Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

この作業は、セルビア共和国教育科学技術開発省契約番号451-03-9 / 2021-14 / 200178、FENS-NES教育訓練クラスタープロジェクト「神経炎症におけるグリアに関する三国間コース」、およびEC H2020 MSCA RISE助成金#778405によってサポートされました。免疫組織化学画像を提供してくれたMarija AdžićとMina Perić、論文執筆を手伝ってくれたDanijela Bataveljićに感謝します。

すべての実験は、科学的目的のための動物の保護に関するEU指令に従い、ベオグラード大学生物学部の倫理委員会(承認番号EK-BF-2016/08)の許可を得て実施されました。患者材料(IgGの血清)については、ヒトを対象とした実験については、世界医師会倫理綱領(ヘルシンキ宣言)に従って、患者の同意を得た日常的な臨床検査のために収集されました。プロトコルは、セルビア臨床センターの倫理委?...

この論文では、ラットhSOD1G93A モデルにおけるALSなどの細胞(病態)生理学のさまざまな側面を研究するための迅速で「予算内」のツールとして初代細胞培養の方法を紹介します。したがって、この技術は、より高い組織レベル(すなわち、組織スライスまたは生きた動物)で外挿し、さらに調査することができる単一細胞レベルでの研究に適しています。ただし、技術としての細胞培養に...

細胞培養技術は、健康と病気における細胞神経生理学の多様な分野で多くの進歩をもたらしました。特に、実験動物の神経組織から新たに単離された初代細胞培養により、実験者はさまざまな生化学的培地や生理学的設定での多様な細胞の挙動を綿密に研究することができます。Ca2+感受性色素などのさまざまな蛍光生理学的指標をタイムラプスビデオ顕微鏡と組み合わせて使用 すると、細胞の生物物理学的および生化学的プロセスをリアルタイムでよりよく理解できます。
ALSは、上位および下部の運動ニューロンに影響を与える壊滅的な神経変性疾患です1。この病気は家族型の複雑な病因を持っていますが、ほとんどが散発的な型です(症例の90%)2。非細胞自律機構がALS病態生理に寄与することはよく知られており、主にグリア細胞の本質的な役割に起因しています3。ALSはまた、炎症の体液性および細胞性因子の関与を伴う神経炎症性疾患としてよく特徴付けられる。
免疫グロブリンGは、ALSやその他の神経変性疾患の分子マーカーとして広く使用されています。このマーカーの血清レベルを研究することは、疾患における神経炎症の存在および病期を示すことができる4,5,6が、脳脊髄液中のその存在は、血液脳関門7の破れを示すことができる。IgGは、ALS患者の脊髄運動ニューロンにおける沈着物としても同定された7。それにもかかわらず、このアプローチは、IgGのレベルと疾患の病期および特徴との相関においていくつかの矛盾を示しています6。
ALS患者の血清から単離されたIgG(ALS IgG)は、ナイーブアストロサイト8でカルシウム応答を誘導し、ニューロンでグルタミン酸放出を誘発する可能性があり、ALS病理9の特徴である興奮毒性効果を示しています。しかし、hSOD1G93A ALSラットモデル(ヒトSOD1変異10の複数のコピーを含む)に関する研究は、培養神経膠細胞11、組織12、13、14、または生きた動物13において酸化ストレスの多くのマーカーを示した。ALSラットモデルから培養されたアストロサイトは、非トランスジェニック同腹仔からのアストログリアよりも過酸化物によって誘発される酸化ストレスを受けやすいことは注目に値します11。
培養中のミクログリア細胞は、あまり明白ではない方法でALS IgGの影響を受けます。すなわち、BV-2ミクログリア細胞株は、わずか4/11 ALS IgG患者試料の適用に応答して酸化ストレスの蛍光マーカーからのシグナルの上昇を示した15。ミクログリアは多くの神経炎症病理に関与し、ALS16,17の非細胞自律メカニズムにおける酸化ストレスおよび後期進行期を追加することはよく知られている。それにもかかわらず、ALS IgGのデータは、これらの細胞がALS炎症のこれらの体液性因子に対して星状細胞ほど反応性がない可能性があることを示しました。ALSマウスモデルの初代星状細胞を用いて、仔だけでなく、脳または脊髄上の症候性動物においても、いくつかの研究が行われている18,19,20,21。これはミクログリア初代培養にも当てはまりますが、星状細胞ほどではなく、主に胚期の脳領域からのものです22,23,24。
培養中の細胞上のCa2+のタイムラプスビデオイメージングは、主に興奮毒性の生理学的マーカーとしてこのイオンの細胞内過渡性を追跡する手段として使用しています。したがって、これらの過渡現象(振幅、過渡下面積、立ち上がり時間、周波数)の生物物理学的特性評価により、研究者は神経変性の多様な細胞モデルから実験的診断パラメータを得ることができます。したがって、この技術は、疾患バイオマーカーとしてのIgGの定量的生理学的評価の利点を提供します。ALSの誘導におけるIgGとCa2+の役割に関する文献は数多くあります。これらの研究のほとんどは、患者のIgGを実験動物に注射することによってALSを誘導することによって行われ25、26、27、28、29、その後、細胞内Ca2+上昇およびIgG沈着を示した。一連の研究では、in vitroでの運動シナプスに対するALS IgGの効果を調査しました30,31,32。上記の文脈において、ここで提示された技術は、ALSの非細胞自律メカニズムにおける重要なプレーヤーとしてのグリア細胞に焦点を当て、神経炎症の体液性因子としてのIgGに対する潜在的な興奮毒性応答を定量化します。このアプローチは、さまざまな細胞培養システムや一般的な炎症の細胞モデルで、血清全体、CSF、サイトカインなどの他の体液性因子の試験に幅広い用途がある可能性があります。
この論文では、Sprague Dawleyラットの皮質からグリア細胞、アストロサイト、ミクログリアの初代培養物を調製する方法と、これらの細胞をさらに使用して、患者の血清由来IgGによるALS病態生理学を研究する方法について説明します。培養細胞の色素ローディング(図1)とタイムラプスビデオイメージング実験におけるCa2+変化の記録に関するプロトコルが詳しく説明されています。ビデオ録画の例は、グリア細胞がATPと比較してALS IgGにどのように反応するかを示し、後者はプリン作動性膜受容体を活性化します。hSOD1G93A ALSラット脳から単離された星状細胞が、非トランスジェニック対照と比較してALS IgGに対するより顕著なCa2+応答とどのように反応するか、およびこのプロセスをCa2+保存操作の違いに関連付ける方法の例が初めて示されています。また、ALS IgGに急性挑戦されたミクログリア細胞におけるカルシウムイメージングの例も示されており、細胞内カルシウムの反応はわずかです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

