Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Эта работа была поддержана Договором Министерства образования, науки и технологического развития Республики Сербия No 451-03-9/2021-14/200178, проектом образовательного и учебного кластера FENS - NENS «Трехсторонний курс по глии в нейровоспалении» и грантом ЕС H2020 MSCA RISE #778405. Мы благодарим Марию Аджич и Мину Перич за предоставление изображений иммуногистохимии и Даниэлу Батавельич за помощь в написании статьи.

Все эксперименты проводились в соответствии с директивами ЕС по защите животных в научных целях и с разрешения Этической комиссии биологического факультета Белградского университета (номер одобрения EK-BF-2016/08). Что касается материала пациента (сыворотки для IgGs), то он был собран для пла?...

В данной работе представлен метод первичного культивирования клеток как быстрый и «бюджетный» инструмент для изучения различных аспектов клеточной (пато)физиологии, таких как БАС в модели hSOD1G93A крыс. Таким образом, метод подходит для исследований на одноклеточном уровне, которы?...

Методы культивирования клеток привели к многочисленным достижениям в различных областях клеточной нейрофизиологии в области здравоохранения и болезней. В частности, первичные клеточные культуры, недавно выделенные из нейронной ткани лабораторного животного, позволяют экспериментатору внимательно изучать поведение различных клеток в различных биохимических средах и физиологических установках. Использование различных флуоресцентных физиологических показателей, таких как чувствительные красители Ca2+, в сочетании с покадровой видеомикроскопией обеспечивает лучшее понимание клеточных биофизических и биохимических процессов в режиме реального времени.
БАС является разрушительным нейродегенеративным заболеванием, которое поражает верхние и нижние двигательные нейроны1. Заболевание имеет сложный патогенез семейного типа, но преимущественно спорадической формы (90% случаев)2. Хорошо известно, что неклеточные автономные механизмы способствуют патофизиологии БАС, в первую очередь из-за существенной роли глиальных клеток3. БАС также хорошо характеризуется как нейровоспалительное заболевание с участием гуморальных и клеточных факторов воспаления.
Иммуноглобулин G широко используется в качестве молекулярного маркера при БАС и других нейродегенеративных заболеваниях. Изучение сывороточного уровня этого маркера может свидетельствовать о наличии и стадии нейровоспаления при заболевании 4,5,6, в то время как его наличие в спинномозговой жидкости может свидетельствовать о нарушении гематоэнцефалического барьера7. IgGs также были идентифицированы как отложения в двигательных нейронах спинного мозга пациентов с БАС7. Тем не менее, данный подход показал некоторые несоответствия в соотношении уровня IgGs со стадией и особенностями заболевания6.
IgG, выделенный из сывороток пациентов с БАС (ALS IgG), может индуцировать кальциевый ответ в наивных астроцитах8 и высвобождение глутамата в нейронах, указывая на экситотоксический эффект - отличительный признак патологии БАС9. Однако исследования на крысиной модели hSOD1G93A ALS (содержащей множественные копии человеческой мутации SOD110) показали ряд маркеров окислительного стресса в культивируемых нейроглиальных клетках11, тканях 12,13,14 или живых животных 13. Примечательно, что астроциты, культивируемые из модели крыс с БАС, были более склонны к окислительному стрессу, вызванному перекисью, чем астроглия у нетрансгенных пометников11.
Клетки микроглии в культуре подвергаются воздействию ALS IgG менее очевидным образом. А именно, линия микроглиальных клеток BV-2 показала повышение сигнала от флуоресцентных маркеров окислительного стресса в ответ на применение только 4/11 ALS IgG образцов пациента15. Хорошо известно, что микроглии участвуют во многих нейровоспалительных патологиях, добавляя к окислительному стрессу и поздней фазе прогрессирования в неклеточном автономном механизме БАС16,17. Тем не менее, данные с ALS IgGs показали, что эти клетки могут быть не такими реактивными, как астроциты, на эти гуморальные факторы воспаления БАС. Было проведено несколько исследований с первичными астроцитами из мышиных моделей БАС не только у детенышей, но и у симптоматических животных, либо на головном, либо на спинном мозге 18,19,20,21. Это также верно для первичных культур микроглии, хотя и в меньшей степени, чем астроциты и в основном из областей мозга на эмбриональной стадии 22,23,24.
Мы используем покадровую видеовизуализацию Ca2+ на клетках в культуре в первую очередь как средство для отслеживания внутриклеточных переходных процессов этого иона в качестве физиологического маркера экситотоксичности. Таким образом, путем биофизической характеристики этих переходных процессов (амплитуда, площадь под переходным процессом, время нарастания, частота) исследователь может получить экспериментальные диагностические параметры из различных клеточных моделей нейродегенерации. Таким образом, этот метод дает преимущество количественной физиологической оценки IgGs как биомаркеров заболевания. Существует большое количество литературы о роли IgGs и Ca2+ в индукции БАС. Большинство из этих исследований были выполнены путем индуцирования БАС путем введения пациенту IgGs экспериментальным животным 25,26,27,28,29, которые затем показали внутриклеточное повышение Ca2+ и IgG. В ряде исследований изучалось влияние ALS IgGs на моторный синапс in vitro 30,31,32. В приведенном выше контексте метод, представленный здесь, фокусируется на глиальных клетках как важных игроках в неклеточном автономном механизме БАС и количественно оценивает их потенциальный экситотоксический ответ на IgGs как гуморальные факторы нейровоспаления. Этот подход может иметь более широкое применение при тестировании других гуморальных факторов, таких как целые сыворотки, ликвор или цитокины в различных системах клеточных культур и в клеточных моделях общего воспаления.
В этой статье описывается, как подготовить первичные культуры глиальных клеток, астроцитов и микроглии из коры крыс Sprague Dawley и как в дальнейшем использовать эти клетки для изучения патофизиологии БАС с помощью IgG, полученного из сыворотки пациента. Протоколы подробно описаны для загрузки красителем культивируемых клеток (рисунок 1) и записей изменений Ca2+ в экспериментах с покадровой видеоизображением. Примеры видеозаписей покажут, как глиальные клетки реагируют на ALS IgG по сравнению с АТФ, последний активирует пуринергические мембранные рецепторы. Впервые показан пример того, как астроциты, выделенные из мозга крысы hSOD1G93A ALS , реагируют с более выраженным ответом Ca2+ на ALS IgG по сравнению с нетрансгенным контролем и как связать этот процесс с различиями в работе магазина Ca2+ . Также показан пример визуализации кальция в клетках микроглии, остро оспариваемых ALS IgG, с лишь скромным ответом внутриклеточного кальция.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

