Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ministeriet för utbildningsvetenskap och teknisk utveckling Republiken Serbien kontrakt nr 451-03-9/2021-14 / 200178, FENS - NENS Education and Training Cluster-projektet "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" och EC H2020 MSCA RISE-bidrag #778405. Vi tackar Marija Adžić och Mina Perić för att de levererade immunhistokemibilderna och Danijela Bataveljić för hjälp med pappersskrivning.

Alla experiment utfördes i enlighet med EU-direktiven om skydd av djur för vetenskapliga ändamål och med tillstånd från den etiska kommissionen vid biologiska fakulteten, Belgrads universitet (godkännandenummer EK-BF-2016/08). När det gäller patientmaterial (serum för IgG) samlades det in för rutinmässig klinisk undersökning med informerad patients samtycke i enlighet med World Medical Association (Helsingforsdeklarationen) för experiment på människor. Protokollet godkändes av etikkommittén för Serbien...

Detta dokument presenterar metoden för primär cellodling som ett snabbt och "på budgeten" -verktyg för att studera olika aspekter av cell (pato) fysiologi såsom ALS i råtta hSOD1G93A-modellen . Tekniken är således lämplig för studier på encellsnivå som kan extrapoleras och undersökas vidare på en högre organisationsnivå (dvs. i vävnadsskivor eller i ett levande djur). Cellodling som teknik har dock några försiktighetsåtgärder. Det är mest kritiskt att göra hjärnvävnadsisolering och dis...

