Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

이 작업은 세르비아 공화국 교육 과학 기술 개발부 계약 번호 451-03-9/2021-14/ 200178, FENS - NENS 교육 및 훈련 클러스터 프로젝트 "신경염증의 신경교세포에 대한 삼자 과정" 및 EC H2020 MSCA RISE 보조금 #778405의 지원을 받았습니다. 면역조직화학 이미지를 제공해 주신 Marija Adžić와 Mina Perić, 논문 작성에 도움을 주신 Danijela Bataveljić에게 감사드립니다.

모든 실험은 과학적 목적을위한 동물 보호에 관한 EU 지침과 베오그라드 대학교 생물학 학부 윤리위원회 (승인 번호 EK-BF-2016 / 08)의 허가를 받아 수행되었습니다. 환자 물질 (IgGs에 대한 혈청)에 관해서는 인간을 대상으로 한 실험을 위해 세계 의학 협회 윤리 강령 (헬싱키 선언)에 따라 정보에 입각 한 환자의 동의하에 일상적인 임상 검사를 위해 수집되었습니다. 이 프로토콜은 세르비아 임상 센터...

이 논문은 쥐 hSOD1G93A 모델에서 ALS와 같은 세포(patho)생리학의 다양한 측면을 연구하기 위한 빠르고 "예산에 맞는" 도구로서 일차 세포 배양 방법을 제시합니다. 따라서이 기술은 더 높은 수준의 조직 (즉, 조직 조각 또는 살아있는 동물)에서 외삽되고 추가로 조사 될 수있는 단일 세포 수준의 연구에 적합합니다. 그러나 기술로서의 세포 배양에는 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 얼음 위에서...

