Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av departementet for utdanning vitenskap og teknologisk utvikling Republikken Serbia kontrakt nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, FENS - NENS Education and Training Cluster-prosjektet "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation", og EC H2020 MSCA RISE-stipend #778405. Vi takker Marija Adžić og Mina Perić for å levere immunhistokjemibildene og Danijela Bataveljić for hjelp med papirskriving.

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med EU-direktivene om beskyttelse av dyr for vitenskapelige formål og med tillatelse fra Den etiske kommisjonen ved Det biologiske fakultet, Universitetet i Beograd (godkjenningsnummer EK-BF-2016/08). Når det gjelder pasientmateriale (sera for IgGs), ble det samlet inn til rutinemessig klinisk undersøkelse med informert pasientens samtykke i henhold til Verdens legeforenings etiske retningslinjer (Helsinkideklarasjonen) for forsøk med mennesker. Protokollen ble godkjent av eti...

Denne artikkelen presenterer metoden for primærcelledyrking som et raskt og "på budsjettet" verktøy for å studere ulike aspekter av celle (pato) fysiologi som ALS i rotte hSOD1G93A-modellen . Teknikken er dermed egnet for studier på enkeltcellenivå som kan ekstrapoleres og undersøkes videre på et høyere organisasjonsnivå (dvs. i vevsskiver eller i et levende dyr). Celledyrking som teknikk har imidlertid noen forbehold. Det er mest kritisk å gjøre hjernevevisolasjon og dissosiasjon av celler på is ...

