Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Desarrollo Tecnológico República de Serbia Contrato No. 451-03-9/2021-14 / 200178, el proyecto FENS - NENS Education and Training Cluster "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation", y la subvención EC H2020 MSCA RISE # 778405. Agradecemos a Marija Adžić y Mina Perić por proporcionar las imágenes de inmunohistoquímica y a Danijela Bataveljić por su ayuda con la redacción en papel.

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directivas de la UE sobre la protección de los animales con fines científicos y con el permiso de la Comisión de Ética de la Facultad de Biología de la Universidad de Belgrado (número de aprobación EK-BF-2016/08). En cuanto al material del paciente (sueros para IgGs), se recolectó para el examen clínico de rutina con el consentimiento informado del paciente de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki) para...

Este artículo presenta el método de cultivo de células primarias como una herramienta rápida y "dentro del presupuesto" para estudiar diferentes aspectos de la (fisio)fisiología celular, como la ELA en el modelo hSOD1G93A de rata. Por lo tanto, la técnica es adecuada para estudios a nivel unicelular que pueden extrapolarse e investigarse más a fondo a un nivel superior de organización (es decir, en rodajas de tejido o en un animal vivo). El cultivo celular como técnica, sin embargo, tiene algunas adve...

Las técnicas de cultivo celular han dado lugar a numerosos avances en diversos campos de la neurofisiología celular en la salud y la enfermedad. En particular, los cultivos celulares primarios, recién aislados del tejido neuronal de un animal de laboratorio, permiten al experimentador estudiar de cerca el comportamiento de diversas células en diferentes medios bioquímicos y configuraciones fisiológicas. El uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como los colorantes sensibles al Ca2+ en combinación con la microscopía de video de lapso de tiempo, proporciona una mejor comprensión de los procesos biofísicos y bioquímicos celulares en tiempo real.
La ELA es una enfermedad neurodegenerativa devastadora que afecta a las neuronas motoras superiores e inferiores1. La enfermedad tiene una patogénesis compleja de tipo familiar, pero principalmente de forma esporádica (90% de los casos)2. Es bien sabido que los mecanismos autónomos no celulares contribuyen a la fisiopatología de la ELA, principalmente debido al papel esencial de las células gliales3. La ELA también se caracteriza bien como una enfermedad neuroinflamatoria con la participación de factores humorales y celulares de inflamación.
La inmunoglobulina G es ampliamente utilizada como marcador molecular en la ELA y otras enfermedades neurodegenerativas. El estudio del nivel sérico de este marcador puede indicar la presencia y el estadio de la neuroinflamación en la enfermedad 4,5,6, mientras que su presencia en el líquido cefalorraquídeo puede indicar una ruptura de la barrera hematoencefálica7. Las IgG también fueron identificadas como depósitos en las neuronas motoras de la médula espinal de pacientes con ELA7. Sin embargo, este abordaje ha mostrado algunas inconsistencias en la correlación del nivel de IgG con el estadio y las características de la enfermedad6.
La IgG aislada de sueros de pacientes con ELA (ALS IgG) puede inducir una respuesta al calcio enastrocitos 8 naïve y la liberación de glutamato en las neuronas, apuntando a un efecto excitotóxico, un sello distintivo de la patología de ELA9. Sin embargo, los estudios en el modelo de rata hSOD1G93A ALS (que contiene múltiples copias de la mutación SOD1 humana10) mostraron una serie de marcadores de estrés oxidativo en células neurogliales cultivadas 11, tejidos 12,13,14 o animales vivos 13. Cabe destacar que los astrocitos cultivados del modelo de rata ALS fueron más propensos al estrés oxidativo inducido por el peróxido que la astroglía de compañeros de camada no transgénicos11.
Las células microgliales en cultivo se ven afectadas por la ELA IgG de una manera menos aparente. A saber, una línea celular microglial BV-2 mostró un aumento en la señal de marcadores fluorescentes de estrés oxidativo en respuesta a la aplicación de solo 4/11 muestras de pacientes con ELAIgG 15. Es bien sabido que la microglía participa en muchas patologías neuroinflamatorias, añadiendo estrés oxidativo y fase de progresión tardía en el mecanismo autónomo no celular de ALS16,17. Sin embargo, los datos con ALS IgG indicaron que estas células pueden no ser tan reactivas como los astrocitos a estos factores humorales de la inflamación de la ELA. Se han realizado varios estudios con astrocitos primarios de modelos murinos de ELA, no solo en cachorros sino también en animales sintomáticos, ya sea en el cerebro o en la médula espinal 18,19,20,21. Esto también es cierto para los cultivos primarios microgliales, aunque en menor medida que los astrocitos y principalmente de regiones cerebrales en la etapa embrionaria22,23,24.
Utilizamos imágenes de video de lapso de tiempo de Ca2+ en células en cultivo principalmente como un medio para seguir los transitorios intracelulares de este ion como un marcador fisiológico de excitotoxicidad. Así, mediante la caracterización biofísica de estos transitorios (amplitud, área bajo transitorio, tiempo de subida, frecuencia) el investigador puede obtener parámetros diagnósticos experimentales a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneración. Por lo tanto, esta técnica ofrece una ventaja de una evaluación fisiológica cuantitativa de IgG como biomarcadores de enfermedades. Existe una gran cantidad de literatura sobre el papel de las IgG y el Ca2+ en la inducción de la ELA. La mayoría de estos estudios se realizaron mediante la inducción de ELA mediante la inyección de IgG de pacientes en animales de experimentación 25,26,27,28,29, que luego mostraron elevación intracelular de Ca 2+ y depósitos de IgG. Una línea de estudios exploró el efecto de las IgG de ELA en la sinapsis motora in vitro30,31,32. En el contexto anterior, la técnica presentada aquí pone el foco en las células gliales como actores importantes en el mecanismo autónomo no celular de la ELA y cuantifica su potencial respuesta excitotóxica a las IgG como factores humorales de neuroinflamación. Este enfoque puede tener una aplicación más amplia en la prueba de otros factores humorales como sueros enteros, LCR o citoquinas en diferentes sistemas de cultivo celular y en modelos celulares de inflamación general.
Este documento describe cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar aún más estas células para estudiar la fisiopatología de la ELA con IgG derivada de sueros del paciente. Los protocolos se detallan para la carga de colorante de células cultivadas (Figura 1) y las grabaciones de cambios de Ca2+ en experimentos de imágenes de video de lapso de tiempo. Ejemplos de grabaciones de video mostrarán cómo reaccionan las células gliales a la IgG ALS en comparación con el ATP, este último activando los receptores de membrana purinérgica. Se muestra por primera vez un ejemplo de cómo los astrocitos aislados del cerebro de rata hSOD1G93A ALS reaccionan con una respuesta de Ca 2+ más pronunciada a la IgG de ELA en comparación con los controles no transgénicos y cómo relacionar este proceso con las diferencias en la operación de almacenamiento de Ca2+. También se muestra un ejemplo de imágenes de calcio en células microgliales con un desafío agudo con ELA IgG, con solo una respuesta modesta de calcio intracelular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