세포 배양 기술은 건강 및 질병 분야의 다양한 세포 신경 생리학 분야에서 수많은 발전을 가져 왔습니다. 특히, 실험실 동물의 신경 조직에서 갓 분리 된 1 차 세포 배양을 통해 실험자는 다양한 생화학 적 배지 및 생리 학적 설정에서 다양한 세포의 행동을 면밀히 연구 할 수 있습니다. Ca2+ 민감성 염료와 같은 다양한 형광 생리학적 지표를 타임랩스 비디오 현미경과 함께 사용하면 실시간으로 세포 생물물리학 및 생화학적 과정에 대한 더 나은 통찰력을 얻을 수 있습니다.
ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런에 영향을 미치는 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다1. 이 질병은 가족 유형의 복잡한 발병 기전을 가지고 있지만 대부분 산발적 인 형태 (사례의 90 %)2. 비세포 자율 메커니즘이 ALS 병태생리학에 기여한다는 것은 잘 알려져 있으며, 이는 주로 신경교 세포의 필수적인 역할 때문입니다3. ALS는 또한 염증의 체액 성 및 세포 성 요인의 침범과 함께 신경 염증성 질환으로 잘 특성화됩니다.
면역 글로불린 G는 ALS 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 분자 마커로 널리 사용됩니다. 이 마커의 혈청 수준을 연구하면 질병 4,5,6에서 신경 염증의 존재와 단계를 나타낼 수 있지만 뇌척수액에 존재하면 혈액 뇌 장벽7의 위반을 나타낼 수 있습니다. IgGs는 또한 ALS 환자7의 척수 운동 뉴런에서 침착 된 것으로 확인되었습니다. 그럼에도 불구하고,이 접근법은 IgGs 수준과 질병의 단계 및 특성의 상관 관계에서 약간의 불일치를 보여 주었다6.
ALS 환자의 혈청에서 분리 된 IgG (ALS IgG)는 나이브 성상 세포8에서 칼슘 반응을 유도하고 뉴런에서 글루타메이트 방출을 유도 할 수 있으며, 이는 ALS 병리학9의 특징 인 흥분 독성 효과를 가리킨다. 그러나, hSOD1G93A ALS 래트 모델 (인간 SOD1 돌연변이 10의 다중 카피 함유)에 대한 연구는 배양된 신경교세포 11, 조직 12,13,14, 또는 살아있는 동물13에서 산화 스트레스의 다수의 마커를 보여주었다. ALS 래트 모델로부터 배양된 성상교세포가 비-형질전환 동료로부터의 성상아교세포보다 과산화물에 의해 유도된 산화 스트레스에 더 취약하다는 것은 주목할 만하다1.
배양 물의 소교 세포는 덜 명백한 방식으로 ALS IgG의 영향을받습니다. 즉, BV-2 소교세포 세포주는 단지 4/11 ALS IgG 환자 샘플15의 적용에 반응하여 산화 스트레스의 형광 마커로부터의 신호의 상승을 나타냈다. 미세아교세포는 많은 신경염증성 병리에 참여하여 ALS16,17의 비세포 자율 메커니즘에서 산화 스트레스와 후기 진행 단계를 추가하는 것으로 잘 알려져 있습니다. 그럼에도 불구하고, ALS IgGs를 사용한 데이터는 이들 세포가 ALS 염증의 이러한 체액성 인자에 대해 성상세포만큼 반응적이지 않을 수 있음을 나타내었다. ALS 쥐 모델의 1 차 성상 세포에 대한 여러 연구가 새끼뿐만 아니라 증상이있는 동물, 뇌 또는 척수18,19,20,21에서 수행되었습니다. 이것은 소교 세포 1 차 배양에도 해당되지만, 성상 세포보다 적고 대부분 배아 단계22,23,24의 뇌 영역에서 발생합니다.
우리는 주로 흥분 독성의 생리적 마커로서이 이온의 세포 내 과도 현상을 따르는 수단으로 배양 된 세포에 대한Ca2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 사용합니다. 따라서 이러한 과도 현상 (진폭, 과도 상태에서의 영역, 상승 시간, 주파수)의 생물 물리학 적 특성화를 통해 연구원은 신경 퇴행의 다양한 세포 모델에서 실험적 진단 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 따라서이 기술은 질병 바이오 마커로서 IgGs의 정량적 생리 학적 평가의 이점을 제공합니다. ALS의 유도에서 IgGs 및Ca2+의 역할에 관한 많은 문헌이 있다. 