Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Contrato de Ciência e Desenvolvimento Tecnológico da República da Sérvia nº 451-03-9/2021-14 / 200178, o projeto FENS - NENS Education and Training Cluster "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" e o EC H2020 MSCA RISE grant #778405. Agradecemos a Marija Adžić e Mina Perić por fornecerem as imagens imuno-histoquímicas e a Danijela Bataveljić por ajudarem com a escrita em papel.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretivas da UE sobre a proteção de animais para fins científicos e com permissão da Comissão de Ética da Faculdade de Biologia da Universidade de Belgrado (número de aprovação EK-BF-2016/08). Em relação ao material do paciente (soros para IgGs), este foi coletado para exame clínico de rotina com o consentimento informado do paciente, de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque) para experimentos envolvend...

Este trabalho apresenta o método de cultura celular primária como uma ferramenta rápida e "dentro do orçamento" para o estudo de diferentes aspectos da fisiologia celular (pato), como a ELA, no modelo hSOD1G93A de ratos. A técnica é, portanto, adequada para estudos no nível de célula única que podem ser extrapolados e investigados em um nível mais alto de organização (ou seja, em fatias de tecido ou em um animal vivo). A cultura celular como técnica, no entanto, tem algumas ressalvas. É mais impo...

As técnicas de cultura de células deram origem a inúmeros avanços em diversos campos da neurofisiologia celular na saúde e na doença. Particularmente, as culturas de células primárias, recém-isoladas do tecido neuronal de um animal de laboratório, permitem que o experimentador estude de perto o comportamento de diversas células em diferentes meios bioquímicos e configurações fisiológicas. O uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como os corantes sensíveis ao Ca2+, em combinação com a microscopia de vídeo de lapso de tempo, fornece uma melhor visão dos processos biofísicos e bioquímicos celulares em tempo real.
A ELA é uma doença neurodegenerativa devastadora que afeta os neurônios motores superiores e inferiores1. A doença tem uma patogênese complexa do tipo familiar, mas principalmente da forma esporádica (90% dos casos)2. Sabe-se que mecanismos autônomos não celulares contribuem para a fisiopatologia da ELA, principalmente devido ao papel essencial das células gliais3. A ELA também é bem caracterizada como uma doença neuroinflamatória com envolvimento de fatores humorais e celulares de inflamação.
A imunoglobulina G é amplamente utilizada como marcador molecular na ELA e em outras doenças neurodegenerativas. Estudar o nível sérico desse marcador pode indicar a presença e o estágio da neuroinflamação na doença 4,5,6, enquanto sua presença no líquido cefalorraquidiano pode indicar uma violação da barreira hematoencefálica 7. IgGs também foram identificadas como depósitos nos neurônios motores da medula espinhal de pacientes com ELA7. No entanto, essa abordagem tem mostrado algumas inconsistências na correlação do nível de IgGs com o estágio e as características da doença6.
A IgG isolada dos soros de pacientes com ELA (ALS IgG) pode induzir uma resposta de cálcio em astrócitos ingênuos8 e liberação de glutamato em neurônios, apontando para um efeito excitotóxico - uma característica da patologia da ELA9. No entanto, estudos sobre o modelo de camundongo HSA hSOD1G93A (contendo múltiplas cópias da mutação humanaSOD1 10) mostraram uma série de marcadores de estresse oxidativo em células neurogliais cultivadas 11, tecidos 12,13,14 ou animais vivos 13. Ressalta-se que os astrócitos cultivados a partir do modelo de ratos com ELA foram mais propensos ao estresse oxidativo induzido pelo peróxido do que a astroglia de companheiros de ninhada não transgênicos11.
As células microgliais em cultura são afetadas pela ELA IgG de forma menos aparente. Ou seja, uma linhagem celular microglial BV-2 apresentou um aumento no sinal de marcadores fluorescentes de estresse oxidativo em resposta à aplicação de apenas 4/11 amostras de pacientes com ELA IgG15. Sabe-se que a micróglia participa de muitas patologias neuroinflamatórias, aumentando o estresse oxidativo e a fase de progressão tardia no mecanismo autônomo não celular da ELA16,17. No entanto, os dados com IgGs da ELA indicaram que essas células podem não ser tão reativas quanto os astrócitos a esses fatores humorais da inflamação da ELA. Vários estudos têm sido realizados com astrócitos primários de modelos murinos de ELA, não apenas em filhotes, mas também em animais sintomáticos, seja no cérebro ou na medula espinhal 18,19,20,21. Isso também é verdade para culturas primárias microgliais, embora em menor grau do que os astrócitos e principalmente de regiões cerebrais no estágio embrionário22,23,24.
Usamos imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca2+ em células em cultura principalmente como um meio de seguir os transientes intracelulares deste íon como um marcador fisiológico de excitotoxicidade. Assim, pela caracterização biofísica desses transientes (amplitude, área sob transiente, tempo de subida, frequência) o pesquisador pode obter parâmetros diagnósticos experimentais a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneração. Esta técnica oferece, portanto, uma vantagem de uma avaliação fisiológica quantitativa de IgGs como biomarcadores da doença. Há um grande corpo de literatura sobre o papel das IgGs e Ca2+ na indução da ELA. A maioria desses estudos foi realizada induzindo ELA injetando IgGs de pacientes em animais experimentais 25,26,27,28,29, que então mostraram elevação intracelular de Ca 2+ e deposições de IgG. Uma linha de estudos explorou o efeito da ELA IgGs na sinapse motora in vitro30,31,32. No contexto acima, a técnica aqui apresentada coloca o foco nas células gliais como atores importantes no mecanismo autônomo não celular da ELA e quantifica sua potencial resposta excitotóxica às IgGs como fatores humorais da neuroinflamação. Essa abordagem pode ter uma aplicação mais ampla no teste de outros fatores humorais como soros inteiros, LCR ou citocinas em diferentes sistemas de cultura celular e em modelos celulares de inflamação geral.
Este artigo descreve como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células para estudar a fisiopatologia da ELA com IgG derivada de soros de pacientes. Os protocolos são detalhados para o carregamento de corante de células cultivadas (Figura 1) e as gravações de alterações de Ca2+ em experimentos de imagem de vídeo de lapso de tempo. Exemplos de gravações de vídeo mostrarão como as células gliais reagem à ALS IgG em comparação com o ATP, este último ativando os receptores de membrana purinérgicos. Mostrado pela primeira vez é um exemplo de como os astrócitos isolados do cérebro de ratos hSOD1G93A ALS reagem com uma resposta mais pronunciada de Ca 2+ à ALS IgG em comparação com controles não transgênicos e como relacionar esse processo com as diferenças na operação de armazenamento de Ca2+. Também é mostrado um exemplo de imagem de cálcio em células microgliais agudamente desafiadas com ALS IgG, com apenas uma resposta modesta de cálcio intracelular.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