Este protocolo demuestra cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar estas células con el fin de estudiar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en el modelo hSOD1G93A de rata. Primero, el protocolo muestra cómo aislar y cultivar astrocitos y microglia de cortezas de ratas postnatales, y luego cómo caracterizar y probar la pureza de estos cultivos mediante inmunocitoquímica utilizando el marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de los astrocitos y el marcador microglial ionizado de la molécula adaptadora de unión al calcio 1 (Iba1). En la siguiente etapa, se describen métodos para la carga de colorantes (Fluo 4-AM sensible al calcio) de células cultivadas y las grabaciones de cambios de Ca2+ en experimentos de imágenes de video en células vivas.
Los ejemplos de grabaciones de vídeo consisten en: (1) casos de imágenes de Ca2+ de astrocitos cultivados expuestos agudamente a inmunoglobulina G (IgG) aislados de pacientes con ELA, mostrando una respuesta característica y específica en comparación con la respuesta al ATP como se demostró en el mismo experimento. Los ejemplos también muestran un aumento transitorio más pronunciado en la concentración de calcio intracelular evocado por ALS IgG en astrocitos hSOD1G93A en comparación con los controles no transgénicos; (2) imágenes de Ca 2+ de astrocitos cultivados durante una depleción de las reservas de calcio por thapsigargin (Thg), un inhibidor no competitivo de la ATPasa del retículo endoplásmico Ca 2+, seguida de una entrada de calcio operada por el almacén provocada por la adición de calcio en la solución de registro, lo que demuestra la diferencia entre la operación de almacenamiento de Ca2+ en hSOD1G93A y en astrocitos no transgénicos; (3) Las imágenes de Ca 2+ de la microglía cultivada muestran predominantemente una falta de respuesta a la IgG de ELA, mientras que la aplicación de ATP provocó un cambio de Ca2+. Este documento también enfatiza posibles advertencias y precauciones con respecto a la densidad celular crítica y la pureza de los cultivos, eligiendo la concentración correcta del colorante Ca2+ y las técnicas de carga de colorante.

