Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e dello Sviluppo Tecnologico Repubblica di Serbia Contratto n. 451-03-9/2021-14/ 200178, dal progetto FENS - NENS Education and Training Cluster "Corso Trilaterale sulla Glia nella Neuroinfiammazione" e dalla sovvenzione EC H2020 MSCA RISE #778405. Ringraziamo Marija Adžić e Mina Perić per aver fornito le immagini di immunoistochimica e Danijela Bataveljić per l'aiuto nella scrittura di articoli.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le direttive UE sulla protezione degli animali per scopi scientifici e con il permesso della Commissione etica della Facoltà di Biologia, Università di Belgrado (numero di approvazione EK-BF-2016/08). Per quanto riguarda il materiale del paziente (sieri per IgG), è stato raccolto per l'esame clinico di routine con il consenso informato del paziente in conformità con il Codice etico dell'Associazione medica mondiale (Dichiarazione di Helsinki) per gli esperi...

Questo articolo presenta il metodo di coltura cellulare primaria come uno strumento veloce e "economico" per studiare diversi aspetti della fisiologia cellulare (pato) come la SLA nel modello di ratto hSOD1G93A . La tecnica è quindi adatta per studi a livello di singola cellula che possono essere estrapolati e ulteriormente studiati a un livello superiore di organizzazione (cioè in fette di tessuto o in un animale vivo). La coltura cellulare come tecnica, tuttavia, ha alcuni avvertimenti. È fondamentale ese...