このプロトコルは、Sprague Dawleyラットの皮質からグリア細胞、星状細胞、およびミクログリアの初代培養物を調製する方法と、ラットhSOD1G93A モデルにおける筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態生理学を研究する目的でこれらの細胞を使用する方法を示しています。まず、生後ラット皮質から星状細胞とミクログリアを単離して培養する方法を示し、次に、アストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)マーカーとイオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba1)ミクログリアマーカーを使用した免疫細胞化学によって、これらの培養物の純度を特徴付けて試験する方法を示します。次の段階では、培養細胞の色素ローディング(カルシウム感受性Fluo 4-AM)の方法と、生細胞のビデオイメージング実験におけるCa2+ 変化の記録について説明します。
ビデオ録画の例は、(1)ALS患者から単離された免疫グロブリンG(IgG)に急性曝露された培養アストロサイトのCa2+イメージングの症例で構成され、同じ実験で実証されたATPに対する応答と比較して特徴的かつ特異的な応答を示します。実施例はまた、非トランスジェニック対照と比較して、hSOD1G93A星状細胞におけるALS IgGによって誘発される細胞内カルシウム濃度のより顕著な一過性上昇を示しています。(2)小胞体Ca2+ ATPaseの非競合阻害剤であるタプシガルギン(Thg)によるカルシウム貯蔵の枯渇中の培養アストロサイトのCa2+イメージング、続いて記録溶液中のカルシウムの添加によって誘発される貯蔵操作によるカルシウム侵入、これはhSOD1G93Aと非トランスジェニック星状細胞におけるCa2+貯蔵操作の違いを実証する。(3)培養ミクログリアのCa2+イメージングは、主にALS IgGに対する応答の欠如を示し、一方、ATP適用はCa2+変化を誘発した。この論文はまた、重要な細胞密度と培養物の純度、Ca2+色素の正しい濃度の選択、および色素ローディング技術に関して考えられる警告と注意を強調しています。

