Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

इस काम को सर्बिया के शिक्षा विज्ञान और तकनीकी विकास गणराज्य के मंत्रालय अनुबंध संख्या 451-03-9/2021-14/ 200178, FENS - NENS शिक्षा और प्रशिक्षण क्लस्टर परियोजना "न्यूरोइन्फ्लेमेशन में ग्लिया पर त्रिपक्षीय पाठ्यक्रम" और ईसी एच 2020 एमएससीए राइज अनुदान # 778405 द्वारा समर्थित किया गया था। हम इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवियों की आपूर्ति के लिए मारिजा एडजिक और मीना पेरीक और पेपर लेखन में मदद के लिए डेनिजेला बटावेलजिक को धन्यवाद देते हैं।

सभी प्रयोगवैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए जानवरों की सुरक्षा पर यूरोपीय संघ के निर्देशों के अनुसार और जीवविज्ञान संकाय, बेलग्रेड विश्वविद्यालय (अनुमोदन संख्या ईके-बीएफ-2016/08) के नैतिक आयोग की अनुमति के सा?...

यह पेपर प्राथमिक सेल संवर्धन की विधि को चूहे एचएसओडी 1जी 9 3 ए मॉडल में एएलएस जैसे सेल (पैथो) फिजियोलॉजी के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक तेज और "बजट पर" उपकरण के रूप में प्रस्तुत करता है। इस प्?...

