Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך מדע ופיתוח טכנולוגי הרפובליקה של סרביה חוזה מס '451-03-9/2021-14 / 200178, FENS - NENS חינוך והכשרה אשכול הפרויקט "קורס משולש על גליה בדלקת עצבית", ואת EC H2020 MSCA RISE מענק #778405. אנו מודים למריה אדז'יץ' ומינה פריץ' על אספקת תמונות האימונוהיסטוכימיה ולדניאלה באטאבליץ' על העזרה בכתיבת נייר.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות האיחוד האירופי להגנה על בעלי חיים למטרות מדעיות ובאישור הוועדה האתית של הפקולטה לביולוגיה, אוניברסיטת בלגרד (אישור מספר EK-BF-2016/08). לגבי חומר המטופל (sera עבור IgGs), הוא נאסף לבדיקה קלינית שגרתית בהסכמת המטופל מדעת בהתאם לקוד האתי של ההסתדרות הרפואית העולמית (הצה...

מאמר זה מציג את השיטה של גידול תאים ראשוניים ככלי מהיר ו"על התקציב" לחקר היבטים שונים של פיזיולוגיה של התא (פתו) כגון ALS במודל hSOD1G93A של חולדה. לפיכך, הטכניקה מתאימה למחקרים ברמת התא הבודד שניתן לבצע אקסטרפולציה ולחקור אותם ברמת ארגון גבוהה יותר (כלומר, בפרוסות רקמה או בחיה חיה). עם זאת, ל?...