Этот протокол демонстрирует, как подготовить первичные культуры глиальных клеток, астроцитов и микроглий из коры крыс Sprague Dawley и как использовать эти клетки с целью изучения патофизиологии бокового амиотрофического склероза (БАС) в модели hSOD1G93A крыс. Сначала протокол показывает, как изолировать и культивировать астроциты и микроглию из постнатальной коры крыс, а затем как охарактеризовать и проверить эти культуры на чистоту иммуноцитохимией с использованием маркера глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) астроцитов и ионизированного кальций-связывающего адапторного молекулы 1 (Iba1) микроглиального маркера. На следующем этапе описаны методы загрузки красителем (кальций-чувствительный Fluo 4-AM) культивируемых клеток и записи изменений Ca2+ в экспериментах видеовизуализации на живых клетках.
Примеры видеозаписей состоят из: (1) случаев визуализации Ca2+ культивируемых астроцитов, остро подвергшихся воздействию иммуноглобулина G (IgG), выделенного у пациентов с БАС, демонстрируя характерный и специфический ответ по сравнению с ответом на АТФ, как было продемонстрировано в том же эксперименте. Примеры также показывают более выраженное преходящее повышение внутриклеточной концентрации кальция, вызванное ALS IgG в астроцитах hSOD1G93A по сравнению с нетрансгенным контролем; (2) Ca2+ визуализация культивируемых астроцитов во время истощения запасов кальция тапсигаргином (Thg), неконкурентным ингибитором эндоплазматического ретикулума Ca2+ АТФазы, с последующим поступлением кальция в хранилище, вызванным добавлением кальция в регистрирующий раствор, что демонстрирует разницу между работой хранилища Ca2+ в hSOD1G93A и в нетрансгенных астроцитах; (3) Визуализация культивируемой микроглии Ca2+ , показывающая преимущественно отсутствие реакции на ALS IgG, тогда как применение АТФ вызвало изменение Ca2+ . В этой статье также подчеркиваются возможные предостережения и предостережения относительно критической плотности клеток и чистоты культур, выбора правильной концентрации красителя Ca2+ и методов загрузки красителя.

Характеристика различных типов глиальных клеток в культуре Обычно для производства астроцитов для экспериментов требуется 15-21 день, в то время как микроглиальным клеткам требуется 10-15 дней, чтобы вырасти. Иммуноокрашивание проводили для оценки клеточной чистоты культуры. <s...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Мы представляем здесь протокол о том, как подготовить первичные культуры глиальных клеток, астроцитов и микроглии из коры крыс для покадровой видеовизуализации внутриклеточного Ca2+ для исследования патофизиологии бокового амиотрофического склероза в модели крыс hSOD1G93A .