Cellekulturteknikker har gitt opphav til mange fremskritt innen ulike felt av cellulær nevrofysiologi innen helse og sykdom. Spesielt tillater primære cellekulturer, nylig isolert fra nevronvevet til et laboratoriedyr, eksperimentøren å studere oppførselen til forskjellige celler i forskjellige biokjemiske medier og fysiologiske oppsett. Bruk av forskjellige fluorescerende fysiologiske indikatorer som Ca2+-sensitive fargestoffer i kombinasjon med time-lapse videomikroskopi gir bedre innsikt i de cellulære biofysiske og biokjemiske prosessene i sanntid.
ALS er en ødeleggende nevrodegenerativ sykdom som påvirker øvre og nedre motorneuroner1. Sykdommen har en kompleks patogenese av familiær type, men hovedsakelig av sporadisk form (90% av tilfellene)2. Det er velkjent at ikke-celle autonome mekanismer bidrar til ALS patofysiologi, hovedsakelig på grunn av den essensielle rollen til gliaceller3. ALS er også godt karakterisert som en nevroinflammatorisk sykdom med involvering av humorale og cellulære faktorer av betennelse.
Immunoglobulin G er mye brukt som en molekylær markør i ALS og andre nevrodegenerative sykdommer. Å studere serumnivået til denne markøren kan indikere tilstedeværelsen og stadiet av nevroinflammasjon i sykdommen 4,5,6, mens dens tilstedeværelse i cerebrospinalvæsken kan indikere et brudd på blodhjernebarrieren7. IgG ble også identifisert som avleiringer i ryggmargsmotornevronene hos ALS-pasienter7. Likevel har denne tilnærmingen vist noen uoverensstemmelser i korrelasjonen av nivået av IgG med stadium og egenskaper av sykdommen6.
IgG isolert fra sera hos ALS-pasienter (ALS IgG) kan indusere kalsiumrespons i naive astrocytter8 og glutamatfrigjøring i nevroner, noe som peker på en excitotoksisk effekt - et kjennetegn på ALS-patologi9. Studier på hSOD1G93A ALS-rottemodellen (som inneholder flere kopier av den humane SOD1-mutasjonen10) viste imidlertid en rekke markører for oksidativt stress i dyrkede neurogliaceller11, vev 12,13,14 eller levende dyr 13. Det er bemerkelsesverdig at astrocytter dyrket fra ALS-rottemodellen var mer utsatt for oksidativt stress indusert av peroksid enn astroglia fra ikke-transgene kullkamerater11.
Mikrogliaceller i kultur påvirkes av ALS IgG på en mindre tydelig måte. Nemlig viste en BV-2 mikroglialcellelinje en økning i signalet fra fluorescerende markører for oksidativt stress som svar på anvendelsen av bare 4/11 ALS IgG-pasientprøver15. Det er velkjent at mikroglia deltar i mange nevroinflammatoriske patologier, og legger til oksidativt stress og sen progresjonsfase i den ikke-celle autonome mekanismen til ALS16,17. Likevel indikerte dataene med ALS IgGs at disse cellene kanskje ikke er like reaktive som astrocytter til disse humorale faktorene for ALS-betennelse. Flere studier har blitt utført med primære astrocytter fra ALS murine modeller, ikke bare hos valper, men også hos symptomatiske dyr, enten på hjernen eller på ryggmargen 18,19,20,21. Dette gjelder også for mikrogliale primærkulturer, men i mindre grad enn astrocytter og hovedsakelig fra hjernegrupper på embryostadiet22,23,24.
Vi bruker time-lapse videoavbildning av Ca2+ på celler i dyrkning primært som et middel til å følge intracellulære transienter av dette ionet som en fysiologisk markør for eksitotoksisitet. Ved biofysisk karakterisering av disse transientene (amplitude, areal under forbigående, stigningstid, frekvens) kan forskeren således oppnå eksperimentelle diagnostiske parametere fra ulike cellulære modeller av nevrodegenerasjon. Denne teknikken gir dermed en fordel av en kvantitativ fysiologisk vurdering av IgG som sykdomsbiomarkører. Det finnes en stor mengde litteratur om rollen til IgGs og Ca2+ i induksjonen av ALS. De fleste av disse studiene ble utført ved å indusere ALS ved å injisere pasient IgGs i eksperimentelle dyr 25,26,27,28,29, som deretter viste intracellulær Ca 2+ høyde og IgG-avsetninger. En rekke studier undersøkte effekten av ALS IgGs på motorsynapsen in vitro30,31,32. I ovennevnte sammenheng setter teknikken som presenteres her fokus på glialcellene som viktige aktører i den ikke-celle autonome mekanismen til ALS og kvantifiserer deres potensielle excitotoksiske respons på IgGs som humorale faktorer for nevroinflammasjon. Denne tilnærmingen kan ha en bredere anvendelse i testing av andre humorale faktorer som hele sera, CSF eller cytokiner i forskjellige cellekultursystemer og i cellulære modeller av generell betennelse.
Dette papiret beskriver hvordan man forbereder primære kulturer av gliaceller, astrocytter og mikroglia fra cortices av Sprague Dawley-rotter og hvordan man videre kan bruke disse cellene til å studere ALS-patofysiologi med pasient sera-avledet IgG. Protokoller er detaljerte for fargestoffbelastning av dyrkede celler (figur 1) og opptak av Ca2+ endringer i time-lapse videoavbildningseksperimenter. Eksempler på videoopptak vil vise hvordan gliaceller reagerer på ALS IgG sammenlignet med ATP, sistnevnte aktiverer purinerge membranreseptorer. Vist for første gang er et eksempel på hvordan astrocytter isolert fra hSOD1G93A ALS rottehjerne reagerer med en mer uttalt Ca 2+ respons på ALS IgG sammenlignet med ikke-transgene kontroller og hvordan man relaterer denne prosessen til forskjellene i Ca2+ butikkdrift. Også vist er et eksempel på kalsiumavbildning i mikrogliaceller akutt utfordret med ALS IgG, med bare en beskjeden respons av intracellulært kalsium.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

