papieren.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den EU-Richtlinien zum Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke und mit Genehmigung der Ethikkommission der Fakultät für Biologie der Universität Belgrad (Zulassungsnummer EK-BF-2016/08) durchgeführt. Das Patientenmaterial (Seren für IgGs) wurde für die routinemäßige klinische Untersuchung mit informierter Zustimmung des Patienten gemäß dem Ethikkodex des Weltärztebundes (Deklaration von Helsinki) für Experimente am Menschen gesammelt. Das Protokoll wurde...

In diesem Artikel wird die Methode der primären Zellkultivierung als schnelles und "budgetgerechtes" Werkzeug zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Zell(patho)physiologie wie ALS im hSOD1G93A-Modell der Ratte vorgestellt. Die Technik eignet sich daher für Studien auf Einzelzellebene, die auf einer höheren Organisationsebene (d.h. in Gewebeschnitten oder in einem lebenden Tier) extrapoliert und weiter untersucht werden können. Die Zellkultivierung als Technik hat jedoch einige Vorbehalte. Es ist am wic...

Zellkulturtechniken haben zu zahlreichen Fortschritten in verschiedenen Bereichen der zellulären Neurophysiologie in Gesundheit und Krankheit geführt. Insbesondere primäre Zellkulturen, frisch isoliert aus dem neuronalen Gewebe eines Labortieres, ermöglichen es dem Experimentator, das Verhalten verschiedener Zellen in verschiedenen biochemischen Medien und physiologischen Setups genau zu untersuchen. Die Verwendung verschiedener fluoreszierender physiologischer Indikatoren wie der Ca2+-sensitiven Farbstoffe in Kombination mit der Zeitraffer-Videomikroskopie ermöglicht einen besseren Einblick in die zellulären biophysikalischen und biochemischen Prozesse in Echtzeit.
ALS ist eine verheerende neurodegenerative Erkrankung, die obere und untere Motoneuronen betrifft1. Die Krankheit hat eine komplexe Pathogenese des familiären Typs, aber meist der sporadischen Form (90% der Fälle)2. Es ist bekannt, dass nicht-zellautonome Mechanismen zur ALS-Pathophysiologie beitragen, vor allem aufgrund der essentiellen Rolle von Gliazellen3. ALS ist auch gut als neuroinflammatorische Erkrankung mit Beteiligung von humoralen und zellulären Faktoren der Entzündung charakterisiert.
Immunglobulin G wird häufig als molekularer Marker bei ALS und anderen neurodegenerativen Erkrankungen verwendet. Die Untersuchung des Serumspiegels dieses Markers kann auf das Vorhandensein und Stadium der Neuroinflammation bei der Krankheit 4,5,6 hinweisen, während seine Anwesenheit in der Zerebrospinalflüssigkeit auf eine Verletzung der Blut-Hirn-Schranke 7 hinweisen kann. IgGs wurden auch als Ablagerungen in den Rückenmarks-Motoneuronen von ALS-Patienten identifiziert7. Dennoch hat dieser Ansatz einige Inkonsistenzen in der Korrelation des IgG-Spiegels mit dem Stadium und den Merkmalen der Krankheit gezeigt6.
Aus den Seren von ALS-Patienten isoliertes IgG (ALS-IgG) kann eine Kalziumreaktion in naiven Astrozyten8 und eine Glutamatfreisetzung in Neuronen induzieren, was auf eine exzitotoxische Wirkung hinweist - ein Kennzeichen der ALS-Pathologie9. Studien am HSOD1G93A ALS-Rattenmodell (das mehrere Kopien der menschlichen SOD1-Mutation10 enthielt) zeigten jedoch eine Reihe von Markern für oxidativen Stress in kultivierten Neurogliazellen11, Geweben 12,13,14 oder lebenden Tieren 13. Es ist bemerkenswert, dass die aus dem ALS-Rattenmodell gezüchteten Astrozyten anfälliger für oxidativen Stress waren, der durch Peroxid induziert wurde, als die Astroglia aus nicht-transgenen Wurfgeschwistern11.