Este protocolo demonstra como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células com a finalidade de estudar a fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica (ELA) no modelo hSOD1G93A de ratos. Primeiro, o protocolo mostra como isolar e cultivar astrócitos e micróglias de córtices de ratos pós-natais e, em seguida, como caracterizar e testar a pureza dessas culturas por imunocitoquímica usando o marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de astrócitos e o marcador microglial da molécula adaptadora de ligação ao cálcio ionizado 1 (Iba1). Na próxima etapa, são descritos métodos para o carregamento de corantes (Fluo 4-AM sensível ao cálcio) de células cultivadas e as gravações de alterações de Ca2+ em experimentos de imagem de vídeo em células vivas.
Os exemplos de gravações de vídeo consistem em: (1) casos de imagem de Ca2+ de astrócitos cultivados agudamente expostos à imunoglobulina G (IgG) isolados de pacientes com ELA, mostrando uma resposta característica e específica em comparação com a resposta ao ATP, conforme demonstrado no mesmo experimento. Exemplos também mostram um aumento transitório mais pronunciado na concentração intracelular de cálcio evocada pela ELA IgG em astrócitos hSOD1G93A em comparação com controles não transgênicos; (2) Imagem Ca 2+ de astrócitos cultivados durante uma depleção dos estoques de cálcio pela thapsigargina (Thg), um inibidor não competitivo do retículo endoplasmático Ca 2+ ATPase, seguido pela entrada de cálcio operada em armazém provocada pela adição de cálcio na solução de registro, o que demonstra a diferença entre a operação de armazenamento de Ca2+ em hSOD1G93A e em astrócitos não transgênicos; (3) Imagens de Ca 2+ da micróglia cultivada mostraram predominantemente uma falta de resposta à IgG da ELA, enquanto a aplicação de ATP provocou uma alteração de Ca2+. Este artigo também enfatiza possíveis ressalvas e advertências em relação à densidade celular crítica e pureza das culturas, escolhendo a concentração correta do corante Ca2+ e das técnicas de carregamento de corantes.