सेल कल्चर तकनीकों ने स्वास्थ्य और रोग में सेलुलर न्यूरोफिज़ियोलॉजी के विभिन्न क्षेत्रों में कई प्रगति को जन्म दिया है। विशेष रूप से, प्राथमिक कोशिका संस्कृतियां, एक प्रयोगशाला जानवर के न्यूरोनल ऊतक से ताजा पृथक, प्रयोगकर्ता को विभिन्न जैव रासायनिक मीडिया और शारीरिक सेटअपों में विविध कोशिकाओं के व्यवहार का बारीकी से अध्ययन करने की अनुमति देती हैं। टाइम-लैप्स वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में सीए2 + -संवेदनशील रंगों जैसे विभिन्न फ्लोरोसेंट शारीरिक संकेतकों का उपयोग करना वास्तविक समय में सेलुलर बायोफिज़िकल और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं में बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
एएलएस एक विनाशकारी न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है जो ऊपरी और निचले मोटरन्यूरॉन्स को प्रभावित करती है। रोग में पारिवारिक प्रकार का एक जटिल रोगजनन होता है लेकिन ज्यादातर छिटपुट रूप (90% मामलों) का होता है। यह सर्वविदित है कि गैर-सेल स्वायत्त तंत्र एएलएस पैथोफिज़ियोलॉजी में योगदान करते हैं, मुख्य रूप से ग्लियलकोशिकाओं की आवश्यक भूमिका के कारण। एएलएस को सूजन के ह्यूमर और सेलुलर कारकों की भागीदारी के साथ एक न्यूरोइन्फ्लेमेटरी बीमारी के रूप में भी जाना जाता है।
इम्युनोग्लोबुलिन जी का व्यापक रूप से एएलएस और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में आणविक मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है। इस मार्कर के सीरम स्तर का अध्ययन रोग 4,5,6 में न्यूरोइन्फ्लेमेशन की उपस्थिति और चरण का संकेत दे सकता है, जबकि मस्तिष्कमेरु द्रव में इसकी उपस्थिति रक्त मस्तिष्क बाधा 7 के उल्लंघन का संकेत दे सकतीहै। आईजीजी को एएलएस रोगियों के रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स में जमा के रूप में भी पहचानागया था। फिर भी, इस दृष्टिकोण ने रोग के चरण और विशेषताओं के साथ आईजीजी के स्तर के सहसंबंध में कुछ विसंगतियां दिखाईहैं।
एएलएस रोगियों (एएलएस आईजीजी) के सेरा से अलग आईजीजी भोले एस्ट्रोसाइट्स8 और न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट रिलीज में कैल्शियम प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकता है, जो एक एक्साइटोटॉक्सिक प्रभाव की ओर इशारा करता है- एएलएस पैथोलॉजी9 की एक पहचान। हालांकि, एचएसओडी 1जी 9 3 ए एएलएस चूहा मॉडल (मानव एसओडी 1 उत्परिवर्तन10 की कई प्रतियां युक्त) पर अध्ययन ने सुसंस्कृत न्यूरोग्लियल कोशिकाओं 11, ऊतक12,13,14, या जीवित जानवरों 13 में ऑक्सीडेटिव तनाव के कई मार्कर दिखाए। यह उल्लेखनीय है कि एएलएस चूहे मॉडल से सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स गैर-ट्रांसजेनिक लिटरमेट्स11 से एस्ट्रोग्लिया की तुलना में पेरोक्साइड द्वारा प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए अधिक प्रवण थे।
संस्कृति में माइक्रोग्लियल कोशिकाएं एएलएस आईजीजी से कम स्पष्ट तरीके से प्रभावित होती हैं। अर्थात्, एक बीवी -2 माइक्रोग्लियल सेल लाइन ने केवल 4/11 एएलएस आईजीजी रोगी नमूने15 के आवेदन के जवाब में ऑक्सीडेटिव तनाव के फ्लोरोसेंट मार्करों से संकेत में वृद्धि प्रदर्शित की। यह सर्वविदित है कि माइक्रोग्लिया कई न्यूरोइन्फ्लेमेटरी विकृतियों में भाग लेते हैं, जो एएलएस16,17 के गैर-सेल स्वायत्त तंत्र में ऑक्सीडेटिव तनाव और देर से प्रगति चरण को जोड़ते हैं। फिर भी, एएलएस आईजीजी के साथ डेटा ने संकेत दिया कि ये कोशिकाएं एएलएस सूजन के इन ह्यूमरल कारकों के लिए एस्ट्रोसाइट्स के रूप में प्रतिक्रियाशील नहीं हो सकती हैं। एएलएस मुराइन मॉडल से प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स के साथ कई अध्ययन किए गए हैं, न केवल पिल्ले में बल्कि रोगसूचक जानवरों में भी, या तो मस्तिष्क पर या रीढ़ की हड्डीपर 18,19,20,21। यह माइक्रोग्लियल प्राथमिक संस्कृतियों के लिए भी सच है, हालांकि एस्ट्रोसाइट्स की तुलना में कुछ हद तक और भ्रूण चरण 22,23,24 पर मस्तिष्क क्षेत्रों से।
हम संस्कृति में कोशिकाओं पर सीए2 + के टाइम-लैप्स वीडियो इमेजिंग का उपयोग मुख्य रूप से एक्साइटोटॉक्सिसिटी के शारीरिक मार्कर के रूप में इस आयन के इंट्रासेल्युलर क्षणिकों का पालन करने के साधन के रूप में करते हैं। इस प्रकार, इन क्षणिकों (आयाम, क्षणिक, वृद्धि-समय, आवृत्ति के तहत क्षेत्र) के बायोफिज़िकल लक्षण वर्णन द्वारा शोधकर्ता न्यूरोडीजेनेरेशन के विभिन्न सेलुलर मॉडल से प्रयोगात्मक नैदानिक पैरामीटर प्राप्त कर सकता है। इस प्रकार यह तकनीक रोग बायोमाकर्स के रूप में आईजीजी के मात्रात्मक शारीरिक मूल्यांकन का लाभ प्रदान करती है। एएलएस के प्रेरण में आईजीजी और सीए2 + की भूमिका पर साहित्य का एक बड़ा निकाय है। इनमें से अधिकांश अध्ययन रोगी आईजीजी को प्रयोगात्मक जानवरों 25,26,27,28,29 में इंजेक्ट करके एएलएस को