Denne protokollen demonstrerer hvordan man forbereder primære kulturer av gliaceller, astrocytter og mikroglia fra cortices av Sprague Dawley-rotter og hvordan man bruker disse cellene med det formål å studere patofysiologien til amyotrofisk lateral sklerose (ALS) i rotte hSOD1G93A-modellen . Først viser protokollen hvordan man isolerer og dyrker astrocytter og mikroglia fra postnatale rottekortiser, og deretter hvordan man karakteriserer og tester disse kulturene for renhet ved immuncytokjemi ved hjelp av glial fibrillært surt protein (GFAP) markør av astrocytter og det ioniserte kalsiumbindende adaptermolekylet 1 (Iba1) mikroglialmarkør. I neste trinn beskrives metoder for fargestoffbelastning (kalsiumfølsom Fluo 4-AM) av dyrkede celler og opptak av Ca2+ endringer i videoavbildningseksperimenter på levende celler.
Eksemplene på videoopptak består av: (1) tilfeller av Ca2+ avbildning av dyrkede astrocytter akutt eksponert for immunglobulin G (IgG) isolert fra ALS-pasienter, som viser en karakteristisk og spesifikk respons sammenlignet med responsen på ATP som vist i samme eksperiment. Eksempler viser også en mer uttalt forbigående økning i intracellulær kalsiumkonsentrasjon fremkalt av ALS IgG i hSOD1G93A-astrocytter sammenlignet med ikke-transgene kontroller; (2) Ca 2+ avbildning av dyrkede astrocytter under uttømming av kalsiumlagre av thapsigargin (Thg), en ikke-konkurrerende hemmer av endoplasmatisk retikulum Ca 2+ ATPase, etterfulgt av butikkoperert kalsiuminngang fremkalt ved tilsetning av kalsium i opptaksløsningen, noe som viser forskjellen mellom Ca 2+ butikkdrift i hSOD1G93A og i ikke-transgene astrocytter; (3) Ca 2+ avbildning av dyrkede mikroglia viser overveiende mangel på respons på ALS IgG, mens ATP-applikasjon fremkalte en Ca2+ endring. Dette papiret legger også vekt på mulige advarsler og advarsler angående kritisk celletetthet og renhet av kulturer, og velger riktig konsentrasjon av Ca2 + fargestoff og fargestoffbelastningsteknikker.

Karakterisering av forskjellige gliacelletyper i kultur Det tar vanligvis 15-21 dager å produsere astrocytter for eksperimenter, mens mikrogliaceller tar 10-15 dager å vokse. Immunostaining ble utført for å vurdere cellens renhet av kulturen. Figur 1 viser uttrykket for dobbeltmerking av den astrocytiske markøren GFAP og mikroglialmarkøren Iba1 i respektive kulturer.
Kalsiumavbildning er kjent for å avsløre forskjellene i cellefysiologi...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Vi presenterer her en protokoll om hvordan man forbereder primærkulturer av gliaceller, astrocytter og mikroglia fra rottekortiser for time-lapse videoavbildning av intracellulær Ca2+ for forskning på patofysiologi av amyotrofisk lateral sklerose i hSOD1G93A rottemodell.

Primærkulturer av rotteastrocytter og mikroglia og deres bruk i studien av amyotrofisk lateral sklerose