Cellodlingstekniker har gett upphov till många framsteg inom olika områden av cellulär neurofysiologi inom hälsa och sjukdom. Särskilt primära cellkulturer, nyligen isolerade från neuronvävnaden hos ett laboratoriedjur, tillåter experimentören att noggrant studera beteendet hos olika celler i olika biokemiska medier och fysiologiska inställningar. Att använda olika fluorescerande fysiologiska indikatorer som Ca2+-känsliga färgämnen i kombination med time-lapse-videomikroskopi ger bättre inblick i de cellulära biofysiska och biokemiska processerna i realtid.
ALS är en förödande neurodegenerativ sjukdom som drabbar övre och nedre motorneuroner1. Sjukdomen har en komplex patogenes av familjär typ men mestadels av sporadisk form (90% av fallen)2. Det är välkänt att icke-cellautonoma mekanismer bidrar till ALS-patofysiologi, främst på grund av glialcellernas väsentliga roll3. ALS karakteriseras också väl som en neuroinflammatorisk sjukdom med involvering av humorala och cellulära faktorer av inflammation.
Immunoglobulin G används ofta som en molekylär markör vid ALS och andra neurodegenerativa sjukdomar. Att studera serumnivån för denna markör kan indikera närvaron och stadiet av neuroinflammation i sjukdomen 4,5,6, medan dess närvaro i cerebrospinalvätskan kan indikera ett brott mot blodhjärnbarriären7. IgG identifierades också som avlagringar i ryggmärgsmotorneuronerna hos ALS-patienter7. Ändå har detta tillvägagångssätt visat vissa inkonsekvenser i korrelationen mellan nivån av IgG och sjukdomsstadiet och egenskaperna hos sjukdomen6.
IgG isolerad från serum hos ALS-patienter (ALS IgG) kan inducera ett kalciumsvar i naiva astrocyter8 och glutamatfrisättning i nervceller, vilket pekar på en excitotoxisk effekt - ett kännetecken för ALS-patologi9. Studier på hSOD1G93A ALS-råttmodellen (innehållande flera kopior av den humana SOD1-mutationen10) visade dock ett antal markörer för oxidativ stress i odlade neurogliaceller11, vävnader 12,13,14 eller levande djur 13. Det är anmärkningsvärt att astrocyterna som odlades från ALS-råttmodellen var mer benägna att oxidativ stress inducerad av peroxid än astroglia från icke-transgena kullkamrater11.
Mikrogliaceller i odling påverkas av ALS IgG på ett mindre uppenbart sätt. En BV-2 mikroglial cellinje visade nämligen en ökning av signalen från fluorescerande markörer för oxidativ stress som svar på appliceringen av endast 4/11 ALS IgG-patientprover15. Det är välkänt att mikroglia deltar i många neuroinflammatoriska patologier, vilket bidrar till oxidativ stress och sen progressionsfas i den icke-cellautonoma mekanismen för ALS16,17. Ändå indikerade data med ALS IgGs att dessa celler kanske inte är lika reaktiva som astrocyter mot dessa humorala faktorer av ALS-inflammation. Flera studier har utförts med primära astrocyter från ALS murinmodeller, inte bara hos ungar utan också hos symtomatiska djur, antingen på hjärnan eller på ryggmärgen 18,19,20,21. Detta gäller även för mikrogliala primära kulturer, men i mindre utsträckning än astrocyter och mestadels från hjärnregioner i embryonalstadiet22,23,24.
Vi använder time-lapse videoavbildning av Ca2+ på celler i odling främst som ett sätt att följa intracellulära transienter av denna jon som en fysiologisk markör för excitotoxicitet. Genom biofysisk karakterisering av dessa transienter (amplitud, område under övergående, stigtid, frekvens) kan forskaren således erhålla experimentella diagnostiska parametrar från olika cellulära modeller av neurodegeneration. Denna teknik erbjuder således en fördel av en kvantitativ fysiologisk bedömning av IgG som sjukdomsbiomarkörer. Det finns en stor mängd litteratur om IgGs och Ca2+ roll i induktionen av ALS. De flesta av dessa studier utfördes genom att inducera ALS genom att injicera patientens IgG i försöksdjur 25,26,27,28,29, som sedan visade intracellulär Ca 2+ förhöjning och IgG-deposition. En rad studier undersökte effekten av ALS IgG på motorsynapsen in vitro30,31,32. I ovanstående sammanhang sätter tekniken som presenteras här fokus på gliacellerna som viktiga aktörer i den icke-cellautonoma mekanismen för ALS och kvantifierar deras potentiella excitotoxiska svar på IgG som humorala faktorer för neuroinflammation. Detta tillvägagångssätt kan ha en bredare tillämpning vid testning av andra humorala faktorer som hela sera, CSF eller cytokiner i olika cellodlingssystem och i cellulära modeller av allmän inflammation.
Detta dokument beskriver hur man förbereder primära kulturer av gliaceller, astrocyter och mikroglia från kortikerna hos Sprague Dawley-råttor och hur man ytterligare använder dessa celler för att studera ALS-patofysiologi med patientens sera-härledda IgG. Protokollen är detaljerade för färgämnesbelastning av odlade celler (figur 1) och inspelningar av Ca2+ förändringar i time-lapse videoavbildningsexperiment. Exempel på videoinspelningar visar hur gliaceller reagerar på ALS IgG jämfört med ATP, det senare aktiverar purinerga membranreceptorer. För första gången visas ett exempel på hur astrocyter isolerade från hSOD1G93A ALS-råtthjärnan reagerar med ett mer uttalat Ca 2+ svar på ALS IgG jämfört med icke-transgena kontroller och hur man relaterar denna process till skillnaderna i Ca2+ butiksdrift. Dessutom visas ett exempel på kalciumavbildning i mikrogliaceller som akut utmanas med ALS IgG, med endast ett blygsamt svar av intracellulärt kalcium.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