Le tecniche di coltura cellulare hanno dato origine a numerosi progressi in diversi campi della neurofisiologia cellulare in salute e malattia. In particolare, le colture cellulari primarie, appena isolate dal tessuto neuronale di un animale da laboratorio, consentono allo sperimentatore di studiare da vicino il comportamento di diverse cellule in diversi mezzi biochimici e configurazioni fisiologiche. L'utilizzo di diversi indicatori fisiologici fluorescenti come i coloranti sensibili al Ca2+ in combinazione con la microscopia video time-lapse fornisce una migliore comprensione dei processi biofisici e biochimici cellulari in tempo reale.
La SLA è una malattia neurodegenerativa devastante che colpisce i motoneuroni superiori e inferiori1. La malattia presenta una patogenesi complessa di tipo familiare ma soprattutto della forma sporadica (90% dei casi)2. È noto che i meccanismi autonomi non cellulari contribuiscono alla fisiopatologia della SLA, principalmente a causa del ruolo essenziale delle cellule gliali3. La SLA è anche ben caratterizzata come una malattia neuroinfiammatoria con coinvolgimento di fattori umorali e cellulari di infiammazione.
L'immunoglobulina G è ampiamente usata come marcatore molecolare nella SLA e in altre malattie neurodegenerative. Studiare il livello sierico di questo marcatore può indicare la presenza e lo stadio della neuroinfiammazione nella malattia 4,5,6, mentre la sua presenza nel liquido cerebrospinale può indicare una rottura della barriera ematoencefalica7. Le IgG sono state anche identificate come depositi nei motoneuroni del midollo spinale dei pazienti con SLA7. Tuttavia, questo approccio ha mostrato alcune incongruenze nella correlazione del livello di IgG con lo stadio e le caratteristiche della malattia6.
Le IgG isolate dai sieri dei pazienti affetti da SLA (SLA IgG) possono indurre una risposta al calcio negli astrociti naïve8 e il rilascio di glutammato nei neuroni, indicando un effetto eccitotossico, un segno distintivo della patologia della SLA9. Tuttavia, gli studi sul modello di ratto hSOD1G93A ALS (contenente copie multiple della mutazione umana SOD110) hanno mostrato un numero di marcatori di stress ossidativo in cellule neurogliali in coltura11, tessuti 12,13,14 o animali vivi 13. È interessante notare che gli astrociti coltivati dal modello di ratto SLA erano più inclini allo stress ossidativo indotto dal perossido rispetto agli astroglia dei compagni di cucciolata non transgenici11.
Le cellule microgliali in coltura sono influenzate dalla SLA IgG in modo meno evidente. Vale a dire, una linea cellulare microgliale BV-2 ha mostrato un aumento del segnale dai marcatori fluorescenti dello stress ossidativo in risposta all'applicazione di soli 4/11 campioni di pazienti IgG ALS15. È noto che le microglia partecipano a molte patologie neuroinfiammatorie, aggiungendo stress ossidativo e fase di progressione tardiva nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA16,17. Tuttavia, i dati con le IgG della SLA hanno indicato che queste cellule potrebbero non essere reattive come gli astrociti a questi fattori umorali dell'infiammazione della SLA. Diversi studi sono stati condotti con astrociti primari da modelli murini di SLA, non solo nei cuccioli ma anche in animali sintomatici, sia sul cervello che sul midollo spinale 18,19,20,21. Questo vale anche per le colture primarie microgliali, anche se in misura minore rispetto agli astrociti e per lo più dalle regioni del cervello allo stadio embrionale22,23,24.
Usiamo l'imaging video time-lapse di Ca2+ su cellule in coltura principalmente come mezzo per seguire i transitori intracellulari di questo ione come marker fisiologico di eccitotossicità. Pertanto, mediante la caratterizzazione biofisica di questi transitori (ampiezza, area sotto transitoria, tempo di salita, frequenza) il ricercatore può ottenere parametri diagnostici sperimentali da diversi modelli cellulari di neurodegenerazione. Questa tecnica offre quindi il vantaggio di una valutazione fisiologica quantitativa delle IgG come biomarcatori della malattia. Esiste un ampio corpus di letteratura sul ruolo delle IgG e del Ca2+ nell'induzione della SLA. La maggior parte di questi studi sono stati condotti inducendo la SLA iniettando IgG del paziente in animali da esperimento 25,26,27,28,29, che hanno poi mostrato elevazione intracellulare di Ca 2+ e deposizioni di IgG. Una linea di studi ha esplorato l'effetto delle IgG di SLA sulla sinapsi motoria in vitro30,31,32. Nel contesto di cui sopra, la tecnica qui presentata pone l'attenzione sulle cellule gliali come attori importanti nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA e quantifica la loro potenziale risposta eccitotossica alle IgG come fattori umorali della neuroinfiammazione. Questo approccio può avere un'applicazione più ampia nel testare altri fattori umorali come sieri interi, liquori o citochine in diversi sistemi di coltura cellulare e in modelli cellulari di infiammazione generale.
Questo articolo descrive come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare ulteriormente queste cellule per studiare la fisiopatologia della SLA con IgG derivate dai sieri dei pazienti. I protocolli sono dettagliati per il caricamento del colorante delle cellule in coltura (Figura 1) e le registrazioni dei cambiamenti di Ca2+ negli esperimenti di imaging video time-lapse. Esempi di registrazioni video mostreranno come le cellule gliali reagiscono alle IgG della SLA rispetto all'ATP, quest'ultimo attivando i recettori purinergici della membrana. Viene mostrato per la prima volta un esempio di come gli astrociti isolati dal cervello del ratto hSOD1G93A ALS reagiscono con una risposta Ca 2+ più pronunciata alle IgG di SLA rispetto ai controlli non transgenici e come correlare questo processo alle differenze nel funzionamento del negozio Ca2+. Viene anche mostrato un esempio di imaging del calcio nelle cellule microgliali acutamente sfidate con SLA IgG, con solo una modesta risposta di calcio intracellulare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