प्रेरित करके किए गए थे, जिसने तब इंट्रासेल्युलर सीए2 + ऊंचाई और आईजीजी जमाव दिखाया था। अध्ययनों की एक पंक्ति ने विट्रो30,31,32 में मोटर सिनैप्स पर एएलएस आईजीजी के प्रभाव का पता लगाया। उपरोक्त संदर्भ में, यहां प्रस्तुत तकनीक एएलएस के गैर-सेल स्वायत्त तंत्र में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में ग्लियल कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करती है और न्यूरोइन्फ्लेमेशन के ह्यूमरल कारकों के रूप में आईजीजी के लिए उनकी संभावित उत्तेजक प्रतिक्रिया को निर्धारित करती है। इस दृष्टिकोण का विभिन्न सेल कल्चर सिस्टम में और सामान्य सूजन के सेलुलर मॉडल में पूरे सेरा, सीएसएफ या साइटोकिन्स जैसे अन्य ह्यूमरल कारकों के परीक्षण में व्यापक अनुप्रयोग हो सकता है।
यह पेपर बताता है कि स्प्रैग डॉवले चूहों के कॉर्टिकिस से ग्लियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की प्राथमिक संस्कृतियों को कैसे तैयार किया जाए और रोगी सेरा-व्युत्पन्न आईजीजी के साथ एएलएस पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग कैसे किया जाए। प्रोटोकॉल सुसंस्कृत कोशिकाओं (चित्रा 1) की डाई-लोडिंग और टाइम-लैप्स वीडियो इमेजिंग प्रयोगों में सीए2 + परिवर्तनों की रिकॉर्डिंग के लिए विस्तृत हैं। वीडियो रिकॉर्डिंग के उदाहरण बताएंगे कि एटीपी की तुलना में ग्लियल कोशिकाएं एएलएस आईजीजी पर कैसे प्रतिक्रिया करती हैं, बाद में प्यूरीनर्जिक झिल्ली रिसेप्टर्स को सक्रिय करती हैं। पहली बार दिखाया गया है कि एचएसओडी 1जी 9 3 ए एएलएस चूहे के मस्तिष्क से अलग एस्ट्रोसाइट्स गैर-ट्रांसजेनिक नियंत्रणों की तुलना में एएलएस आईजीजी के लिए अधिक स्पष्ट सीए2 + प्रतिक्रिया के साथ कैसे प्रतिक्रिया करते हैं और इस प्रक्रिया को सीए2 + स्टोर ऑपरेशन में अंतर से कैसे संबंधित किया जाए। इसके अलावा दिखाया गया है कि माइक्रोग्लियल कोशिकाओं में कैल्शियम इमेजिंग का एक उदाहरण एएलएस आईजीजी के साथ तीव्र रूप से चुनौती दी गई है, जिसमें इंट्रासेल्युलर कैल्शियम की केवल मामूली प्रतिक्रिया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि स्प्राग डॉवले चूहों के कॉर्टिकिस से ग्लियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की प्राथमिक संस्कृतियों को कैसे तैयार किया जाए और चूहे एचएसओडी 1जी 9 3 ए मॉडल में एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) के पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के उद्देश्य से इन कोशिकाओं का उपयोग कैसे किया जाए। सबसे पहले, प्रोटोकॉल दिखाता है कि प्रसवोत्तर चूहे के कॉर्टिकिस से एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया को कैसे अलग और कल्चर किया जाए, और फिर एस्ट्रोसाइट्स के ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) मार्कर और आयनित कैल्शियम-बाइंडिंग एडाप्टर अणु 1 (आईबीए 1) माइक्रोग्लियल मार्कर का उपयोग करके इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा शुद्धता के लिए इन संस्कृतियों को कैसे चिह्नित और परीक्षण किया जाए। अगले चरण में, सुसंस्कृत कोशिकाओं के डाई-लोडिंग (कैल्शियम-संवेदनशील फ्लूओ 4-एएम) और लाइव कोशिकाओं पर वीडियो इमेजिंग प्रयोगों में सीए2 + परिवर्तनों की रिकॉर्डिंग के लिए विधियों का वर्णन किया गया है।
वीडियो रिकॉर्डिंग के उदाहरणों में शामिल हैं: (1) एएलएस रोगियों से अलग इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) के संपर्क में आने वाले सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स के सीए2 + इमेजिंग के मामले, एटीपी की प्रतिक्रिया की तुलना में एक विशेषता और विशिष्ट प्रतिक्रिया दिखाते हैं जैसा कि एक ही प्रयोग में दिखाया गया है। उदाहरण गैर-ट्रांसजेनिक नियंत्रणों की तुलना में एचएसओडी 1जी 9 3 ए एस्ट्रोसाइट्स में एएलएस आईजीजी द्वारा उत्पन्न इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता में अधिक स्पष्ट क्षणिक वृद्धि भी दिखाते हैं; (2) एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम सीए2 + एटीपीस के एक गैर-प्रतिस्पर्धी अवरोधक थाप्सिगार्गिन (टीएचजी) द्वारा कैल्शियम स्टोर की कमी के दौरान सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स की सीए2 + इमेजिंग, इसके बाद रिकॉर्डिंग समाधान में कैल्शियम के अतिरिक्त स्टोर-संचालित कैल्शियम प्रविष्टि, जो एचएसओडी 1जी 9 3 ए और गैर-ट्रांसजेनिक एस्ट्रोसाइट्स में सीए2 + स्टोर ऑपरेशन के बीच अंतर को दर्शाता है; (3) सुसंस्कृत माइक्रोग्लिया की सीए2 + इमेजिंग मुख्य रूप से एएलएस आईजीजी के प्रति प्रतिक्रिया की कमी दिखाती है, जबकि एटीपी एप्लिकेशन ने सीए2 + परिवर्तन प्राप्त किया। यह पेपर महत्वपूर्ण सेल घनत्व और संस्कृतियों की शुद्धता के बारे में संभावित चेतावनी और सावधानी पर भी जोर देता है, सीए2 + डाई और डाई-लोडिंग तकनीकों की सही एकाग्रता चुनता है।