טכניקות של תרביות תאים הולידו התקדמות רבה בתחומים מגוונים של נוירופיזיולוגיה תאית בבריאות ובמחלות. במיוחד, תרביות תאים ראשוניות, שבודדו זה עתה מרקמה עצבית של חיית מעבדה, מאפשרות לנסיין לחקור מקרוב את התנהגותם של תאים מגוונים במדיות ביוכימיות שונות ובמערכים פיזיולוגיים שונים. שימוש באינדיקטורים פיזיולוגיים פלואורסצנטיים שונים כגון הצבעים הרגישים ל-Ca2+ בשילוב עם מיקרוסקופיית וידאו בהילוך מהיר מספק תובנה טובה יותר לגבי התהליכים הביופיזיים והביוכימיים של התאים בזמן אמת.
ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית הרסנית המשפיעה על נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים1. למחלה יש פתוגנזה מורכבת מהסוג המשפחתי אך בעיקר של הצורה הספורדית (90% מהמקרים)2. ידוע שמנגנונים אוטונומיים שאינם תאיים תורמים לפתופיזיולוגיה של ALS, בעיקר בשל התפקיד החיוני של תאי גליה3. ALS מאופיינת היטב גם כמחלה נוירו-דלקתית עם מעורבות של גורמים הומורליים ותאיים של דלקת.
אימונוגלובולין G נמצא בשימוש נרחב כסמן מולקולרי ב- ALS ובמחלות נוירודגנרטיביות אחרות. לימוד רמת הסרום של סמן זה יכול להצביע על נוכחות ושלב של דלקת עצבית במחלה 4,5,6, בעוד נוכחותו בנוזל המוח והשדרה יכולה להצביע על הפרה של מחסום הדם במוח7. IgGs זוהו גם כמשקעים בתאי העצב המוטוריים של חוט השדרה של חולי ALS7. עם זאת, גישה זו הראתה כמה חוסר עקביות במתאם של רמת IgGs עם השלב והמאפיינים של המחלה6.
IgG שבודד מהסרה של חולי ALS (ALS IgG) יכול לגרום לתגובת סידן באסטרוציטים נאיביים8 ושחרור גלוטמט בתאי עצב, מה שמצביע על אפקט אקסיטוטוקסי - סימן היכר של פתולוגיה של ALS9. עם זאת, מחקרים על מודל החולדות hSOD1G93A ALS (המכיל עותקים מרובים של מוטציית SOD1 האנושית 10) הראו מספר סמנים של עקה חמצונית בתאי נוירוגליה בתרבית 11, רקמות 12,13,14, או חיותחיות 13. ראוי לציין כי האסטרוציטים שגודלו בתרבית ממודל חולדות ה-ALS היו מועדים יותר לעקה חמצונית הנגרמת על-ידי חמצן מאשר האסטרוגליה של חברי המלטה שאינם מהונדסים11.
תאים מיקרוגליאליים בתרבית מושפעים מ-ALS IgG בצורה פחות נראית לעין. כלומר, קו תאים מיקרוגליאליים מסוג BV-2 הציג עלייה באות מסמנים פלואורסצנטיים של עקה חמצונית בתגובה ליישום של דגימות 4/11 בלבד של חולי ALS IgG15. ידוע כי מיקרוגליה משתתפת בפאתולוגיות נוירו-דלקתיות רבות, מה שמוסיף לעקה חמצונית ולשלב התקדמות מאוחר במנגנון האוטונומי הלא-תאי של ALS16,17. עם זאת, הנתונים עם ALS IgGs הצביעו על כך שתאים אלה עשויים להיות לא תגובתיים כמו אסטרוציטים לגורמים הומורליים אלה של דלקת ALS. מספר מחקרים נערכו עם אסטרוציטים ראשוניים ממודלים של ALS murine, לא רק בגורים אלא גם בבעלי חיים סימפטומטיים, על המוח או על חוט השדרה 18,19,20,21. זה נכון גם לגבי תרביות ראשוניות מיקרוגליות, אם כי במידה פחותה מאשר אסטרוציטים ובעיקר מאזורי מוח בשלב העוברי22,23,24.
אנו משתמשים בהדמיית וידאו בהילוך מהיר של Ca2+ על תאים בתרבית בעיקר כאמצעי לעקוב אחר מעברים תוך-תאיים של יון זה כסמן פיזיולוגי של אקסיטוטוקסיות. לפיכך, על ידי אפיון ביופיזי של ארעיות אלה (משרעת, שטח תחת חולף, זמן עלייה, תדירות) החוקר יכול לקבל פרמטרים אבחוניים ניסיוניים ממודלים תאיים מגוונים של ניוון עצבי. טכניקה זו מציעה אפוא יתרון של הערכה פיזיולוגית כמותית של IgGs כסמנים ביולוגיים של מחלות. יש גוף גדול של ספרות על התפקיד של IgGs ו Ca2 + באינדוקציה של ALS. רוב המחקרים הללו בוצעו על ידי גרימת ALS על ידי הזרקת IgGs של מטופלים לחיות ניסוי 25,26,27,28,29, אשר לאחר מכן הראו עלייה תוך תאית Ca 2+ ותצהירי IgG. שורה של מחקרים בחנו את ההשפעה של ALS IgGs על הסינפסה המוטורית במבחנה30,31,32. בהקשר הנ"ל, הטכניקה המוצגת כאן שמה את הדגש על תאי הגליה כשחקנים חשובים במנגנון האוטונומי הלא-תאי של ALS ומכמתת את התגובה האקסיטוטוקסית הפוטנציאלית שלהם ל- IgGs כגורמים הומוריסטיים של דלקת עצבית. לגישה זו עשוי להיות יישום רחב יותר בבדיקת גורמים הומוריסטיים אחרים כגון סרה שלמה, CSF או ציטוקינים במערכות תרביות תאים שונות ובמודלים תאיים של דלקת כללית.
מאמר זה מתאר כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות ספראג דאולי, וכיצד להמשיך להשתמש בתאים אלה כדי לחקור פתופיזיולוגיה של ALS עם IgG שמקורו בסרה. פרוטוקולים מפורטים עבור טעינת צבע של תאים בתרבית (איור 1) והקלטות של שינויים של Ca2+ בניסויי דימות וידאו בהילוך מהיר. דוגמאות להקלטות וידאו יראו כיצד תאי גליה מגיבים ל-ALS IgG בהשוואה ל-ATP, כשהאחרון מפעיל קולטני ממברנה פורינרגיים. מוצגת לראשונה דוגמה לאופן שבו אסטרוציטים שבודדו ממוח החולדה hSOD1G93A ALS מגיבים עם תגובת Ca 2+ בולטת יותר ל-ALS IgG בהשוואה לבקרות שאינן מהונדסות, וכיצד לקשר את התהליך הזה להבדלים בפעולת המאגר של Ca2+. כמו כן מוצגת דוגמה להדמיית סידן בתאים מיקרוגליאליים המאותגרים באופן חריף עם ALS IgG, עם תגובה צנועה בלבד של סידן תוך תאי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