이들 연구의 대부분은 환자 IgG를 실험 동물25,26,27,28,29에 주입하여 ALS를 유도함으로써 수행되었으며, 이어서 세포 내Ca2+ 상승 및 IgG 침착을 나타내었다. 일련의 연구는 시험관 내 운동 시냅스에 대한 ALS IgG의 효과를 조사했습니다. 30,31,32. 위의 맥락에서 여기에 제시된 기술은 ALS의 비 세포 자율 메커니즘에서 중요한 역할을하는 신경교 세포에 초점을 맞추고 신경 염증의 체액 성 요인으로서 IgG에 대한 잠재적 인 흥분 독성 반응을 정량화합니다. 이 접근법은 다른 세포 배양 시스템 및 일반적인 염증의 세포 모델에서 전체 혈청, CSF 또는 사이토 카인과 같은 다른 체액 성 인자를 테스트하는 데 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.
이 논문은 Sprague Dawley 쥐의 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법과 이러한 세포를 추가로 사용하여 환자 혈청 유래 IgG로 ALS 병태 생리학을 연구하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 배양된 세포의 염료 로딩(그림 1) 및 타임랩스 비디오 이미징 실험에서 Ca2+ 변화의 기록에 대해 자세히 설명되어 있습니다. 비디오 녹화의 예는 신경교 세포가 ATP와 비교하여 ALS IgG에 어떻게 반응하는지 보여줄 것이며, 후자는 퓨린성 막 수용체를 활성화합니다. hSOD1G93A ALS 래트 뇌로부터 분리된 성상세포가 비-형질전환 대조군과 비교하여 ALS IgG에 대해 더 뚜렷한Ca 2 + 반응과 어떻게 반응하는지, 그리고 이 과정을Ca2+ 저장 작업의 차이와 연관시키는 방법에 대한 예가 처음으로 도시되었다. 또한 ALS IgG로 심각하게 도전받는 소교 세포에서 칼슘 이미징의 예가 나와 있으며 세포 내 칼슘의 반응은 미미합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐의 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법과 쥐 hSOD1G93A 모델에서 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)의 병태 생리학을 연구 할 목적으로 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 프로토콜은 출생 후 쥐 피질에서 성상 세포와 미세 아교 세포를 분리 및 배양하는 방법을 보여 주며, 성상 세포의 신경교 섬유 산성 단백질 (GFAP) 마커와 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba1) 소교 세포 마커를 사용하여 면역 세포 화학에 의해 이러한 배양의 순도를 특성화하고 테스트하는 방법을 보여줍니다. 다음 단계에서는 배양 된 세포의 염료 로딩 (칼슘 민감성 Fluo 4-AM) 및 살아있는 세포에 대한 비디오 이미징 실험에서 Ca2+ 변화의 기록에 대한 방법을 설명합니다.
비디오 녹화의 예는 다음으로 구성됩니다 : (1) ALS 환자로부터 분리 된 면역 글로불린 G (IgG)에 급성으로 노출 된 배양 된 성상 세포의Ca 2+ 이미징 사례는 동일한 실험에서 입증 된 바와 같이 ATP에 대한 반응과 비교하여 특징적이고 특이적인 반응을 나타낸다. 예는 또한 비 형질 전환 대조군과 비교하여 hSOD1G93A 성상 세포에서 ALS IgG에 의해 유발되는 세포 내 칼슘 농도의 더 뚜렷한 일시적인 상승을 보여줍니다. (2) 소포체Ca2+ ATPase의 비경쟁적 억제제인 타프시가르긴(Thg)에 의한 칼슘 저장고갈 동안 배양된 성상세포의Ca2+ 이미징, 이어서 기록 용액에 칼슘을 첨가하여 유도된 저장 작동식 칼슘 진입, 이는 hSOD1G93A 및 비-형질전환 성상세포에서의Ca 2+ 저장 작업 간의 차이를 입증함; (3) 배양된 미세아교세포의 Ca2+ 영상화는 주로 ALS IgG에 대한 반응의 결여를 나타내는 반면, ATP 적용은Ca2+ 변화를 유도하였다. 이 논문은 또한 Ca2+ 염료 및 염료 로딩 기술의 올바른 농도를 선택하여 중요한 세포 밀도 및 배양 순도와 관련하여 가능한 주의 사항 및 주의 사항을 강조합니다.