संस्कृति में विभिन्न ग्लियल सेल प्रकारों का लक्षण वर्णन प्रयोगों के लिए एस्ट्रोसाइट्स का उत्पादन करने में आमतौर पर 15-21 दिन लगते हैं, जबकि माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को बढ़ने में 10-15 दिन लगते हैं। सं...

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Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

हम यहां एचएसओडी 1जी 9 3 ए चूहे मॉडल में एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस के पैथोफिज़ियोलॉजी पर शोध के लिए इंट्रासेल्युलर सीए2 + के टाइम-लैप्स वीडियो इमेजिंग के लिए चूहे कॉर्टिकिस से ग्लियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की प्राथमिक संस्कृतियों को तैयार करने के तरीके पर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

चूहे एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की प्राथमिक संस्कृतियां और एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस के अध्ययन में उनका उपयोग

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

यह प्रोटोकॉल इंटरसेलुलर कैल्शियम सिग्नलिंग पैटर्न को प्रकट करने की अनुमति देता है जो स्वास्थ्य के साथ-साथ बीमारी में प्रत्येक सेल प्रकार की प्रतिक्रिया की विशेषता है। यह तकनीक जटिल सेलुलर व्यवहार के तेज और विस्तृत बायोफिज़िकल लक्षण वर्णन की अनुमति देती है। हम इस आईजीजी-प्रेरित कैल्शियम सिग्नलिंग को न्यूरोइन्फ्लेमेटरी रोगों की व्यक्तिगत दवा के लिए फिंगरप्रिंट के रूप में उपयोग करने की योजना बना रहे हैं।वास्तविक जीवन सेटिंग में, सभी प्रक्रियाओं और घटनाओं को देखना और उनका पालन करना आसान नहीं है, खासकर माइक्रोस्कोप के नीचे होने वाली घटनाओं को। इसलिए, दृश्य डेटा महत्वपूर्ण है। एक से तीन दिन के पिल्ले का सिर काटने के बाद, छोटी कोण वाली कैंची का उपयोग करके त्वचा को काटकर खोपड़ी को उजागर करें।फिर कक्षाओं की ओर फोरमेन मैग्नम को काटकर खोपड़ी खोलें और लंबवत मध्य रेखा काटें। खोपड़ी से मस्तिष्क को निकालें, और इसे पीबीएस युक्त पेट्री डिश में रखें। दोनों गोलार्धों के बीच संबंधों को फाड़ने के लिए बल की नोक का उपयोग करें, और केंद्र से एक गोलार्ध को धीरे से किनारे तक धकेलकर घुमावदार बल के साथ गोलार्धों को अलग करें।मेनिंगेस को सावधानीपूर्वक फाड़कर हटाने के लिए सीधे और घुमावदार बल का उपयोग करें। फिर हिप्पोकैम्पस को घुमावदार बल के साथ चुटकी करके हटा दें, और छोड़ दें, या इसे किसी अन्य सेल संस्कृति की तैयारी के लिए उपयोग करें। इसके बाद, कॉर्टेक्स को 15-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें तीन मिलीलीटर ठंडा पीबीएस होता है और एक मिलीलीटर टिप के साथ 10 से 15 बार ऊपर और नीचे पाइप करके ऊतक को समरूप करें।पांच मिनट के लिए 500 ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और एक मिलीलीटर टिप के साथ पाइप करके तीन मिलीलीटर ठंडे पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज ने एक बार फिर से गोली को 10% एफबीएस और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक पूर्ण डीएमईएम के दो मिलीलीटर में पुन: निलंबित कर दिया।होमोजेनेट को दो-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करने के बाद, एकल कोशिकाओं का निलंबन बनाने के लिए 21 और 23-गेज सुइयों के माध्यम से होमोजेनेट पारित करें। एक कॉर्टेक्स से तैयार सेल सस्पेंशन को 60 मिलीमीटर पेट्री डिश में डालें जिसमें तीन मिलीलीटर पूर्ण डीएमईएम हो, और पेट्री डिश को हल्के से हिलाएं, ताकि निलंबन समान रूप से वितरित हो। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 95% हवा के साथ एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।एस्ट्रोसाइट विकास को बढ़ावा देने के लिए, पुराने मीडिया को हटा दें, और 70 से 80% कंफ्लुएंसी प्राप्त करने के बाद शिथिल रूप से संलग्न ग्लियल कोशिकाओं और एफबीएस के निशान को हटाने के लिए सेल को पूर्व-गर्म पीबीएस के साथ धोएं। फिर प्री-वार्मेड ट्रिप्सिन समाधान के एक मिलीलीटर जोड़कर एस्ट्रोसाइट्स की अंतर्निहित परत को ट्रिप्सिनाइज करें और दो से पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यह जांचने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें कि क्या कोशिकाएं अलग होना शुरू करती हैं, और चार मिलीलीटर पूर्ण डीएमईएम जोड़ें।सेल निलंबन एकत्र करें, और इसे 15-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर पांच मिनट के लिए ट्यूब को 500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और गोली को पूर्ण माध्यम के एक मिलीलीटर में पुन: निलंबित करें।हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। इसके बाद, संस्कृति पकवान तैयार करें और संस्कृति माध्यम जोड़ें। पांच मिलीलीटर ताजा पूर्ण डीएमईएम में प्रति वर्ग सेंटीमीटर 10 से चौथी कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं को पुन: स्थापित करें और प्रत्येक मीडिया प्रतिस्थापन से पहले कोशिकाओं को पूर्ण डीएमईएम के साथ धोएं।70 से 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने के बाद, ट्रिप्सिनाइजेशन को दोहराएं, और सात मिलीमीटर पॉली-एल-लाइसिन-लेपित परिपत्र ग्लास कवर स्लिप पर तीसरे एस्ट्रोसाइट्स को पांच बार 10 बार बीज दें। उन्हें 10 मिनट के लिए संलग्न करने दें, और पूर्ण DMEM जोड़ें। 48 घंटे के बाद प्रयोगों में उनका उपयोग करें।माइक्रोग्लिया संस्कृतियों को तैयार करने के बाद, माइक्रोग्लिया को बढ़ावा देने के लिए, ग्लियल कोशिकाओं को कंफ्लुएंट बनने की अनुमति दें और माइक्रोग्लिया 10 से 15 दिनों के बाद एस्ट्रोसाइट परत के शीर्ष पर दिखाई देगा। पेट्री डिश को 220 आरपीएम पर दो घंटे के लिए ऑर्बिटल शेकर पर हिलाएं। अब, एक मिलीलीटर पिपेट टिप के साथ सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करके अलग और शिथिल रूप से संलग्न कोशिकाओं को हल्के से धो लें।धीरे-धीरे कई बार कोशिकाओं की परत पर सतह पर तैरने वाला वितरित करें, इस धोने के चरण के दौरान पूरे सेल परत की सतह को कवर करना सुनिश्चित करें। अलग कोशिकाओं के साथ माध्यम को इकट्ठा करें, और इसे 15-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूज, पुन: निलंबित करें, और कोशिकाओं की गणना करें जैसा कि पहले दिखाया गया है।सात मिलीमीटर पॉली-एल-लाइसिन-लेपित गोलाकार ग्लास कवर स्लिप पर तीसरे माइक्रोग्लिया को पांच गुना 10 गुना बीज दें। उन्हें 10 मिनट के लिए संलग्न करने दें और पूर्ण डीएमईएम जोड़ें। 48 घंटे के बाद प्रयोगों में उनका उपयोग करें।पूर्ण डीएमईएम को धोने के लिए, एक कवर स्लिप को बाह्य समाधान के साथ डिश में स्थानांतरित करें। पांच माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बाह्य समाधान के साथ एक मिलीमोलर फ्लूओ -4 एएम को पतला करके डाई लोडिंग समाधान तैयार करें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए डाई लोडिंग समाधान में कोशिकाओं के साथ कवर स्लिप रखें, और कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए बाह्य समाधान में धो लें।