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Denne protokollen gjør det mulig å avsløre intercellulært kalsiumsignaleringsmønster som karakteriserer hver celletyperespons i helse så vel som i sykdom. Denne teknikken tillater rask og detaljert biofysisk karakterisering av kompleks cellulær oppførsel. Vi planlegger å bruke denne IgG-induserte kalsiumsignaleringen som et fingeravtrykk for personlig medisin av nevroinflammatoriske sykdommer.I det virkelige liv er det ikke lett å se og følge alle prosesser og hendelser, spesielt de som skjer under mikroskopet. Derfor er de visuelle dataene viktige. Etter å ha halshugget en til tre dager gamle valper, utsett skallen ved å kutte opp huden ved hjelp av små vinklede sakser.Åpne deretter skallen ved å kutte foramen magnum mot banene og lage et vinkelrett midtlinjekutt. Fjern hjernen fra skallen, og legg den i en petriskål som inneholder PBS. Bruk spissen av tangen til å rive forbindelsene mellom begge halvkule, og skill halvkulene med buede tang ved å skyve en halvkule forsiktig fra midten til siden.Bruk rette og buede tang for å fjerne meningene ved å rive dem forsiktig. Fjern deretter hippocampus ved å klemme den med buede tang, og kast den, eller bruk den til et annet cellekulturpreparat. Deretter overfører du cortex til et 15 milliliter rør som inneholder tre milliliter kald PBS og homogeniserer vevet ved pipettering opp og ned 10 til 15 ganger med en milliliter spiss.Sentrifuger cellene ved 500 g i fem minutter. Kast supernatanten og resuspend pelleten i tre milliliter kald PBS ved pipettering med en milliliter spiss. Sentrifuge igjen, og resuspendere pelleten i to milliliter komplett DMEM supplert med 10% FBS og antibiotika.Etter å ha overført homogenatet til et to milliliter rør, pass homogenatet gjennom 21 og 23-gauge nåler for å lage en suspensjon av enkeltceller. Hell cellesuspensjonen tilberedt fra en cortex i en 60 millimeter petriskål som inneholder tre milliliter fullstendig DMEM, og rist petriskålen lett, slik at suspensjonen er jevnt fordelt. Inkuber cellene i en fuktet inkubator med 5% karbondioksid og 95% luft ved 37 grader Celsius.For å fremme astrocytvekst, fjern det gamle mediet og vask cellen med forvarmet PBS for å fjerne de løst vedlagte glialcellene og sporene av FBS når de oppnår 70 til 80% sammenløp. Prøv deretter det underliggende laget av astrocytter ved å tilsette en milliliter forvarmet trypsinløsning og inkubere ved 37 grader Celsius i to til fem minutter. Bruk et mikroskop for å sjekke om cellene begynner å løsne, og legg til fire milliliter fullstendig DMEM.Samle cellesuspensjonen, og overfør den til et 15 milliliter rør. Sentrifuger deretter røret på 500 g i fem minutter. Kast supernatanten og resuspend pelleten i en milliliter komplett medium.Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer. Deretter tilbereder du kulturretten og legger til kulturmedium. Replate cellene i en tetthet på 10 til fjerde celler per kvadratcentimeter i fem milliliter fersk komplett DMEM og vask cellene med fullstendig DMEM før hver medieutskifting.Etter å ha nådd 70 til 80% sammenheng, gjenta trypsinisering, og frø fem ganger 10 til de tredje astrocytter på en syv millimeter poly-L-lysinbelagt sirkulær glassdeksel. La dem feste i 10 minutter, og legg til fullstendig DMEM. Bruk dem i eksperimenter etter 48 timer.Etter å ha forberedt mikroglialkulturene, for å fremme mikroglia, la glialcellene bli sammenflytende og mikroglia vil vises på toppen av astrocyttlaget etter 10 til 15 dager. Rist petriskålen på en orbital shaker i to timer ved 220 o / min. Nå vasker du lett de frittliggende og løst festede cellene ved å aspirere supernatanten med en milliliter pipettespiss.Dispenser supernatanten forsiktig på cellelaget flere ganger, og sørg for å dekke hele cellelagets overflate under dette vasketrinnet. Samle mediet med de frittliggende cellene, og overfør det til et 15 milliliter rør. Sentrifuge, resuspendere, og telle cellene som vist tidligere.Frø fem ganger 10 til tredje mikroglia på en syv millimeter poly-L-lysinbelagt sirkulær glassdeksel. La dem feste i 10 minutter og legg til fullstendig DMEM. Bruk dem i eksperimenter etter 48 timer.For å vaske ut hele DMEM, overfør en dekselslipp til en tallerken med ekstracellulær løsning. Forbered fargestoffbelastningsløsningen ved å fortynne en millimolar Fluo-4 AM med ekstracellulær løsning for å oppnå den endelige konsentrasjonen av fem mikromolarer. Plasser