배양에서 다양한 신경교 세포 유형의 특성 분석 실험을 위해 성상 세포를 생산하는 데 보통 15-21 일이 걸리는 반면, 소교 세포는 자라는 데 10-15 일이 걸립니다. 배양물의 세포 순도를 평가하기 위해 면역염색을 수행하였다. 도 1 은 각각의 배양물에서 성상세포 마커 GFAP 및 미세아교세포 마커 Iba1의 이중 표지의 발현을 나타낸 것이다.
칼슘 ...

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Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

우리는 hSOD1G93A 쥐 모델에서 근 위축성 측삭 경화증의 병태 생리학에 대한 연구를 위해 세포 내Ca 2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 위해 쥐 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.

쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

이 프로토콜을 사용하면 질병뿐만 아니라 건강에서도 각 세포 유형 반응을 특징 짓는 세포 간 칼슘 신호 패턴을 밝힐 수 있습니다. 이 기술은 복잡한 세포 행동의 빠르고 상세한 생물 물리학 적 특성을 가능하게합니다. 우리는 이 IgG 유도 칼슘 신호 전달을 신경염증 질환의 개인화된 의학을 위한 지문으로 사용할 계획입니다.실제 환경에서는 모든 과정과 사건, 특히 현미경으로 일어나는 사건을보고 따라가는 것이 쉽지 않습니다. 따라서 시각적 데이터가 중요합니다. 생후 1-3 일 된 새끼를 참수 한 후 작은 각진 가위로 피부를 잘라 두개골을 노출시킵니다.그런 다음 궤도를 향해 구멍 매그넘을 절단하여 두개골을 열고 수직 정중선 절단을합니다. 두개골에서 뇌를 제거하고 PBS가 들어있는 페트리 접시에 넣으십시오. 집게의 끝을 사용하여 두 반구 사이의 연결을 찢고 반구를 중앙에서 옆으로 부드럽게 밀어 구부러진 집게로 반구를 분리합니다.직선 및 곡선 집게를 사용하여 수막을 조심스럽게 찢어 제거합니다. 그런 다음 구부러진 집게로 꼬집어 해마를 제거하고 버리거나 다른 세포 배양 준비에 사용하십시오. 다음으로, 피질을 3 밀리리터의 차가운 PBS가 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮기고 1 밀리리터 팁으로 10-15 회 위아래로 피펫팅하여 조직을 균질화합니다.세포를 500g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 1밀리리터 팁으로 피펫팅하여 3밀리리터의 차가운 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 다시 한 번 원심분리하고 10%FBS와 항생제가 보충된 완전한 DMEM 2ml에 펠릿을 재현탁합니다.균질 액을 2 밀리리터 튜브로 옮긴 후, 균질 액을 21 및 23 게이지 바늘에 통과시켜 단일 세포의 현탁액을 만듭니다. 하나의 피질에서 준비된 세포 현탁액을 3 밀리리터의 완전한 DMEM이 들어있는 60 밀리미터의 페트리 접시에 붓고 페트리 접시를 가볍게 흔들어 현탁액이 균일하게 분포되도록합니다. 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소와 95 % 공기가있는 가습 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.성상 세포 성장을 촉진하려면 오래된 배지를 제거하고 예열 된 PBS로 세포를 세척하여 느슨하게 부착 된 신경교 세포와 FBS의 흔적을 제거하면 70-80 % confluency에 도달합니다. 그런 다음 예열 된 트립신 용액 1 밀리리터를 추가하여 성상 세포의 밑에있는 층을 트립신 화하고 섭씨 37도에서 2-5 분 동안 배양합니다. 현미경을 사용하여 세포가 분리되기 시작하는지 확인하고 4밀리리터의 완전한 DMEM을 추가합니다.세포 현탁액을 모아서 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 500g에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 상청액을 버리고 펠릿을 완전한 배지 1ml에 재현탁합니다.혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 다음으로, 배양 접시를 준비하고 배양 배지를 첨가한다. 세포를 5밀리리터의 새로운 완전한 DMEM에서 평방 센티미터당 10 내지 제4 세포의 밀도로 재플레이트하고, 각각의 배지 교체 전에 완전한 DMEM으로 세포를 세척한다.70 내지 80% confluency에 도달한 후, 트립신 화를 반복하고, 7 밀리미터의 폴리-L-라이신-코팅된 원형 유리 커버 슬립에 제3 성상세포를 10회 5회 시드한다. 10분 동안 부착하고 완전한 DMEM을 추가합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오.소교세포 배양을 준비한 후 미세아교세포를 촉진하기 위해 신경교세포가 합류하도록 하고 10-15일 후에 미세아교세포가 성상교세포 층 위에 나타납니다. 오비탈 셰이커에서 페트리 접시를 220RPM에서 2시간 동안 흔듭니다. 이제 1 밀리리터 피펫 팁으로 상청액을 흡인하여 분리되고 느슨하게 부착 된 세포를 가볍게 씻으십시오.