कवर स्लिप को रिकॉर्डिंग कक्ष में एक मिलीलीटर कामकाजी समाधान के साथ रखें। प्रयोग के दौरान कोशिकाओं की एक सुसंगत संख्या वाले दृश्य के क्षेत्र का चयन करें। इमेजिंग शुरू करें और तीन से पांच मिनट के लिए प्रतिदीप्ति के बेसल स्तर को प्राप्त करके बेसलाइन निर्धारित करें।फिर काम करने वाले समाधान के प्रवाह को रोकें, और वांछित समय के लिए परीक्षण समाधान पर स्विच करें। प्रत्येक परीक्षण समाधान के बीच, कोशिकाओं को तीन से पांच मिनट के लिए काम करने वाले समाधान के निरंतर प्रवाह के साथ धोएं। समाधान के शीर्ष से निरंतर चूषण की व्यवस्था करके रिकॉर्डिंग कक्ष में समाधान की मात्रा को एक मिलीलीटर पर रखें।उच्चतम सिग्नल तीव्रता फ्रेम चुनें, और बहुभुज उपकरण अनुप्रयोग का उपयोग करके एक सेल को घेरें। अधिग्रहित क्षेत्र में सभी कोशिकाओं को घेरने के बाद, सर्कल टूल का उपयोग करके पृष्ठभूमि में रुचि के पांच क्षेत्रों का चयन करें। फिर एकल सेल की औसत संकेत तीव्रता और प्रत्येक समय सीमा के लिए पृष्ठभूमि को मापें।रुचि के सभी क्षेत्रों का चयन करें, और ImageJ में ROI प्रबंधक में मल्टी-माप कमांड का उपयोग करें, या वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर में किसी भी समकक्ष कमांड का उपयोग करें। MATLAB सॉफ्टवेयर में डेटा आयात करने के बाद, औसत पांच पृष्ठभूमि ROI और एक साथ प्राप्त फ्रेम की औसत ROI तीव्रता से प्रत्येक फ्रेम की औसत पृष्ठभूमि को घटाएं। बाद में, कैल्शियम पीक के आयाम, कैल्शियम क्षणिक के एकीकृत परिवर्तन, पीक तक समय, वृद्धि समय, आधी चौड़ाई और आवृत्ति का निर्धारण करके कैल्शियम गतिविधि का विश्लेषण करें।जीएफएपी का उपयोग एस्ट्रोसाइट्स और आईबीए 1 को माइक्रोग्लिया की कल्पना करने के लिए किया जाता है। एचएसओडी 1 जी 9 3 ए एस्ट्रोसाइट्स कैल्शियम क्षणिक के अधिक आयाम के साथ एएलएस इम्युनोग्लोबुलिन जी का जवाब देते हैं, एक अधिक समग्र एकीकृत परिवर्तन, और गैर-ट्रांसजेनिक एस्ट्रोसाइट्स की तुलना में चरम पर कम समय। एएलएस इम्युनोग्लोबुलिन जी की प्रतिक्रिया एटीपी की प्रतिक्रिया से अलग है।एचएसओडी 1 जी 9 3 ए एस्ट्रोसाइट्स में स्टोर में कैल्शियम आयनों का उच्च स्तर था जैसा कि स्टोर की कमी से पता चला है, जो इस आयन के अधिभार का संकेत देता है। माइक्रोग्लिया को सुसंस्कृत किया गया था, और समय के साथ औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता निकाली गई थी। तीन कोशिकाओं के कैल्शियम के निशान ने दर्शाया कि केवल एक सेल ने एएलएस इम्युनोग्लोबुलिन जी का जवाब दिया, जबकि सभी कोशिकाओं ने एटीपी का जवाब दिया।छद्म रंग छवियों ने एएलएस, आईजीजी और एटीपी के जवाब में प्रतिदीप्ति तीव्रता और आधार रेखा का प्रतिनिधित्व किया। कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से लोड करने की आवश्यकता होती है और इमेजिंग सिस्टम के मापदंडों को उचित रूप से समायोजित करने की आवश्यकता होती है, ताकि प्रयोग के दौरान सिग्नल अलग न हो। कैल्शियम उत्सर्जक के साथ, पैच क्लैंपिंग किया जा सकता है।इस प्रकार, विभिन्न झिल्ली आयन धाराओं और कैल्शियम उत्सर्जक के बीच सहसंबंध की अधिक पूरी तस्वीर प्राप्त की जा सकती है। इंट्रासेल्युलर कैल्शियम होमियोस्टैसिस की समझ प्राकृतिक के साथ-साथ तनावपूर्ण और बाहरी उत्तेजनाओं के लिए कई प्रतिक्रियाओं की खोज के लिए आवश्यक महत्व की है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes की तीन आयामी Confocal morphometric विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