Caracterização de diferentes tipos de células gliais em cultura Geralmente leva de 15 a 21 dias para produzir astrócitos para experimentos, enquanto as células microgliais levam de 10 a 15 dias para crescer. A imunocoloração foi realizada para avaliar a pureza celular da cultura. A Figura 1 mostra a expressão da dupla marcação do marcador astrocítico GFAP e do marcador microglial Iba1 nas respectivas culturas.
Sabe-se que a imagem de...

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Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Apresentamos aqui um protocolo sobre como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglias de córtices de ratos para imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca2+ intracelular para pesquisa sobre fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica no modelo de rato hSOD1G93A .

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Este protocolo permite revelar o padrão de sinalização intercelular de cálcio que caracteriza cada resposta do tipo celular na saúde, bem como na doença. Esta técnica permite a caracterização biofísica rápida e detalhada do comportamento celular complexo. Planejamos usar essa sinalização de cálcio induzida por IgG como uma impressão digital para a medicina personalizada de doenças neuroinflamatórias.No cenário da vida real, não é fácil ver e acompanhar todos os processos e eventos, especialmente aqueles que acontecem sob o microscópio. Por isso, os dados visuais são importantes. Depois de decapitar filhotes de um a três dias de idade, exponha o crânio cortando a pele usando pequenas tesouras angulares.Em seguida, abra o crânio cortando o forame magno em direção às órbitas e faça um corte perpendicular da linha média. Remova o cérebro do crânio e coloque-o em uma placa de Petri contendo PBS. Use a ponta da pinça para rasgar as conexões entre os dois hemisférios e separe os hemisférios com pinças curvas empurrando suavemente um hemisfério do centro para o lado.Use pinças retas e curvas para remover as meninges, rasgando-as cuidadosamente. Em seguida, remova o hipocampo, beliscando-o com pinça curva e descarte, ou use-o para outra preparação de cultura de células. Em seguida, transfira o córtex para um tubo de 15 mililitros contendo três mililitros de PBS frio e homogeneize o tecido pipetando para cima e para baixo 10 a 15 vezes com uma ponta de um mililitro.Centrifugar as células a 500 g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em três mililitros de PBS frio pipetando com uma ponta de um mililitro. Centrifugar mais uma vez e ressuspender o pellet em dois mililitros de DMEM completo suplementado com 10% FBS e antibióticos.Depois de transferir o homogeneizado para um tubo de dois mililitros, passe o homogeneizado através de agulhas de calibre 21 e 23 para fazer uma suspensão de células únicas. Despeje a suspensão celular preparada a partir de um córtex em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo três mililitros de DMEM completo e agite levemente a placa de Petri, de modo que a suspensão seja uniformemente distribuída. Incubar as células em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono e 95% de ar a 37 graus Celsius.Para promover o crescimento de astrócitos, remova o meio antigo e lave a célula com PBS pré-aquecido para remover as células gliais frouxamente ligadas e os vestígios de FBS uma vez que atinjam 70 a 80% de confluência. Em seguida, tripsnize a camada subjacente de astrócitos adicionando um mililitro de solução de tripsina pré-aquecida e incube a 37 graus Celsius por dois a cinco minutos. Use um microscópio para verificar se as células começam a se desprender e adicione quatro mililitros de DMEM completo.Colete a suspensão celular e transfira-a para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar o tubo a 500 g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo.Conte as células usando um hemocitômetro. Em seguida, prepare o prato de cultura e adicione o meio de cultura. Reemplacar as células a uma densidade de 10 a quartas células por centímetro quadrado em cinco mililitros de DMEM completo fresco e lavar as células com DMEM completo antes de cada substituição do meio.Depois de atingir 70 a 80% de confluência, repita a tripsinização e semeie cinco vezes 10 aos terceiros astrócitos em uma cobertura de vidro circular revestida de poli-Llisina de sete milímetros. Deixe-os anexar por 10 minutos e adicione DMEM completo. Use-os em experimentos após 48 horas.Depois de preparar as culturas microgliais, para promover a micróglia, permita que as células gliais se tornem confluentes e a micróglia aparecerá no topo da camada de astrócitos após 10 a 15 dias. Agite a placa de Petri em um agitador orbital por duas horas a 220 RPM. Agora, lave levemente as células separadas e frouxamente presas, aspirando o sobrenadante com uma ponta de pipeta de um mililitro.Dispense suavemente o sobrenadante na camada de células várias vezes, garantindo cobrir toda a superfície