상청액을 세포 층에 여러 번 부드럽게 분배하여 이 세척 단계 동안 전체 세포층 표면을 덮도록 합니다. 분리 된 세포가있는 배지를 수집하여 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 원심분리하고, 재현탁하고, 앞에서 설명한 대로 세포를 계수합니다.3차 미세아교세포에 10번 5번 시드하여 7-밀리미터의 폴리L-라이신이 코팅된 원형 유리 커버 슬립. 10분 동안 부착하고 완전한 DMEM을 추가합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오.전체 DMEM을 씻어 내려면 하나의 커버 슬립을 세포 외 용액이 담긴 접시에 옮깁니다. 5 마이크로 몰의 최종 농도를 달성하기 위해 1 밀리몰 Fluo-4 AM을 세포 외 용액으로 희석하여 염료 로딩 용액을 준비하십시오. 세포와 함께 커버 슬립을 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 염색 로딩 용액에 넣고, 세포를 세포외 용액으로 20분 동안 세척한다.커버 슬립을 1 밀리리터의 작업 용액으로 기록실에 놓습니다. 실험 전체에서 일관된 수의 셀을 갖는 시야를 선택합니다. 이미징을 시작하고 3-5분 동안 형광의 기본 수준을 획득하여 기준선을 결정합니다.그런 다음 작업 용액의 흐름을 중지하고 원하는 시간 동안 테스트 용액으로 전환하십시오. 각 시험 용액 사이에서 3 분에서 5 분 동안 일정한 작업 용액의 흐름으로 세포를 씻으십시오. 용액 상단에서 일정한 흡입을 배열하여 기록 챔버의 용액 부피를 1 밀리리터로 유지하십시오.신호 강도가 가장 높은 프레임을 선택하고 Polygonal 도구 응용 프로그램을 사용하여 하나의 셀을 둘러쌉니다. 획득한 필드의 모든 셀을 둘러싼 후 원 도구를 사용하여 배경에서 관심 영역 5개를 선택합니다. 그런 다음 단일 셀의 평균 신호 강도와 각 시간대의 배경을 측정합니다.관심 있는 모든 영역을 선택하고 ImageJ의 ROI 관리자에서 다중 측정 명령을 사용하거나 상용 소프트웨어에서 이와 동등한 명령을 사용합니다. MATLAB 소프트웨어에서 데이터를 가져온 후 5개의 배경 ROI를 평균하고 동시에 획득한 프레임의 평균 ROI 강도에서 각 프레임의 평균 배경을 뺍니다. 나중에 칼슘 피크의 진폭, 과도 칼슘의 통합 변화, 피크까지의 시간, 상승 시간, 반폭 및 주파수를 결정하여 칼슘 활성을 분석합니다.GFAP는 성상 세포를 시각화하고 Iba1을 시각화하여 미세 아교 세포를 시각화하는 데 사용됩니다. hSOD1G93A 성상 세포는 ALS 면역 글로불린 G에 반응하여 칼슘 과도 현상의 진폭이 더 크고, 전체적으로 더 상당한 통합 변화가 있으며, 비 형질 전환 성상 세포보다 피크까지의 시간이 짧습니다. ALS 면역 글로불린 G에 대한 반응은 ATP에 대한 반응과 구별 될 수 있습니다.hSOD1G93A 성상 세포는 저장 고갈에 의해 밝혀진 바와 같이 저장소에서 더 높은 수준의 칼슘 이온을 가졌으며,이 이온의 과부하를 나타냅니다. 미세아교세포를 배양하고, 시간 경과에 따른 평균 형광 강도를 추출하였다. 3 개의 세포의 칼슘 흔적은 하나의 세포 만이 ALS 면역 글로불린 G에 반응하는 반면 모든 세포는 ATP에 반응한다는 것을 나타 냈습니다.의사 컬러 이미지는 ALS, IgG 및 ATP에 대한 반응의 형광 강도 및 기준선을 나타냅니다. 세포는 적절하게 로드되어야 하고 이미징 시스템의 매개변수는 실험 중에 신호가 분리되지 않도록 적절하게 조정되어야 합니다. 칼슘 방출과 함께 패치 클램핑을 수행할 수 있습니다.따라서, 상이한 막 이온 전류와 칼슘 방출 사이의 상관 관계에 대한보다 완전한 그림이 얻어 질 수있다. 세포 내 칼슘 항상성에 대한 이해는 스트레스가 많은 외부 자극뿐만 아니라 자연적 자극에 대한 여러 반응을 탐구하는 데 필수적입니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

연구

신경과학

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

태아 알코올 스펙트럼 장애의 쥐 모델에서 Hippocampal 기능 장애를 평가 하기 위해 추적 Eyeblink 클래식 컨디셔닝의 사용

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Microglia에 의해 항 체 중재 타우 정리 공부 세포 기반 분석 결과

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

해리 된 기본 해 마 문화에서 조미료 수용 체 인신 매매를 연구 하는 항 체 먹이 접근

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

인간 혈소판에서 근위축성 측삭 경화증의 잠재적인 바이오마커를 검색하기 위해 모세관 전기 영동 면역 분석사용

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

축 사 초기 세그먼트의 조립을 공부 하는 기본 배양 된 해마 뉴런의 사용

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

근위축성 측삭 경화증의 C. 엘레간 모델의 모터 손상 평가

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...