Mikrogliazellen in Kultur sind weniger offensichtlich von ALS-IgG betroffen. Eine BV-2-Mikrogliazelllinie zeigte nämlich einen Anstieg des Signals von fluoreszierenden Markern für oxidativen Stress als Reaktion auf die Anwendung von nur 4/11 ALS-IgG-Patientenproben15. Es ist bekannt, dass Mikroglia an vielen neuroinflammatorischen Pathologien beteiligt sind, was zu oxidativem Stress und der späten Progressionsphase im nicht-zellautonomen Mechanismus von ALS16,17 beiträgt. Dennoch zeigten die Daten mit ALS-IgGs, dass diese Zellen möglicherweise nicht so reaktiv sind wie Astrozyten auf diese humoralen Faktoren der ALS-Entzündung. Mehrere Studien wurden mit primären Astrozyten aus ALS-Mausmodellen durchgeführt, nicht nur bei Welpen, sondern auch bei symptomatischen Tieren, entweder am Gehirn oder am Rückenmark 18,19,20,21. Dies gilt auch für mikrogliale Primärkulturen, wenn auch in geringerem Maße als Astrozyten und meist aus Hirnregionen im embryonalen Stadium22,23,24.
Wir verwenden Zeitraffer-Videoaufnahmen von Ca2+ auf Zellen in Kultur hauptsächlich als Mittel, um intrazelluläre Transienten dieses Ions als physiologischen Marker für Exzitotoxizität zu verfolgen. So kann der Forscher durch biophysikalische Charakterisierung dieser Transienten (Amplitude, Fläche unter Transienten, Anstiegszeit, Frequenz) experimentelle diagnostische Parameter aus verschiedenen zellulären Modellen der Neurodegeneration erhalten. Diese Technik bietet somit den Vorteil einer quantitativen physiologischen Bewertung von IgGs als Krankheitsbiomarker. Es gibt eine große Menge an Literatur über die Rolle von IgGs und Ca2+ bei der Induktion von ALS. Die meisten dieser Studien wurden durchgeführt, indem ALS induziert wurde, indem Patienten-IgGs in Versuchstiere injiziert wurden 25,26,27,28,29, die dann intrazelluläre Ca 2+-Erhöhung und IgG-Ablagerungen zeigten. Eine Reihe von Studien untersuchte die Wirkung von ALS-IgGs auf die motorische Synapse in vitro30,31,32. Im obigen Kontext legt die hier vorgestellte Technik den Fokus auf die Gliazellen als wichtige Akteure im nicht-zellautonomen Mechanismus der ALS und quantifiziert ihre mögliche exzitotoxische Reaktion auf IgGs als humorale Faktoren der Neuroinflammation. Dieser Ansatz kann eine breitere Anwendung beim Testen anderer humoraler Faktoren wie ganze Seren, Liquor oder Zytokine in verschiedenen Zellkultursystemen und in zellulären Modellen allgemeiner Entzündungen haben.
Dieser Artikel beschreibt, wie Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus den Kortices von Sprague Dawley-Ratten hergestellt werden können und wie diese Zellen weiter verwendet werden können, um die ALS-Pathophysiologie mit Patienten-Seren-abgeleitetem IgG zu untersuchen. Protokolle sind detailliert für die Farbstoffbeladung von kultivierten Zellen (Abbildung 1) und die Aufzeichnungen von Ca2+ Änderungen in Zeitraffer-Video-Imaging-Experimenten. Beispiele für Videoaufnahmen zeigen, wie Gliazellen auf ALS-IgG im Vergleich zu ATP reagieren, wobei letzteres purinerge Membranrezeptoren aktiviert. Zum ersten Mal wird ein Beispiel gezeigt, wie aus dem HSOD1G93A ALS-Rattengehirn isolierte Astrozyten im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollen mit einer ausgeprägteren Ca 2+-Reaktion auf ALS-IgG reagieren und wie dieser Prozess mit den Unterschieden im Ca2+-Speicherbetrieb in Beziehung gesetzt werden kann. Ebenfalls gezeigt wird ein Beispiel für die Kalziumbildgebung in Mikrogliazellen, die akut mit ALS IgG herausgefordert wurden, mit nur einer bescheidenen Reaktion von intrazellulärem Kalzium.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