Caracterización de diferentes tipos de células gliales en cultivo Por lo general, toma de 15 a 21 días producir astrocitos para experimentos, mientras que las células microgliales tardan de 10 a 15 días en crecer. Se realizó inmunotinción para evaluar la pureza celular del cultivo. La Figura 1 muestra la expresión del doble marcaje del marcador astrocítico GFAP y el marcador microglial Iba1 en cultivos respectivos.
Se sabe que las imá...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Presentamos aquí un protocolo sobre cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de cortezas de rata para imágenes de video de lapso de tiempo de Ca2+ intracelular para la investigación sobre fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica en el modelo de rata hSOD1G93A .

Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Este protocolo permite revelar el patrón de señalización de calcio intercelular que caracteriza la respuesta de cada tipo de célula tanto en la salud como en la enfermedad. Esta técnica permite una caracterización biofísica rápida y detallada del comportamiento celular complejo. Planeamos usar esta señalización de calcio inducida por IgG como una huella digital para la medicina personalizada de enfermedades neuroinflamatorias.En el entorno de la vida real, no es fácil ver y seguir todos los procesos y eventos, especialmente los que suceden bajo el microscopio. Por lo tanto, los datos visuales son importantes. Después de decapitar a los cachorros de uno a tres días de edad, exponga el cráneo abriendo la piel con pequeñas tijeras en ángulo.Luego abra el cráneo cortando el foramen magnum hacia las órbitas y haga un corte perpendicular en la línea media. Retire el cerebro del cráneo y colóquelo en una placa de Petri que contenga PBS. Use la punta de los fórceps para rasgar las conexiones entre ambos hemisferios y separe los hemisferios con pinzas curvas empujando suavemente un hemisferio desde el centro hacia un lado.Use fórceps rectos y curvos para extraer las meninges rasgándolas cuidadosamente. Luego retire el hipocampo pellizcándolo con pinzas curvas y deséchelo, o úselo para otra preparación de cultivo celular. A continuación, transfiera la corteza a un tubo de 15 mililitros que contenga tres mililitros de PBS frío y homogeneice el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces con una punta de un mililitro.Centrifugar las células a 500 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de PBS frío pipeteando con una punta de un mililitro. Centrifugar una vez más, y resuspender el pellet en dos mililitros de DMEM completo suplementado con 10% FBS y antibióticos.Después de transferir el homogeneizado a un tubo de dos mililitros, pase el homogeneizado a través de agujas de calibre 21 y 23 para hacer una suspensión de células individuales. Vierta la suspensión celular preparada a partir de una corteza en una placa de Petri de 60 milímetros que contenga tres mililitros de DMEM completo y agite ligeramente la placa de Petri, de modo que la suspensión se distribuya uniformemente. Incubar las células en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono y 95% de aire a 37 grados centígrados.Para promover el crecimiento de astrocitos, retire los medios viejos y lave la célula con PBS precalentado para eliminar las células gliales sueltas y los rastros de FBS una vez que alcancen una confluencia del 70 al 80%. Luego tripsinizar la capa subyacente de astrocitos agregando un mililitro de solución de tripsina precalentada e incubar a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos. Use un microscopio para verificar si las células comienzan a desprenderse y agregue cuatro mililitros de DMEM completo.Recoja la suspensión celular y transfiérala a un tubo de 15 mililitros. Luego centrifugar el tubo a 500 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio completo.Contar las células con un hemocitómetro. A continuación, prepare el plato de cultivo y agregue el medio de cultivo. Replaque las células a una densidad de 10 a la cuarta células por centímetro cuadrado en cinco mililitros de DMEM completo fresco y lave las células con DMEM completo antes de cada reemplazo de medios.Después de alcanzar el 70 al 80% de confluencia, repita la tripsinización y siembre cinco veces 10 a los terceros astrocitos en un cubrecubierto de vidrio circular recubierto de poli-L-lisina de siete milímetros. Deje que se adhieran durante 10 minutos y agregue DMEM completo. Úsalos en experimentos después de 48 horas.Después de preparar los cultivos microgliales, para promover la microglía, permita que las células gliales se confluenten y la microglía aparecerá en la parte superior de la capa de astrocitos después de 10 a 15 días. Agite la placa de Petri en un agitador orbital durante dos horas a 220 RPM. Ahora, lave ligeramente las células separadas y sueltas aspirando el sobrenadante con una punta de pipeta de un mililitro.Dispense suavemente el sobrenadante sobre la capa de células varias veces, asegurándose de cubrir toda la superficie