Questo protocollo dimostra come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare queste cellule allo scopo di studiare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) nel modello di ratto hSOD1G93A . In primo luogo, il protocollo mostra come isolare e coltivare astrociti e microglia da cortecce postnatali di ratto, e quindi come caratterizzare e testare queste colture per la purezza mediante immunocitochimica utilizzando il marcatore glial fibrillary acidic protein (GFAP) degli astrociti e il marcatore microgliale ionizzato della molecola adattatore legante il calcio 1 (Iba1). Nella fase successiva, vengono descritti i metodi per il caricamento del colorante (Fluo 4-AM sensibile al calcio) delle cellule coltivate e le registrazioni dei cambiamenti di Ca2+ negli esperimenti di imaging video su cellule vive.
Gli esempi di registrazioni video consistono in: (1) casi di imaging Ca2+ di astrociti in coltura acutamente esposti all'immunoglobulina G (IgG) isolata da pazienti affetti da SLA, che mostrano una risposta caratteristica e specifica rispetto alla risposta all'ATP come dimostrato nello stesso esperimento. Gli esempi mostrano anche un aumento transitorio più pronunciato della concentrazione intracellulare di calcio evocato da ALS IgG negli astrociti hSOD1G93A rispetto ai controlli non transgenici; (2) Imaging Ca 2+ di astrociti in coltura durante un esaurimento delle riserve di calcio da parte di thapsigargin (Thg), un inibitore non competitivo del reticolo endoplasmatico Ca 2+ ATPasi, seguito da ingresso di calcio operato dal magazzino indotto dall'aggiunta di calcio nella soluzione di registrazione, che dimostra la differenza tra il funzionamento del magazzino Ca 2+ in hSOD1G93A e negli astrociti non transgenici; (3) L'imaging Ca 2+ della microglia in coltura mostra prevalentemente una mancanza di risposta alle IgG di SLA, mentre l'applicazione di ATP ha provocato un cambiamento di Ca2+. Questo documento sottolinea anche possibili avvertimenti e precauzioni riguardanti la densità cellulare critica e la purezza delle colture, scegliendo la corretta concentrazione del colorante Ca2+ e le tecniche di caricamento del colorante.

Caratterizzazione di diversi tipi di cellule gliali in coltura Di solito ci vogliono 15-21 giorni per produrre astrociti per gli esperimenti, mentre le cellule microgliali impiegano 10-15 giorni per crescere. L'immunocolorazione è stata eseguita per valutare la purezza cellulare della coltura. La Figura 1 mostra l'espressione della doppia marcatura del marcatore astrocitico GFAP e del marcatore microgliale Iba1 nelle rispettive colture.
L'imag...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Presentiamo qui un protocollo su come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia da cortecce di ratto per l'imaging video time-lapse di Ca2+ intracellulare per la ricerca sulla fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica nel modello di ratto hSOD1G93A .