Первичные культуры астроцитов и микроглии крыс и их использование в изучении бокового амиотрофического склероза

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Этот протокол позволяет выявить межклеточную сигнальную картину кальция, которая характеризует реакцию каждого типа клеток как на здоровье, так и на болезнь. Этот метод позволяет быстро и детально биофизически охарактеризовать сложное клеточное поведение. Мы планируем использовать эту IgG-индуцированную кальциевую сигнализацию в качестве отпечатка пальца для персонализированной медицины нейровоспалительных заболеваний.В реальной жизни нелегко увидеть и проследить за всеми процессами и событиями, особенно происходящими под микроскопом. Следовательно, визуальные данные важны. После обезглавливания от одного до трехдневного щенка обнажите череп, разрезав кожу с помощью небольших угловых ножниц.Затем откройте череп, разрезав отверстие magnum к орбитам и сделайте перпендикулярный разрез средней линии. Извлеките мозг из черепа и поместите его в чашку Петри, содержащую PBS. Используйте кончик щипцов, чтобы разорвать связи между обоими полушариями, и разделите полушария изогнутыми щипцами, мягко толкая полусферу от центра к стороне.Используйте прямые и изогнутые щипцы, чтобы удалить мозговые оболочки, осторожно разрывая их. Затем удалите гиппокамп, зажав его изогнутыми щипцами, и выбросьте, или используйте его для другого препарата клеточной культуры. Затем переведите кору в 15-миллилитровую трубку, содержащую три миллилитра холодного PBS, и гомогенизируйте ткань, пипетируя вверх и вниз от 10 до 15 раз с помощью одномиллилитрового наконечника.Центрифугировать клетки по 500 г в течение пяти минут. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в трех миллилитрах холодного PBS путем пипетки с помощью одномиллилитрового наконечника. Центрифугу еще раз и повторно суспендировать гранулу в двух миллилитрах полного DMEM, дополненного 10% FBS и антибиотиками.После переноса гомогената в двухмиллилитровую трубку пропустите гомогенат через иглы 21 и 23 калибра, чтобы получить суспензию одиночных ячеек. Вылейте клеточную суспензию, приготовленную из одной коры, в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую три миллилитра полного DMEM, и слегка встряхните чашку Петри, чтобы суспензия равномерно распределилась. Инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе с 5% углекислого газа и 95% воздуха при 37 градусах Цельсия.Чтобы стимулировать рост астроцитов, удалите старые среды и промывайте клетку предварительно подогретым PBS, чтобы удалить слабо прикрепленные глиальные клетки и следы FBS, как только они достигнут слияния от 70 до 80%. Затем трипсинизируют нижележащий слой астроцитов, добавляя один миллилитр предварительно подогретого раствора трипсина и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение двух-пяти минут. Используйте микроскоп, чтобы проверить, начинают ли клетки отделяться, и добавьте четыре миллилитра полного DMEM.Соберите клеточную суспензию и переложите ее в 15-миллилитровую трубку. Затем центрифугируют пробирку по 500 г в течение пяти минут. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре полной среды.Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Далее приготовьте блюдо культуры и добавьте культуральную среду. Перекладывайте ячейки с плотностью от 10 до четвертого ячеек на квадратный сантиметр в пяти миллилитрах свежего полного DMEM и промывайте ячейки с полным DMEM перед каждой заменой среды.После достижения 70-80% слияния повторите трипсинизацию и посейте пять раз от 10 до третьих астроцитов на семимиллиметровом круглом стеклянном покрытии с поли-L-лизином. Дайте им прикрепиться в течение 10 минут и добавьте полный DMEM. Используйте их в экспериментах через 48 часов.После подготовки микроглиальных культур, чтобы способствовать микроглии, позвольте глиальным клеткам стать сливающимися, и микроглия появится поверх слоя астроцитов через 10-15 дней. Встряхните чашку Петри на орбитальном шейкере в течение двух часов при 220 оборотах в минуту. Теперь слегка промыть отсоединенные и слабо прикрепленные клетки, аспирируя супернатант с помощью наконечника пипетки в один миллилитр.Осторожно распределите супернатант на слой клеток несколько раз, обеспечивая покрытие всей поверхности клеточного слоя во время этой стадии промывки. Соберите среду с отсоединенными клетками и переложите ее в 15-миллилитровую трубку. Центрифугирование, повторное суспендирование и подсчет клеток, как показано ранее.Посейте пять раз от 10 до третьей микроглии на семимиллиметровом круглом стеклянном покрытии с поли-L-лизином. Дайте им прикрепиться в течение 10 минут и добавьте полный DMEM. Используйте их в экспериментах через 48 часов.