de la capa celular durante este paso de lavado. Recoja el medio con las células desprendidas y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar, resuspender y contar las células como se demostró anteriormente.Semilla cinco veces 10 a la tercera microglia en un cubrecubierto de vidrio circular recubierto de poli-L-lisina de siete milímetros. Déjelos unidos durante 10 minutos y agregue DMEM completo. Úsalos en experimentos después de 48 horas.Para lavar el DMEM completo, transfiera una cubierta a un plato con solución extracelular. Preparar la solución de carga de colorante diluyendo un milimolar Fluo-4 AM con solución extracelular para lograr la concentración final de cinco micromolares. Coloque el cubreobjetos con células en la solución de carga de tinte durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, y lave las células en solución extracelular durante 20 minutos.Coloque el cubreobjetos en la cámara de grabación con un mililitro de solución de trabajo. Elija el campo de visión que tenga un número constante de celdas a lo largo del experimento. Comience la imagen y determine la línea de base adquiriendo el nivel basal de fluorescencia durante tres a cinco minutos.A continuación, detenga el flujo de la solución de trabajo y cambie a la solución de prueba durante el tiempo deseado. Entre cada solución de prueba, lave las células con un flujo constante de la solución de trabajo durante tres a cinco minutos. Mantenga el volumen de la solución en la cámara de grabación a un mililitro organizando una succión constante desde la parte superior de la solución.Elija el fotograma de intensidad de señal más alto y rodee una celda con la aplicación de herramienta Poligonal. Después de rodear todas las celdas en el campo adquirido, elija cinco regiones de interés en segundo plano utilizando la herramienta Círculo. Luego mida la intensidad media de la señal de una sola celda y el fondo para cada período de tiempo.Seleccione todas las regiones de interés y utilice el comando Multi-Measure en ROI Manager en ImageJ, o cualquier comando equivalente en software comercial. Después de importar los datos en el software MATLAB, promedie cinco ROI de fondo y reste el fondo promedio de cada fotograma de la intensidad media del ROI de los fotogramas adquiridos simultáneamente. Más tarde, analice la actividad del calcio determinando la amplitud del pico de calcio, el cambio integrado del transitorio de calcio, el tiempo hasta el pico, el tiempo de subida, el ancho medio y la frecuencia.GFAP se utiliza para visualizar astrocitos e Iba1 para visualizar microglia. Los astrocitos hSOD1G93A responden a la inmunoglobulina G de ELA con una mayor amplitud del transitorio de calcio, un cambio integrado general más considerable y un tiempo más corto hasta alcanzar el pico que los astrocitos no transgénicos. La respuesta a la inmunoglobulina G de ELA se distingue de la respuesta al ATP.Los astrocitos hSOD1G93A tenían un mayor nivel de iones de calcio en las reservas como lo revela el agotamiento de la tienda, lo que indica una sobrecarga de este ion. Se cultivaron microglías y se extrajo la intensidad media de fluorescencia a lo largo del tiempo. Las trazas de calcio de tres células representaron que solo una célula respondió a la inmunoglobulina G de ELA, mientras que todas las células respondieron al ATP.Las imágenes pseudo-color representaron la intensidad de fluorescencia y la línea de base en respuesta a ALS, IgG y ATP. Las células deben cargarse adecuadamente y los parámetros del sistema de imágenes deben ajustarse adecuadamente, de modo que la señal no se separe durante el experimento. Junto con la emisión de calcio, se puede realizar un pinzamiento del parche.Por lo tanto, se puede obtener una imagen más completa de la correlación entre las diferentes corrientes de iones de membrana y las emisoras de calcio. La comprensión de la homeostasis intracelular del calcio es de importancia esencial para la exploración de varias respuestas a estímulos naturales, estresantes y externos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Investigación

Neurociencias

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

El uso de condicionamiento de clásico de Eyeblink rastro para evaluar disfunción hipocampal en un modelo de rata de trastornos del espectro alcohólico Fetal

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Ensayo basado en células para estudiar despacho Tau anticuerpo-mediada por la microglía

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Uso del inmunoensayo de electroforesis capilar para buscar biomarcadores potenciales de la esclerosis lateral amiotrófica en plaquetas humanas

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Uso De Las Neuronas Del Hipocampo Cultivadas Primarias Para Estudiar El Ensamblaje De Los Segmentos Iniciales Axón

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluación del deterioro motor en modelos de C. elegans de esclerosis lateral amiotrófica

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...