פרוטוקול זה מדגים כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות ספראג דאולי וכיצד להשתמש בתאים אלה לצורך חקר הפתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) במודל hSOD1G93A של חולדה. ראשית, הפרוטוקול מראה כיצד לבודד ולתרבת אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות לאחר הלידה, ולאחר מכן כיצד לאפיין ולבדוק את הטוהר של תרביות אלה על ידי אימונוציטוכימיה באמצעות סמן החלבון החומצי הגלי (GFAP) של אסטרוציטים וסמן המתאם הקושר סידן מיונן 1 (Iba1). בשלב הבא מתוארות שיטות להעמסת צבע (Fluo 4-AM הרגיש לסידן) של תאים בתרבית והקלטות של שינויים ב-Ca2+ בניסויי הדמיית וידאו על תאים חיים.
הדוגמאות להקלטות וידאו כוללות: (1) מקרים של Ca2+ הדמיה של אסטרוציטים בתרבית שנחשפו באופן חריף לאימונוגלובולין G (IgG) שבודדו מחולי ALS, והראו תגובה אופיינית וספציפית בהשוואה לתגובה ל-ATP כפי שהודגם באותו ניסוי. דוגמאות מראות גם עלייה חולפת בולטת יותר בריכוז הסידן התוך-תאי שמעורר ALS IgG באסטרוציטים hSOD1G93A בהשוואה לבקרים שאינם מהונדסים; (2) Ca 2+ הדמיה של אסטרוציטים בתרבית במהלך דלדול מאגרי הסידן על ידי thapsigargin (Thg), מעכב לא תחרותי של הרשתית האנדופלסמית Ca 2+ ATPase, ולאחר מכן ערך סידן המופעל על ידי אחסון הנגרם על ידי הוספת סידן בתמיסת ההקלטה, המדגימה את ההבדל בין פעולת Ca 2+ בחנות hSOD1G93A ובאסטרוציטים שאינם מהונדסים; (3) Ca 2+ הדמיה של המיקרוגליה התרבית מראה בעיקר חוסר תגובה ל-ALS IgG, בעוד שיישום ATP גרם לשינוי Ca2+. מאמר זה גם מדגיש אזהרות ואזהרות אפשריות לגבי צפיפות תאים קריטית וטוהר התרביות, תוך בחירת הריכוז הנכון של טכניקות צבע Ca2+ והעמסת צבע.

אפיון סוגי תאי גליה שונים בתרבית בדרך כלל לוקח 15-21 ימים לייצר אסטרוציטים לניסויים, בעוד שלתאים מיקרוגליאליים לוקח 10-15 ימים לגדול. החיסון בוצע כדי להעריך את טוהר התאים של התרבית. איור 1 מראה את הביטוי של תיוג כפול של הסמן האסטרוציטי GFAP והסמן המיקרוגליאלי Iba1 בתרבוי?...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

אנו מציגים כאן פרוטוקול כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות להדמיית וידאו בהילוך מהיר של Ca2+ תוך-תאי למחקר על פתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית במודל החולדות hSOD1G93A .

תרביות ראשוניות של אסטרוציטים ומיקרוגליה של חולדות והשימוש בהן בחקר טרשת אמיוטרופית צידית