培養中の異なるグリア細胞タイプの特性評価 実験用の星状細胞を作製するのに通常15〜21日かかりますが、ミクログリア細胞は成長するのに10〜15日かかります。培養物の細胞純度を評価するために免疫染色を行った。 図1 は、それぞれの培養における星状細胞マーカーGFAPおよびミクログリアマーカーIba1の二重標識の発現を示す。
カ?...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

ここでは、hSOD1G93Aラットモデルにおける筋萎縮性側索硬化症の病態生理に関する研究のために、細胞内Ca2+のタイムラプスビデオイメージングのために、ラット皮質からグリア細胞、アストロサイト、およびミクログリアの初代培養を調製する方法に関するプロトコルを紹介します。

ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

このプロトコルは、健康および疾患における各細胞型応答を特徴付ける細胞間カルシウムシグナル伝達パターンを明らかにすることを可能にする。この技術により、複雑な細胞挙動の迅速かつ詳細な生物物理学的特性評価が可能になります。このIgG誘導カルシウムシグナル伝達を、神経炎症性疾患の個別化医療の指紋として使用する予定です。実際の設定では、すべてのプロセスとイベント、特に顕微鏡下で発生するプロセスとイベントを見て追跡することは容易ではありません。したがって、ビジュアルデータは重要です。生後1〜3日の子犬を斬首した後、小さな角度の付いたハサミを使用して皮膚を切り開いて頭蓋骨を露出させます。次に、大孔を軌道に向かって切断して頭蓋骨を開き、垂直正中線を切ります。頭蓋骨から脳を取り除き、PBSを含むペトリ皿に入れます。鉗子の先端を使用して両方の半球間の接続を引き裂き、半球を中央から横にそっと押して、湾曲した鉗子で半球を分離します。まっすぐで湾曲した鉗子を使用して、髄膜を慎重に引き裂いて取り除きます。次に、湾曲した鉗子で海馬をつまんで取り外し、廃棄するか、別の細胞培養準備に使用します。次に、3ミリリットルの冷たいPBSを含む15ミリリットルのチューブに皮質を移し、1ミリリットルの先端で10〜15回上下にピペッティングして組織を均質化します。細胞を500 gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、1ミリリットルのチップでピペッティングすることにより、ペレットを3ミリリットルの冷たいPBSに再懸濁します。もう一度遠心分離し、10%FBSおよび抗生物質を添加した2ミリリットルの完全DMEMにペレットを再懸濁した。ホモジネートを2ミリリットルのチューブに移した後、ホモジネートを21ゲージおよび23ゲージの針に通して、単一細胞の懸濁液を作ります。1つの皮質から調製した細胞懸濁液を3ミリリットルの完全DMEMを含む60ミリメートルのペトリ皿に注ぎ、懸濁液が均一に分布するようにペトリ皿を軽く振る。5%二酸化炭素と95%空気を含む加湿インキュベーターで細胞を摂氏37度でインキュベートします。星状細胞の増殖を促進するには、古い培地を取り除き、予熱したPBSで細胞を洗浄して、70〜80%のコンフルエントに達したら、緩く付着したグリア細胞と微量のFBSを取り除きます。次に、1ミリリットルの予熱したトリプシン溶液を加えて星状細胞の下層をトリプシン処理し、摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。顕微鏡を使用して細胞が剥離し始めるかどうかを確認し、4ミリリットルの完全なDMEMを追加します。細胞懸濁液を集め、それを15ミリリットルのチューブに移します。次に、チューブを500 gで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを1ミリリットルの完全培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。次に、培養皿を準備し、培地を追加します。5ミリリットルの新鮮な完全DMEMに1平方センチメートルあたり10〜4セルの密度で細胞を再プレートし、各培地交換の前に完全なDMEMで細胞を洗浄します。70〜80%のコンフルエントに達した後、トリプシン処理を繰り返し、7ミリメートルのポリL-リジンコーティングされた円形ガラスカバースリップ上に3番目の星状細胞に10回5回播種します。10分間取り付けて、完全なDMEMを追加します。48時間後の実験でそれらを使用してください。ミクログリア培養を準備した後、ミクログリアを促進するために、グリア細胞がコンフルエントになるのを許し、ミクログリアは10〜15日後に星状細胞層の上に現れる。ペトリ皿をオービタルシェーカーで220RPMで2時間振とうします。次に、1ミリリットルのピペットチップで上清を吸引することにより、剥離して緩く付着した細胞を軽く洗浄します。上清を細胞の層に数回静かに分注し、この洗浄ステップ中に細胞層の表面全体を覆うようにします。