Dieses Protokoll zeigt, wie Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus den Kortices von Sprague Dawley-Ratten hergestellt werden und wie diese Zellen zur Untersuchung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) im hSOD1G93A-Modell der Ratte verwendet werden können. Zuerst zeigt das Protokoll, wie Astrozyten und Mikroglia aus postnatalen Rattenkortikern isoliert und kultiviert werden, und dann, wie diese Kulturen durch Immunzytochemie unter Verwendung des Gliafibrillär-sauren Proteins (GFAP) -Markers von Astrozyten und des ionisierten Calcium-bindenden Adaptermoleküls 1 (Iba1) Mikrogliamarkers charakterisiert und getestet werden. Im nächsten Schritt werden Methoden zur Farbstoffbeladung (calciumsensitives Fluo 4-AM) von kultivierten Zellen und die Aufzeichnung von Ca2+ Veränderungen in Videobildgebungsexperimenten an lebenden Zellen beschrieben.
Die Beispiele für Videoaufnahmen bestehen aus: (1) Fällen von Ca2+-Bildgebung von kultivierten Astrozyten, die akut Immunglobulin G (IgG) ausgesetzt waren, das von ALS-Patienten isoliert wurde und eine charakteristische und spezifische Reaktion im Vergleich zur Reaktion auf ATP zeigte, wie im selben Experiment gezeigt. Beispiele zeigen auch einen ausgeprägteren vorübergehenden Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration, hervorgerufen durch ALS-IgG in hSOD1G93A-Astrozyten im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollen; (2) Ca 2+ Bildgebung von kultivierten Astrozyten während einer Erschöpfung der Calciumspeicher durch Thapsigargin (Thg), einem nicht-kompetitiven Inhibitor des endoplasmatischen Retikulums Ca 2+ ATPase, gefolgt von einem speicherbetriebenen Calciumeintritt, der durch die Zugabe von Calcium in der Aufnahmelösung hervorgerufen wird, was den Unterschied zwischen dem Ca 2+-Speicherbetrieb in hSOD1G93A und in nicht-transgenen Astrozyten zeigt; (3) Ca 2+-Bildgebung der kultivierten Mikroglia zeigte überwiegend eine mangelnde Reaktion auf ALS-IgG, während die ATP-Anwendung eine Ca2+-Veränderung hervorrief. Dieses Papier betont auch mögliche Vorbehalte und Vorsichtsmaßnahmen in Bezug auf kritische Zelldichte und Reinheit von Kulturen, indem die richtige Konzentration des Ca2+ Farbstoffs und der Farbstoffladetechniken gewählt wird.

Charakterisierung verschiedener Gliazelltypen in Kultur Es dauert normalerweise 15-21 Tage, um Astrozyten für Experimente zu produzieren, während Mikrogliazellen 10-15 Tage brauchen, um zu wachsen. Eine Immunfärbung wurde durchgeführt, um die Zellreinheit der Kultur zu beurteilen. Abbildung 1 zeigt die Expression der Doppelmarkierung des astrozytären Markers GFAP und des Mikrogliamarkers Iba1 in jeweiligen Kulturen.
Es ist bekannt, dass di...

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Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Wir präsentieren hier ein Protokoll zur Vorbereitung von Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus Rattenkortices für die Zeitraffer-Videobildgebung von intrazellulärem Ca2+ für die Erforschung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose im hSOD1G93A-Rattenmodell .