Detta protokoll visar hur man förbereder primära kulturer av gliaceller, astrocyter och mikroglia från kortikerna hos Sprague Dawley-råttor och hur man använder dessa celler för att studera patofysiologin för amyotrofisk lateralskleros (ALS) i råtta hSOD1G93A-modellen . Först visar protokollet hur man isolerar och odlar astrocyter och mikroglia från postnatala råttkortiker, och sedan hur man karakteriserar och testar dessa kulturer för renhet genom immunocytokemi med hjälp av glialfibrillärt surt protein (GFAP) markör för astrocyter och den joniserade kalciumbindande adaptermolekylen 1 (Iba1) mikroglial markör. I nästa steg beskrivs metoder för färgämnesbelastning (kalciumkänslig Fluo 4-AM) av odlade celler och inspelningar av Ca2+ förändringar i videoavbildningsexperiment på levande celler.
Exemplen på videoinspelningar består av: (1) fall av Ca2+ avbildning av odlade astrocyter akut exponerade för immunglobulin G (IgG) isolerade från ALS-patienter, vilket visar ett karakteristiskt och specifikt svar jämfört med svaret på ATP som visats i samma experiment. Exempel visar också en mer uttalad övergående ökning av intracellulär kalciumkoncentration som framkallas av ALS IgG i hSOD1G93A-astrocyter jämfört med icke-transgena kontroller; (2) Ca 2+ avbildning av odlade astrocyter under en utarmning av kalciumförråd av thapsigargin (Thg), en icke-konkurrenskraftig hämmare av endoplasmatisk retikulum Ca 2+ ATPas, följt av butiksdriven kalciumpost som framkallas genom tillsats av kalcium i registreringslösningen, vilket visar skillnaden mellan Ca2+ butiksdrift i hSOD1G93A och i icke-transgena astrocyter; (3) Ca 2+ avbildning av den odlade mikroglia som huvudsakligen visar brist på svar på ALS IgG, medan ATP-applikationen framkallade en Ca2+ förändring. Detta papper betonar också möjliga försiktighetsåtgärder och försiktighetsåtgärder angående kritisk celldensitet och renhet hos kulturer, genom att välja rätt koncentration av Ca2+ färgämne och färgladdningstekniker.

Karakterisering av olika gliacelltyper i odling Det tar vanligtvis 15-21 dagar att producera astrocyter för experiment, medan mikrogliaceller tar 10-15 dagar att växa. Immunostaining utfördes för att bedöma cellrenheten hos kulturen. Figur 1 visar uttrycket av dubbelmärkning av den astrocytiska markören GFAP och mikroglialmarkören Iba1 i respektive kultur.
Kalciumavbildning är känt för att avslöja skillnaderna i cellfysiologi hos fr...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Vi presenterar här ett protokoll om hur man förbereder primära kulturer av gliaceller, astrocyter och mikroglia från råttkortiker för time-lapse-videoavbildning av intracellulär Ca2+ för forskning om patofysiologi av amyotrofisk lateralskleros i hSOD1G93A-råttmodellen .

Primära kulturer av råttastrocyter och mikroglia och deras användning vid studier av amyotrofisk lateralskleros