Чтобы промыть весь ДМЭМ, переложите один лист крышки на посуду с внеклеточным раствором. Готовят раствор для загрузки красителя путем разбавления одного миллимоляра Fluo-4 AM внеклеточным раствором для достижения конечной концентрации пяти микромоляров. Поместите крышку с ячейками в раствор для загрузки красителя на 30 минут при комнатной температуре в темноте и промыть клетки во внеклеточном растворе в течение 20 минут.Поместите крышку в записывающую камеру с одним миллилитром рабочего раствора. Выберите поле зрения с постоянным количеством ячеек на протяжении всего эксперимента. Начните визуализацию и определите исходный уровень, получив базальный уровень флуоресценции в течение трех-пяти минут.Затем остановите поток рабочего раствора и переключитесь на тестовый раствор на нужный промежуток времени. Между каждым исследуемым раствором промывайте ячейки постоянным потоком рабочего раствора в течение трех-пяти минут. Поддерживайте объем раствора в регистрирующей камере на уровне одного миллилитра, организуя постоянное всасывание из верхней части раствора.Выберите кадр с наибольшей интенсивностью сигнала и обведите одну ячейку с помощью приложения инструмента «Полигональ». После окружения всех ячеек в полученном поле выберите пять интересующих областей в фоновом режиме с помощью инструмента «Круг». Затем измерьте среднюю интенсивность сигнала одной ячейки и фон для каждого таймфрейма.Выберите все интересующие регионы и используйте команду Multi-Measure в ROI Manager в ImageJ или любую эквивалентную команду в коммерческом программном обеспечении. После импорта данных в программное обеспечение MATLAB усредните пять фоновых ROI и вычтите усредненный фон каждого кадра из средней интенсивности ROI кадров, полученных одновременно. Позже проанализируйте активность кальция, определив амплитуду пика кальция, интегральное изменение переходного периода кальция, время до пика, время подъема, половинную ширину и частоту.GFAP используется для визуализации астроцитов, а Iba1 для визуализации микроглии. hSOD1G93A астроциты реагируют на иммуноглобулин G БАС с большей амплитудой переходного кальция, более значительным общим интегральным изменением и более коротким временем до пика, чем нетрансгенные астроциты. Ответ на БАС иммуноглобулин G отличается от ответа на АТФ.hSOD1G93A астроциты имели более высокий уровень ионов кальция в запасах, что было выявлено истощением запасов, что указывает на перегрузку этого иона. Микроглию культивировали, и со временем извлекали среднюю интенсивность флуоресценции. Следы кальция трех клеток показали, что только одна клетка реагировала на иммуноглобулин БАС G, в то время как все клетки реагировали на АТФ.Псевдоцветные изображения представляли интенсивность флуоресценции и исходный уровень в ответ на БАС, IgG и АТФ. Клетки должны быть адекватно загружены, а параметры системы визуализации должны быть соответствующим образом отрегулированы, чтобы сигнал не отделялся во время эксперимента. Наряду с выделением кальция может быть выполнено зажим пластыря.Таким образом, можно получить более полную картину корреляции между различными мембранными ионными токами и выделением кальция. Понимание внутриклеточного гомеостаза кальция имеет важное значение для исследования нескольких реакций на естественные, а также на стрессовые и внешние раздражители.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Использование трассировки Eyeblink классический подготовлять для оценки гиппокампа дисфункции в мышиной модели плода алкоголь спектра расстройств

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Быстрое и рафинированное CD11b Магнитная изоляция первичной микроглии с повышенной чистоты и универсальности

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Зависящее от времени увеличение ответа сети на стимуляцию нейронных клеточных культур на микроэлектродных массивах

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Характеристика и изоляция первичной микроглии мыши по плотности градиентного центрифугирования

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cell-based Assay учиться антитела опосредованной Тау Распродажа по Микроглия

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Подход к кормлению антител для изучения торговли рецепторами глутамата в диссоциированных первичных гиппокампальных культурах

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Использование капиллярного электрофореза иммуноанализ для поиска потенциальных биомаркеров бокового амиотрофического склероза в тромбоцитах человека

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Использование первичных культивированных нейронов гиппокампа для изучения сборки начальных сегментов аксона

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Оценка двигательных нарушений в моделях C. elegans бокового амиотрофического склероза

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...