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

פרוטוקול זה מאפשר לחשוף דפוס איתות סידן בין-תאי המאפיין כל תגובה של סוג תא בבריאות כמו גם במחלה. טכניקה זו מאפשרת אפיון ביופיזי מהיר ומפורט של התנהגות תאית מורכבת. אנו מתכננים להשתמש באיתות סידן זה המושרה על ידי IgG כטביעת אצבע לרפואה מותאמת אישית של מחלות נוירו-דלקתיות.בסביבה של החיים האמיתיים, לא קל לראות ולעקוב אחר כל התהליכים והאירועים, במיוחד אלה המתרחשים תחת המיקרוסקופ. לפיכך, הנתונים החזותיים חשובים. לאחר עריפת גורים בני יום עד שלושה ימים, חשפו את הגולגולת על ידי חיתוך העור באמצעות מספריים קטנים וזוויתיים.לאחר מכן פתח את הגולגולת על ידי חיתוך מגנום פורמן לכיוון המסלולים ובצע חתך קו אמצע מאונך. הוציאו את המוח מהגולגולת, והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה PBS. השתמש בקצה המלקחיים כדי לקרוע את הקשרים בין שתי ההמיספרות, והפרד את ההמיספרות עם מלקחיים מעוקלים על ידי דחיפה עדינה של חצי כדור מהמרכז לצד.השתמשו במלקחיים ישרים ומעוקלים כדי להסיר את קרומי המוח על ידי קריעתם בזהירות. לאחר מכן להסיר את ההיפוקמפוס על ידי צביטה אותו עם מלקחיים מעוקלים, ולהשליך, או להשתמש בו להכנת תרבית תאים אחרת. לאחר מכן, להעביר את קליפת המוח לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של PBS קר הומוגניזציה של הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 עד 15 פעמים עם קצה של מיליליטר אחד.צנטריפוגה התאים ב 500 גרם במשך חמש דקות. השליכו את הסופר-נאטנט והניחו מחדש את הכדור בשלושה מיליליטר של PBS קר על ידי פיפטינג עם קצה של מיליליטר אחד. צנטריפוגה שוב, ולהחזיר את הכדור בשני מיליליטר של DMEM שלם בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקה.לאחר העברת ההומוגנט לצינור של שני מיליליטר, מעבירים את ההומוגנט דרך מחטים של 21 ו-23 כדי לבצע השעיה של תאים בודדים. יוצקים את תרחיף התאים שהוכן מקליפת המוח האחת לתוך צלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר המכילה שלושה מיליליטר של DMEM שלם, ומנערים קלות את צלחת הפטרי, כך שהמתלה מופץ באופן אחיד. לדגור את התאים באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני ו 95% אוויר ב 37 מעלות צלזיוס.כדי לקדם את צמיחת האסטרוציטים, הסר את המדיה הישנה, ושטוף את התא עם PBS שחומם מראש כדי להסיר את תאי הגליה המחוברים באופן רופף ואת עקבות ה- FBS ברגע שהם מגיעים למפגש של 70% עד 80%. לאחר מכן נסו את השכבה הבסיסית של האסטרוציטים על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין שחוממה מראש ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד חמש דקות. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק אם התאים מתחילים להתנתק, והוסף ארבעה מיליליטר של DMEM שלם.לאסוף את ההשעיה התא, ולהעביר אותו צינור 15 מיליליטר. ואז צנטריפוגה את הצינור ב 500 גרם במשך חמש דקות. להשליך את supernatant ולהשהות את הכדור במיליליטר אחד של מדיום שלם.לספור את התאים באמצעות hemocytometer. לאחר מכן, הכינו את מנת התרבות והוסיפו מדיום תרבותי. סידור מחדש של התאים בצפיפות של 10 עד 4 לסמ"ר בחמישה מיליליטרים של DMEM שלם טרי ושטף את התאים ב-DMEM מלא לפני כל החלפת מדיה.לאחר הגעה למפגש של 70% עד 80%, חזור על טריפסיניזציה, וזרע חמש פעמים 10 לאסטרוציטים השלישיים על כיסוי זכוכית עגול מצופה פולי-L-ליזין של שבעה מילימטרים. תן להם לצרף במשך 10 דקות, ולהוסיף DMEM שלם. השתמש בהם בניסויים לאחר 48 שעות.לאחר הכנת תרביות המיקרוגליה, כדי לקדם את המיקרוגליה, אפשרו לתאי הגליה להתמזג והמיקרוגליה תופיע על גבי שכבת האסטרוציטים לאחר 10 עד 15 ימים. נערו את צלחת הפטרי על שייקר אורביטלי במשך שעתיים במהירות של 220 סל"ד. כעת, שטפו קלות את התאים המנותקים והמחוברים באופן רופף על ידי שאיפת הסופרנטנט עם קצה פיפטה של מיליליטר אחד.יש לטפטף בעדינות את הסופר-נטנט על שכבת התאים מספר פעמים, תוך הקפדה על כיסוי כל משטח שכבת התא במהלך שלב שטיפה זה. לאסוף את המדיום עם תאים מנותקים, ולהעביר אותו צינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה, החייאה וספירת התאים כפי שהוכח קודם לכן.