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Questo protocollo consente di rivelare il modello di segnalazione intercellulare del calcio che caratterizza la risposta di ciascun tipo di cellula in salute e in malattia. Questa tecnica consente una caratterizzazione biofisica rapida e dettagliata del comportamento cellulare complesso. Abbiamo in programma di utilizzare questa segnalazione di calcio indotta da IgG come impronta digitale per la medicina personalizzata delle malattie neuroinfiammatorie.Nel contesto della vita reale, non è facile vedere e seguire tutti i processi e gli eventi, specialmente quelli che accadono al microscopio. Quindi, i dati visivi sono importanti. Dopo aver decapitato i cuccioli da uno a tre giorni, esporre il cranio aprendo la pelle con piccole forbici angolate.Quindi aprire il cranio tagliando il forame magno verso le orbite e fare un taglio perpendicolare della linea mediana. Rimuovere il cervello dal cranio e metterlo in una capsula di Petri contenente PBS. Usa la punta della pinza per strappare le connessioni tra entrambi gli emisferi e separa gli emisferi con una pinza curva spingendo delicatamente un emisfero dal centro verso il lato.Utilizzare una pinza dritta e curva per rimuovere le meningi strappandole con cura. Quindi rimuovere l'ippocampo pizzicandolo con una pinza curva e scartarlo, o usarlo per un'altra preparazione di coltura cellulare. Successivamente, trasferire la corteccia in un tubo da 15 millilitri contenente tre millilitri di PBS freddo e omogeneizzare il tessuto pipettando su e giù da 10 a 15 volte con una punta da un millilitro.Centrifugare le cellule a 500 g per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in tre millilitri di PBS freddo mediante pipettaggio con una punta da un millilitro. Centrifugare ancora una volta e risospendere il pellet in due millilitri di DMEM completo integrato con FBS al 10% e antibiotici.Dopo aver trasferito l'omogenato in un tubo da due millilitri, passare l'omogenato attraverso aghi di calibro 21 e 23 per creare una sospensione di singole cellule. Versare la sospensione cellulare preparata da una corteccia in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente tre millilitri di DMEM completo e agitare leggermente la capsula di Petri, in modo che la sospensione sia uniformemente distribuita. Incubare le cellule in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria a 37 gradi Celsius.Per promuovere la crescita degli astrociti, rimuovere i vecchi mezzi e lavare la cellula con PBS preriscaldato per rimuovere le cellule gliali debolmente attaccate e le tracce di FBS una volta raggiunta la confluenza dal 70 all'80%. Quindi tripsinizzare lo strato sottostante di astrociti aggiungendo un millilitro di soluzione di tripsina preriscaldata e incubare a 37 gradi Celsius per due o cinque minuti. Utilizzare un microscopio per verificare se le cellule iniziano a staccarsi e aggiungere quattro millilitri di DMEM completo.Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo da 15 millilitri. Quindi centrifugare il tubo a 500 g per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo completo.Contare le cellule usando un emocitometro. Quindi, preparare il piatto di coltura e aggiungere il terreno di coltura. Riplaccare le celle a una densità da 10 alla quarta cella per centimetro quadrato in cinque millilitri di DMEM completo fresco e lavare le celle con DMEM completo prima di ogni sostituzione del supporto.Dopo aver raggiunto il 70-80% di confluenza, ripetere la tripsinizzazione e seminare cinque volte 10 al terzo astrocita su un vetrino circolare rivestito di poli-L-lisina di sette millimetri. Lasciarli attaccare per 10 minuti e aggiungere DMEM completo. Usali negli esperimenti dopo 48 ore.Dopo aver preparato le colture microgliali, per promuovere la microglia, lasciare che le cellule gliali diventino confluenti e la microglia apparirà sopra lo strato di astrociti dopo 10-15 giorni. Agitare la capsula di Petri su uno shaker orbitale per due ore a 220 giri/min. Ora, lavare leggermente le cellule staccate e attaccate liberamente aspirando il surnatante con una punta di pipetta da un millilitro.Erogare delicatamente il surnatante sullo strato di cellule più volte, assicurandosi di coprire l'intera superficie dello strato cellulare durante questa fase di lavaggio. Raccogliere il mezzo con le celle staccate e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare, risospendere e contare le cellule come dimostrato in precedenza.Seminare cinque volte 10 alla terza microglia su un sottoveste circolare di vetro rivestito di poli-L-lisina di sette millimetri. Lasciarli attaccare per 10 minuti e aggiungere DMEM completo. Usali negli esperimenti dopo 48 ore.Per lavare il DMEM completo, trasferire un vetrino di copertura su