Primärkulturen von Rattenastrozyten und Mikroglia und ihre Verwendung bei der Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, interzelluläre Kalziumsignalmuster aufzudecken, die jede Zelltypreaktion sowohl in der Gesundheit als auch in der Krankheit charakterisieren. Diese Technik ermöglicht eine schnelle und detaillierte biophysikalische Charakterisierung des komplexen zellulären Verhaltens. Wir planen, diese IgG-induzierte Kalziumsignalisierung als Fingerabdruck für die personalisierte Medizin neuroinflammatorischer Erkrankungen zu nutzen.Im wirklichen Leben ist es nicht einfach, alle Prozesse und Ereignisse zu sehen und zu verfolgen, insbesondere diejenigen, die unter dem Mikroskop ablaufen. Daher sind die visuellen Daten wichtig. Nachdem Sie ein bis drei Tage alte Welpen enthauptet haben, legen Sie den Schädel frei, indem Sie die Haut mit einer kleinen Winkelschere aufschneiden.Öffnen Sie dann den Schädel, indem Sie das Foramen magnum in Richtung der Augenhöhlen schneiden und einen senkrechten Mittellinienschnitt machen. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und legen Sie es in eine Petrischale mit PBS. Verwenden Sie die Spitze der Pinzette, um die Verbindungen zwischen beiden Hemisphären zu reißen, und trennen Sie die Hemisphären mit gebogenen Pinzetten, indem Sie eine Halbkugel vorsichtig von der Mitte zur Seite drücken.Verwenden Sie gerade und gebogene Pinzetten, um die Hirnhäute zu entfernen, indem Sie sie vorsichtig zerreißen. Entfernen Sie dann den Hippocampus, indem Sie ihn mit einer gekrümmten Pinzette einklemmen und verwerfen oder für eine andere Zellkulturzubereitung verwenden. Als nächstes übertragen Sie den Kortex in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das drei Milliliter kaltes PBS enthält, und homogenisieren das Gewebe, indem Sie 10 bis 15 Mal mit einer Ein-Milliliter-Spitze auf und ab pipettieren.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 g für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter kaltem PBS, indem Sie mit einer Ein-Milliliter-Spitze pipettieren. Zentrifugieren Sie noch einmal und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter komplettem DMEM, ergänzt mit 10% FBS und Antibiotika.Nach dem Transfer des Homogenats in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen wird das Homogenat durch 21- und 23-Gauge-Nadeln geleitet, um eine Suspension aus einzelnen Zellen herzustellen. Gießen Sie die aus einem Kortex hergestellte Zellsuspension in eine 60-Millimeter-Petrischale mit drei Milliliter vollständigem DMEM und schütteln Sie die Petrischale leicht, so dass die Suspension gleichmäßig verteilt ist. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid und 95% Luft bei 37 Grad Celsius.Um das Wachstum von Astrozyten zu fördern, entfernen Sie die alten Medien und waschen Sie die Zelle mit vorgewärmtem PBS, um die lose anhaftenden Gliazellen und Spuren von FBS zu entfernen, sobald sie 70 bis 80% Konfluenz erreicht haben. Dann trypsinisieren Sie die darunter liegende Schicht von Astrozyten, indem Sie einen Milliliter vorgewärmter Trypsinlösung hinzufügen und bei 37 Grad Celsius für zwei bis fünf Minuten inkubieren. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu überprüfen, ob sich die Zellen zu lösen beginnen, und fügen Sie vier Milliliter vollständiges DMEM hinzu.Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 g für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter des vollständigen Mediums.Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Als nächstes bereiten Sie die Kulturschale vor und fügen Sie ein Kulturmedium hinzu. Replaten Sie die Zellen bei einer Dichte von 10 bis vier Zellen pro Quadratzentimeter in fünf Milliliter frischem komplettem DMEM und waschen Sie die Zellen vor jedem Medienwechsel mit vollständigem DMEM.Nach Erreichen einer Konfluenz von 70 bis 80% die Trypsinisierung wiederholen und fünf mal 10 bis zum dritten Astrozyten auf einem sieben Millimeter dicken, mit Poly-L-Lysin beschichteten kreisförmigen Glasdeckstreifen säen. Lassen Sie sie 10 Minuten lang anbringen und fügen Sie das vollständige DMEM hinzu. Verwenden Sie sie nach 48 Stunden in Experimenten.Nach der Vorbereitung der Mikrogliakulturen, um Mikroglia zu fördern, lassen Sie die Gliazellen konfluieren, und die Mikroglia erscheinen nach 10 bis 15 Tagen auf der Astrozytenschicht. Schütteln Sie die Petrischale auf einem Orbitalschüttler zwei Stunden lang bei 220 U/min. Waschen Sie nun die abgelösten und lose befestigten Zellen leicht, indem Sie den Überstand mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze absaugen.Verteilen Sie den Überstand mehrmals vorsichtig auf die Zellschicht und stellen Sie sicher, dass die gesamte Zellschichtoberfläche während dieses Waschschritts bedeckt ist. Sammeln Sie das Medium mit den abgelösten Zellen und übertragen Sie es