da camada celular durante esta etapa de lavagem. Colete o meio com as células separadas e transfira-o para um tubo de 15 mililitros. Centrifugar, ressuspender e contar as células conforme demonstrado anteriormente.Semeie cinco vezes 10 até a terceira micróglia em uma tampa de vidro circular revestida de poli-L-lisina de sete milímetros. Deixe-os anexar por 10 minutos e adicione DMEM completo. Use-os em experimentos após 48 horas.Para lavar o DMEM completo, transfira uma folha de cobertura para um prato com solução extracelular. Preparar a solução de carregamento de corante diluindo um milimolar Fluo-4 AM com solução extracelular para atingir a concentração final de cinco micromolares. Coloque a tampa deslizante com células na solução de carregamento do corante por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro e lave as células em solução extracelular por 20 minutos.Coloque a folha de cobertura na câmara de gravação com um mililitro de solução de trabalho. Escolha o campo de visão com um número consistente de células ao longo do experimento. Inicie a imagem e determine a linha de base adquirindo o nível basal de fluorescência por três a cinco minutos.Em seguida, pare o fluxo da solução de trabalho e mude para a solução de teste pelo período de tempo desejado. Entre cada solução de ensaio, lavar as células com um fluxo constante da solução de trabalho durante três a cinco minutos. Mantenha o volume da solução na câmara de gravação em um mililitro, organizando uma sucção constante a partir do topo da solução.Escolha o quadro de intensidade de sinal mais alto e circule uma célula usando o aplicativo da ferramenta Poligonal. Depois de circundar todas as células no campo adquirido, escolha cinco regiões de interesse no plano de fundo usando a ferramenta Círculo. Em seguida, meça a intensidade média do sinal de uma única célula e o fundo para cada período de tempo.Selecione todas as regiões de interesse e use o comando Multi-Measure no ROI Manager no ImageJ ou qualquer comando equivalente em software comercial. Depois de importar os dados no software MATLAB, faça uma média de cinco ROIs de fundo e subtraia o plano de fundo médio de cada quadro da intensidade média do ROI dos quadros adquiridos simultaneamente. Posteriormente, analise a atividade do cálcio determinando a amplitude do pico de cálcio, a mudança integrada do transiente de cálcio, o tempo de pico, o tempo de subida, a meia largura e a frequência.GFAP é usado para visualizar astrócitos e Iba1 para visualizar a micróglia. Os astrócitos hSOD1G93A respondem à imunoglobulina G da ELA com maior amplitude do transiente de cálcio, uma alteração global integrada mais considerável e um tempo mais curto para atingir o pico do que os astrócitos não transgênicos. A resposta à imunoglobulina G da ELA é distinguível da resposta à ATP.Os astrócitos hSOD1G93A apresentaram um maior nível de íons cálcio nos estoques, conforme revelado pela depleção do estoque, indicando uma sobrecarga desse íon. Microglias foram cultivadas e a intensidade média de fluorescência foi extraída ao longo do tempo. Os traços de cálcio de três células representaram que apenas uma célula respondeu à imunoglobulina G da ELA, enquanto todas as células responderam ao ATP.As imagens pseudocoloridas representaram a intensidade de fluorescência e a linha de base em resposta à ELA, IgG e ATP. As células precisam ser adequadamente carregadas e os parâmetros do sistema de imagem precisam ser ajustados adequadamente, de modo que o sinal não seja separado durante o experimento. Juntamente com a emissão de cálcio, o clampeamento do adesivo pode ser realizado.Assim, um quadro mais completo da correlação entre diferentes correntes de íons de membrana e emissores de cálcio pode ser obtido. A compreensão da homeostase intracelular do cálcio é de importância essencial para a exploração de diversas respostas a estímulos naturais, bem como a estímulos estressantes e externos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Neurociência

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

O uso do condicionamento de rastreamento Eyeblink clássico para avaliar disfunção Hippocampal em um modelo do rato de transtornos do espectro do álcool Fetal

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Baseada em célula de ensaio para estudar mediada por anticorpos Tau afastamento por Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Uma abordagem de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Uso de Imunoensaios de Eletroforese Capilar para Procurar Potenciais Biomarcadores de Esclerose Lateral Amiotrófica em Plaquetas Humanas

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Uso de neurônios hipocampais primários para estudar a montagem de segmentos iniciais de Axon

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Avaliação do Comprometimento Motor em C. elegans Modelos de Esclerose Lateral Amiotrófica

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...