un piatto con soluzione extracellulare. Preparare la soluzione di caricamento del colorante diluendo un millimolare Fluo-4 AM con soluzione extracellulare per ottenere la concentrazione finale di cinque micromolari. Posizionare il vetrino di copertura con le celle nella soluzione di caricamento del colorante per 30 minuti a temperatura ambiente al buio e lavare le cellule in soluzione extracellulare per 20 minuti.Posizionare il foglietto di copertura nella camera di registrazione con un millilitro di soluzione di lavoro. Scegli il campo visivo con un numero consistente di celle durante l'esperimento. Avviare l'imaging e determinare la linea di base acquisendo il livello basale di fluorescenza per tre-cinque minuti.Quindi interrompere il flusso della soluzione di lavoro e passare alla soluzione di test per il periodo di tempo desiderato. Tra una soluzione di prova e l'altra, lavare le celle con un flusso costante della soluzione di lavoro per tre-cinque minuti. Mantenere il volume della soluzione nella camera di registrazione a un millilitro organizzando un'aspirazione costante dalla parte superiore della soluzione.Scegliete il fotogramma con intensità di segnale più alta e circondate una cella utilizzando l'applicazione dello strumento Poligonale. Dopo aver circondato tutte le celle nel campo acquisito, scegli cinque aree di interesse in background usando lo strumento Cerchio. Quindi misurare l'intensità media del segnale di una singola cella e lo sfondo per ciascun intervallo di tempo.Selezionare tutte le regioni di interesse e utilizzare il comando Multimisura in ROI Manager in ImageJ o qualsiasi comando equivalente nel software commerciale. Dopo aver importato i dati nel software MATLAB, fai la media di cinque ROI in background e sottrai lo sfondo medio di ciascun fotogramma dall'intensità ROI media dei fotogrammi acquisiti contemporaneamente. Successivamente, analizza l'attività del calcio determinando l'ampiezza del picco di calcio, il cambiamento integrato del transitorio di calcio, il tempo al picco, il tempo di salita, la mezza larghezza e la frequenza.GFAP è usato per visualizzare gli astrociti e Iba1 per visualizzare la microglia. Gli astrociti hSOD1G93A rispondono all'immunoglobulina G SLA con una maggiore ampiezza del transitorio di calcio, un cambiamento integrato complessivo più considerevole e un tempo di picco più breve rispetto agli astrociti non transgenici. La risposta alla SLA immunoglobulina G è distinguibile dalla risposta all'ATP.Gli astrociti hSOD1G93A avevano un livello più elevato di ioni calcio nelle scorte, come rivelato dall'esaurimento delle scorte, indicando un sovraccarico di questo ione. Le microglia sono state coltivate e l'intensità media della fluorescenza è stata estratta nel tempo. Le tracce di calcio di tre cellule rappresentavano che solo una cellula rispondeva all'immunoglobulina G della SLA, mentre tutte le cellule rispondevano all'ATP.Le immagini pseudo-a colori rappresentavano l'intensità della fluorescenza e la linea di base in risposta a SLA, IgG e ATP. Le celle devono essere adeguatamente caricate e i parametri del sistema di imaging devono essere opportunamente regolati, in modo che il segnale non venga separato durante l'esperimento. Insieme all'emissione di calcio, è possibile eseguire il bloccaggio dei cerotti.Pertanto, è possibile ottenere un quadro più completo della correlazione tra le diverse correnti ioniche di membrana e l'emissione di calcio. La comprensione dell'omeostasi intracellulare del calcio è di fondamentale importanza per l'esplorazione di diverse risposte a stimoli naturali, stressanti ed esterni.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Ricerca

Neuroscienze

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

L'uso di traccia Eyeblink condizionamento classico per valutare la disfunzione Hippocampal in un modello del ratto dei disturbi dello spettro fetale alcol

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Aumento del tempo della risposta alla rete alla stimolazione delle colture cellulari neuronali sulle matrici di microelettrodi

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cell-based test per studiare la Clearance di Tau anticorpo-mediato da Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Uso dell'elettroforesi capillare Immunoasis Immunoassay per la ricerca di potenziali biomarcatori della sclerosi laterale amiotrofica nelle piastrine umane

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Uso di neuroni ippocampali coltivati primari per studiare l'assemblaggio dei segmenti iniziali di Axon

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Valutazione della compromissione motoria in modelli di C. elegans di sclerosi laterale amiotrofica

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...