in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren, resuspendieren und zählen Sie die Zellen, wie zuvor gezeigt.Säen Sie fünf mal 10 bis zum dritten Mikroglia auf einem sieben Millimeter dicken, mit Poly-L-Lysin beschichteten kreisförmigen Glasdecker. Lassen Sie sie für 10 Minuten anbringen und fügen Sie vollständiges DMEM hinzu. Verwenden Sie sie nach 48 Stunden in Experimenten.Um das komplette DMEM auszuwaschen, geben Sie einen Bezugsbeleg in eine Schale mit extrazellulärer Lösung. Die Farbstoffbeladungslösung wird durch Verdünnen eines Millimolaren Fluo-4 AM mit extrazellulärer Lösung hergestellt, um die Endkonzentration von fünf Mikromolaren zu erreichen. Legen Sie den Deckkörper mit den Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln in die Farbstoffladelösung und waschen Sie die Zellen 20 Minuten in extrazellulärer Lösung.Legen Sie den Abdeckbeleg mit einem Milliliter Arbeitslösung in die Aufnahmekammer. Wählen Sie das Sichtfeld mit einer konsistenten Anzahl von Zellen während des gesamten Experiments. Beginnen Sie die Bildgebung und bestimmen Sie den Ausgangswert, indem Sie den basalen Fluoreszenzspiegel für drei bis fünf Minuten erfassen.Stoppen Sie dann den Fluss der Arbeitslösung und wechseln Sie für die gewünschte Zeit zur Testlösung. Zwischen jeder Testlösung werden die Zellen drei bis fünf Minuten lang mit einem konstanten Fluss der Arbeitslösung gewaschen. Halten Sie das Lösungsvolumen in der Aufnahmekammer bei einem Milliliter, indem Sie einen konstanten Sog von der Oberseite der Lösung veranlassen.Wählen Sie den Frame mit der höchsten Signalintensität und umgeben Sie eine Zelle mit der Polygonal-Werkzeuganwendung. Nachdem Sie alle Zellen im erfassten Feld eingeschlossen haben, wählen Sie mit dem Kreiswerkzeug fünf interessante Bereiche im Hintergrund aus. Messen Sie dann die mittlere Signalintensität einer einzelnen Zelle und den Hintergrund für jeden Zeitrahmen.Wählen Sie alle gewünschten Regionen aus und verwenden Sie den Befehl Multi-Measure im ROI-Manager in ImageJ oder einen gleichwertigen Befehl in kommerzieller Software. Nach dem Import der Daten in die MATLAB-Software ermitteln Sie durchschnittlich fünf Hintergrund-ROIs und subtrahieren den gemittelten Hintergrund jedes Frames von der mittleren ROI-Intensität der gleichzeitig erfassten Frames. Analysieren Sie später die Kalziumaktivität, indem Sie die Amplitude des Kalziumpeaks, die integrierte Änderung des Kalziumtransienten, die Zeit bis zum Peak, die Anstiegszeit, die halbe Breite und die Frequenz bestimmen.GFAP wird verwendet, um Astrozyten sichtbar zu machen, und Iba1, um Mikroglia sichtbar zu machen. hSOD1G93A-Astrozyten reagieren auf ALS-Immunglobulin G mit einer größeren Amplitude des Kalziumtransienten, einer insgesamt stärkeren integrierten Veränderung und einer kürzeren Zeit bis zum Höhepunkt als nicht-transgene Astrozyten. Die Reaktion auf ALS-Immunglobulin G unterscheidet sich von der Reaktion auf ATP.hSOD1G93A-Astrozyten wiesen einen höheren Gehalt an Kalziumionen in den Speichern auf, was auf eine Überlastung dieses Ions hindeutet. Mikroglia wurden kultiviert, und die mittlere Fluoreszenzintensität wurde im Laufe der Zeit extrahiert. Die Kalziumspuren von drei Zellen zeigten, dass nur eine Zelle auf ALS-Immunglobulin G reagierte, während alle Zellen auf ATP reagierten.Die Pseudofarbbilder stellten die Fluoreszenzintensität und Basislinie als Reaktion auf ALS, IgG und ATP dar. Die Zellen müssen ausreichend belastet und die Parameter des Bildgebungssystems entsprechend angepasst werden, damit das Signal während des Experiments nicht getrennt wird. Zusammen mit der Kalziumemittierung kann eine Patch-Klemmung durchgeführt werden.So kann ein vollständigeres Bild der Korrelation zwischen verschiedenen Membranionenströmen und Calcium-emittierenden Strömen gewonnen werden. Das Verständnis der intrazellulären Kalziumhomöostase ist von essentieller Bedeutung für die Erforschung verschiedener Reaktionen auf natürliche sowie auf stressige und äußere Reize.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung hippocampale Funktionsstörung in einem Rattenmodell der Fetal Alcohol Spectrum Disorders bewerten

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Zellbasierte Assays, Antikörper-vermittelten Tau Clearance von Mikroglia zu studieren

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Verwendung von Kapillarelektrophorese Immunoassay zur Suche nach potenziellen Biomarkern der Amyotrophen Lateralsklerose in menschlichen Thrombozyten

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Verwendung von primär kultivierten Hippocampus-Neuronen zur Untersuchung der Anordnung von Axon-Anfangssegmenten

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation der motorischen Beeinträchtigung bei C. elegans Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...