एक चूहा मॉडल भ्रूण शराब स्पेक्ट्रम विकारों में हिप्पोकैम्पस रोग का आकलन करने के लिए ट्रेस Eyeblink शास्त्रीय कंडीशनिंग का उपयोग

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

बढ़ी पवित्रता और बहुमुखी प्रतिभा के साथ प्राथमिक Microglia का तेजी से और रिफाइंड CD11b चुंबकीय अलगाव

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ पर न्यूरोनल सेल संस्कृतियों की उत्तेजना के लिए नेटवर्क रिस्पांस में समय पर निर्भर वृद्धि

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

लक्षण वर्णन और घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा माउस प्राथमिक Microglia के अलगाव

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

सेल ने परख कर पढ़ाई एंटीबॉडी-मध्यस्थता करने वाले ताऊ को Microglia ने मंजूरी

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

अलग प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृति में ग्लूटामेट रिसेप्टर तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक एंटीबॉडी खिला दृष्टिकोण

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

मानव प्लेटलेट्स में एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस के संभावित बायोमार्कर की खोज के लिए केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस इम्यूनोसे का उपयोग

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

एक्सोन प्रारंभिक खंडों की असेंबली का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक संस्कारित हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

C. elegans में मोटर हानि का मूल्यांकन Amyotrophic Lateral Sclerosis के मॉडल

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...