זרע חמש פעמים 10 למיקרוגליה השלישית על כיסוי זכוכית עגול מצופה פולי-L-ליזין של שבעה מילימטרים. תן להם להתחבר במשך 10 דקות ולהוסיף DMEM שלם. השתמש בהם בניסויים לאחר 48 שעות.כדי לשטוף את ה-DMEM השלם, העבירו כיסוי אחד לצלחת עם תמיסה חוץ-תאית. הכן את תמיסת העמסת הצבע על ידי דילול מילימולר אחד Fluo-4 AM עם תמיסה חוץ-תאית כדי להשיג את הריכוז הסופי של חמישה מיקרומולר. מניחים את המכסה עם תאים בתמיסת העמסת הצבע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ושוטפים את התאים בתמיסה חוץ-תאית למשך 20 דקות.הנח את תלוש הכיסוי בתא ההקלטה עם מיליליטר אחד של פתרון עבודה. בחר את שדה הראייה עם מספר עקבי של תאים לאורך כל הניסוי. התחל את ההדמיה וקבע את הבסיס על ידי רכישת הרמה הבסיסית של פלואורסצנציה למשך שלוש עד חמש דקות.לאחר מכן הפסק את זרימת פתרון העבודה, ועבור לפתרון הבדיקה למשך הזמן הרצוי. בין כל תמיסת בדיקה, לשטוף את התאים עם זרימה קבועה של הפתרון עובד במשך שלוש עד חמש דקות. שמור על עוצמת הקול של התמיסה בתא ההקלטה במיליליטר אחד על ידי סידור יניקה קבועה מראש התמיסה.בחר במסגרת עוצמת האות הגבוהה ביותר, והקף תא אחד באמצעות יישום הכלי מצולע. לאחר כיתור כל התאים בשדה הנרכש, בחר חמישה אזורי עניין ברקע באמצעות הכלי מעגל. לאחר מכן מדוד את עוצמת האות הממוצעת של תא בודד ואת הרקע עבור כל מסגרת זמן.בחר את כל אזורי העניין והשתמש בפקודה Multi-Measure ב-ROI Manager ב-ImageJ, או בכל פקודה מקבילה בתוכנה מסחרית. לאחר ייבוא הנתונים בתוכנת MATLAB, ממוצע של חמישה ROI ברקע והפחת את הרקע הממוצע של כל מסגרת מעוצמת ההחזר הממוצעת על ההשקעה של המסגרות שנרכשו בו זמנית. מאוחר יותר, נתחו את פעילות הסידן על ידי קביעת המשרעת של שיא הסידן, השינוי המשולב של ארעי הסידן, זמן לשיא, זמן עלייה, חצי רוחב ותדירות.GFAP משמש כדי לדמיין אסטרוציטים ו- Iba1 כדי לדמיין microglia. אסטרוציטים hSOD1G93A מגיבים לאימונוגלובולין G של ALS עם משרעת גדולה יותר של הסידן החולף, שינוי משולב כולל משמעותי יותר, וזמן קצר יותר לשיא מאשר אסטרוציטים שאינם מהונדסים. התגובה לאימונוגלובולין G של ALS ניתנת להבחנה מהתגובה ל-ATP.לאסטרוציטים hSOD1G93A הייתה רמה גבוהה יותר של יוני סידן בחנויות, כפי שהתגלה על ידי דלדול החנות, מה שמעיד על עומס יתר של יון זה. המיקרוגליה עברה תרבית, ועוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת הופקה עם הזמן. עקבות הסידן של שלושה תאים ייצגו שרק תא אחד הגיב לאימונוגלובולין G של ALS, בעוד שכל התאים הגיבו ל-ATP.התמונות הפסאודו-צבעוניות ייצגו את עוצמת הפלואורסצנציה ואת קו הבסיס בתגובה ל-ALS, IgG ו-ATP. התאים צריכים להיות נטענים כראוי ואת הפרמטרים של מערכת ההדמיה צריך להיות מותאם כראוי, כך האות לא מופרד במהלך הניסוי. יחד עם פליטת סידן, ניתן לבצע הידוק מדבקה.לפיכך, ניתן לקבל תמונה מלאה יותר של המתאם בין זרמי יונים שונים של הממברנה לבין פליטת סידן. ההבנה של הומאוסטזיס סידן תוך תאי היא בעלת חשיבות חיונית לחקר מספר תגובות לגירויים טבעיים, כמו גם לגירויים מלחיצים וחיצוניים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

השימוש של התניה קלאסית Eyeblink מעקב כדי להעריך תפקוד בהיפוקמפוס במודל של עכברים של אלכוהול עוברית ספקטרום הפרעות

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

מבוססת תא Assay ללמוד טאו בתיווך נוגדנים אישור מאת מיקרוגלייה

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

גישה האכלה נוגדן כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמא העיקרי ההיפוקיים

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

שימוש של אלקטרופורזה נימי הנוגדנים כדי לחפש בסמנים פוטנציאליים של טרשת Amyotrophic לרוחב בטסיות האדם

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

שימוש בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי לחקור את ההרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...