剥離した細胞を含む培地を収集し、15ミリリットルのチューブに移します。遠心分離、再懸濁、および前述のように細胞をカウントします。7ミリメートルのポリL-リジンコーティングされた円形ガラスカバースリップに10〜3番目のミクログリアを5回播種します。10分間取り付けて、完全なDMEMを追加します。48時間後の実験でそれらを使用してください。完全なDMEMを洗い流すには、1つのカバースリップを細胞外溶液の入った皿に移します。1ミリモルのFluo-4 AMを細胞外溶液で希釈して色素負荷溶液を調製し、最終濃度5マイクロモルを達成します。色素担持溶液に細胞の入ったカバースリップを室温暗所で30分間置き、細胞外溶液で20分間細胞を洗浄する。カバースリップを1ミリリットルの作業溶液と一緒に記録室に置きます。実験全体を通して一貫した数の細胞を有する視野を選択する。イメージングを開始し、3〜5分間蛍光の基礎レベルを取得してベースラインを決定します。次に、作業溶液の流れを停止し、目的の時間だけテスト溶液に切り替えます。各試験溶液の間で、作業溶液の一定の流れで3〜5分間細胞を洗浄する。溶液の上部から一定の吸引を配置することにより、記録チャンバー内の溶液容量を1ミリリットルに保ちます。最も高い信号強度のフレームを選択し、ポリゴンツールアプリケーションを使用して1つのセルを囲みます。取得したフィールド内のすべてのセルを囲んだ後、円ツールを使用して背景の5つの関心領域を選択します。次に、単一セルの平均信号強度と各時間枠の背景を測定します。関心のあるすべての領域を選択し、ImageJのROIマネージャーのマルチメジャーコマンド、または商用ソフトウェアの同等のコマンドを使用します。MATLABソフトウェアでデータをインポートした後、5つのバックグラウンドROIを平均し、同時に取得したフレームの平均ROI強度から各フレームの平均バックグラウンドを差し引きます。その後、カルシウムピークの振幅、カルシウム過渡の積分変化、ピークまでの時間、立ち上がり時間、半値幅、および周波数を決定することにより、カルシウム活性を分析します。GFAPはアストロサイトを可視化するために使用され、Iba1はミクログリアを可視化するために使用されます。hSOD1G93Aアストロサイトは、非トランスジェニックアストロサイトよりもカルシウム一過性の振幅が大きく、全体的な統合変化が大きく、ピークまでの時間が短いALS免疫グロブリンGに応答します。ALS免疫グロブリンGに対する応答は、ATPに対する応答と区別可能である。hSOD1G93A星状細胞は、貯蔵庫の枯渇によって明らかにされたように、貯蔵中のカルシウムイオンのレベルが高く、このイオンの過負荷を示しています。ミクログリアを培養し、平均蛍光強度を経時的に抽出した。3つの細胞のカルシウムトレースは、1つの細胞のみがALS免疫グロブリンGに応答し、すべての細胞がATPに応答したことを表しています。擬似カラー画像は、ALS、IgG、およびATPに応答した蛍光強度およびベースラインを表した。実験中にシグナルが分離されないように、細胞に十分な負荷をかけ、イメージングシステムのパラメータを適切に調整する必要があります。カルシウム放出に加えて、パッチクランプを行うことができます。したがって、異なる膜イオン電流とカルシウム放出との間の相関のより完全な全体像を得ることができる。細胞内カルシウム恒常性の理解は、自然刺激およびストレス刺激および外部刺激に対するいくつかの応答の探索にとって非常に重要です。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

胎児アルコール スペクトルの無秩序のモデルラットにおける海馬機能障害を評価するためにトレース瞬目反射条件づけの使用

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

タウの抗体を介したミクログリアによってクリアランスを勉強するセルベースのアッセイ

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

解離された原発性海馬培養におけるグルタミン酸受容体の密売を研究するための抗体摂食アプローチ

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

ヒト血小板における筋萎縮性側索硬化症の潜在的バイオマーカーを探索するためのキャピラリー電気泳動免疫学的研究法の使用

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

主培養海馬ニューロンを用いた軸索初期セグメントの組み立て研究

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

筋萎縮性側索硬化症の C.エレガンス モデルにおける運動障害の評価

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...