dekselet med celler i fargestoffbelastningsløsningen i 30 minutter ved romtemperatur i mørket, og vask cellene i ekstracellulær løsning i 20 minutter.Plasser dekselet i opptakskammeret med en milliliter arbeidsløsning. Velg synsfeltet som har et konsekvent antall celler gjennom hele eksperimentet. Start avbildningen og bestem grunnlinjen ved å skaffe basalnivået av fluorescens i tre til fem minutter.Stopp deretter strømmen av arbeidsløsningen, og bytt til testløsningen i ønsket tidsperiode. Mellom hver testløsning, vask cellene med en konstant strøm av arbeidsløsningen i tre til fem minutter. Hold løsningsvolumet i opptakskammeret på en milliliter ved å arrangere et konstant sug fra toppen av løsningen.Velg rammen med høyest signalintensitet, og omring én celle ved hjelp av programmet Polygonal Tool. Når du har omringet alle cellene i det oppkjøpte feltet, velger du fem interesseområder i bakgrunnen ved hjelp av sirkelverktøyet. Mål deretter den gjennomsnittlige signalintensiteten til en enkelt celle og bakgrunnen for hver tidsramme.Velg alle interesseområder, og bruk Multi-Measure-kommandoen i ROI Manager i ImageJ, eller en tilsvarende kommando i kommersiell programvare. Etter å ha importert dataene i MATLAB-programvaren, gjennomsnittlig fem bakgrunnsavkastninger og trekk den gjennomsnittlige bakgrunnen til hver ramme fra den gjennomsnittlige ROI-intensiteten til rammene som er oppnådd samtidig. Senere analyserer kalsiumaktiviteten ved å bestemme amplituden til kalsiumtoppen, den integrerte endringen av kalsiumtransienten, tid til topp, stigningstid, halvbredde og frekvens.GFAP brukes til å visualisere astrocytter og Iba1 for å visualisere microglia. hSOD1G93A-astrocytter responderer på ALS-immunglobulin G med større amplitude av kalsiumtransienten, en mer betydelig samlet integrert endring og kortere tid til topp enn ikke-transgene astrocytter. Responsen på ALS-immunoglobulin G kan skilles fra responsen på ATP.hSOD1G93A-astrocytter hadde et høyere nivå av kalsiumioner i butikkene som avslørt ved uttømming av butikken, noe som indikerer en overbelastning av dette ionet. Microglia ble dyrket, og den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten ble ekstrahert over tid. Kalsiumsporene til tre celler representerte at bare en celle reagerte på ALS-immunoglobulin G, mens alle celler reagerte på ATP.Pseudofargebildene representerte fluorescensintensiteten og grunnlinjen som svar på ALS, IgG og ATP. Cellene må være tilstrekkelig lastet og parametrene til bildesystemet må justeres på riktig måte, slik at signalet ikke skilles under forsøket. Sammen med kalsiumemitterende kan patchklemming utføres.Dermed kan man få et mer komplett bilde av korrelasjonen mellom ulike membranionestrømmer og kalsiumemittering. Forståelsen av intracellulær kalsiumhomeostase er av avgjørende betydning for utforskning av flere responser på naturlige så vel som stressende og eksterne stimuli.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll for Tredimensjonal Confocal Morfometrisk Analyse av Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Bruk av spor Eyeblink klassisk betinging å vurdere hippocampus dysfunksjon i en rotte modell av Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Rask og raffinert CD11b Magnetic Isolering av Primary Microglia med Enhanced Purity og allsidighet

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsavhengig økning i nettverksresponsen til stimulering av neuronale cellekulturer på mikroelektrodearrayer

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering og isolering av musen primære Microglia av tetthet gradert sentrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cellebasert analysen å studere antistoff-mediert Tau godkjennes av Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Et antistoff fôring tilnærming til studier glutamat reseptor smugling i dissosiert primær hippocampus kulturer

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Bruk av kapillær elektroforese immunoassay å søke etter potensielle biomarkører av amyotrofisk lateral sklerose i menneskelige blodplater

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Bruk av primærkulturerte hippocampale nevroner for å studere monteringen av axon-innledende segmenter

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluering av motorisk svekkelse i C. elegans modeller av amyotrofisk lateral sklerose

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...