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Detta protokoll gör det möjligt att avslöja intercellulärt kalciumsignalmönster som kännetecknar varje celltypsvar i hälsa såväl som i sjukdom. Denna teknik möjliggör snabb och detaljerad biofysisk karakterisering av komplext cellulärt beteende. Vi planerar att använda denna IgG-inducerade kalciumsignalering som ett fingeravtryck för personlig medicin av neuroinflammatoriska sjukdomar.I den verkliga miljön är det inte lätt att se och följa alla processer och händelser, särskilt de som händer under mikroskopet. Därför är visuella data viktiga. Efter att ha halshuggit en till tre dagar gamla valpar, exponera skallen genom att skära upp huden med en liten vinklad sax.Öppna sedan skallen genom att skära foramen magnum mot banorna och gör ett vinkelrätt mittlinjesnitt. Ta bort hjärnan från skallen och placera den i en petriskål som innehåller PBS. Använd spetsen på pincetten för att riva anslutningarna mellan båda halvklotet och separera halvklotet med böjda pincett genom att försiktigt trycka en halvklot från mitten till sidan.Använd raka och böjda pincett för att ta bort hjärnhinnorna genom att försiktigt riva dem. Ta sedan bort hippocampus genom att klämma fast den med böjda pincett och kassera, eller använd den för ett annat cellodlingspreparat. Överför sedan cortex till ett 15-milliliter rör som innehåller tre milliliter kall PBS och homogenisera vävnaden genom att pipettera upp och ner 10 till 15 gånger med en milliliter spets.Centrifugera cellerna vid 500 g i fem minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i tre milliliter kall PBS genom pipettering med en milliliter spets. Centrifugera igen och återsuspendera pelleten i två milliliter komplett DMEM kompletterat med 10% FBS och antibiotika.Efter överföring av homogenatet till ett två-milliliterrör, passera homogenatet genom 21 och 23-gauge nålar för att göra en suspension av enstaka celler. Häll cellsuspensionen framställd från en cortex i en 60-millimeter petriskål som innehåller tre milliliter komplett DMEM och skaka lätt petriskålen så att suspensionen fördelas jämnt. Inkubera cellerna i en fuktad inkubator med 5% koldioxid och 95% luft vid 37 grader Celsius.För att främja astrocyttillväxt, ta bort det gamla mediet och tvätta cellen med förvärmd PBS för att ta bort de löst fästa gliacellerna och spåren av FBS när de uppnår 70 till 80% sammanflöde. Försök sedan det underliggande skiktet av astrocyter genom att tillsätta en milliliter förvärmd trypsinlösning och inkubera vid 37 grader Celsius i två till fem minuter. Använd ett mikroskop för att kontrollera om cellerna börjar lossna och tillsätt fyra milliliter komplett DMEM.Samla cellsuspensionen och överför den till ett 15-milliliter rör. Centrifugera sedan röret vid 500 g i fem minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i en milliliter komplett medium.Räkna cellerna med en hemocytometer. Förbered sedan kulturskålen och tillsätt kulturmedium. Replate cellerna med en densitet av 10 till den fjärde cellerna per kvadratcentimeter i fem milliliter färsk komplett DMEM och tvätta cellerna med fullständig DMEM före varje mediebyte.Efter att ha nått 70 till 80% sammanflöde, upprepa trypsinisering och frö fem gånger 10 till de tredje astrocyterna på en sju millimeter poly-L-lysinbelagd cirkulär glasskyddsglidning. Låt dem fästa i 10 minuter och lägg till fullständig DMEM. Använd dem i experiment efter 48 timmar.Efter att ha förberett mikroglialkulturerna, för att främja microglia, låt gliacellerna bli sammanflytande och mikroglia kommer att dyka upp ovanpå astrocytskiktet efter 10 till 15 dagar. Skaka petriskålen på en orbital shaker i två timmar vid 220 varv / min. Tvätta nu lätt de fristående och löst fästa cellerna genom att aspirera supernatanten med en pipettspets på en milliliter.Fördela försiktigt supernatanten på cellskiktet flera gånger och se till att täcka hela cellskiktets yta under detta tvättsteg. Samla mediet med de fristående cellerna och överför det till ett 15-milliliter rör. Centrifugera, återuppliva och räkna cellerna som visats tidigare.Frö fem gånger 10 till den tredje mikroglia på en sju millimeter poly-L-lysinbelagd cirkulär glasskyddsglidning. Låt dem fästa i 10 minuter och lägg till komplett DMEM. Använd dem i experiment efter 48 timmar.För att tvätta ut hela DMEM, överför en täckglidning till en skål med extracellulär lösning. Förbered färgämnesbelastningslösningen genom att späda en millimolär Fluo-4 AM med extracellulär lösning för att uppnå den slutliga koncentrationen av fem mikromolära. Placera lockglidningen med celler i färgämneslösningen i 30 minuter vid rumstemperatur i mörkret och tvätta cellerna i extracellulär lösning i 20 minuter.Placera lockglidningen i inspelningskammaren med en milliliter arbetslösning. Välj det synfält som har ett konsekvent antal celler under hela experimentet. Starta avbildningen och bestäm baslinjen genom att förvärva basalnivån av fluorescens i tre till fem minuter.Stoppa sedan arbetslösningens flöde och byt till testlösningen under önskad tid. Tvätta cellerna med ett konstant flöde av arbetslösningen mellan varje testlösning i tre till fem minuter. Håll lösningsvolymen i inspelningskammaren på en milliliter genom att ordna ett konstant sug från toppen av lösningen.Välj den högsta signalintensitetsramen och omsluta en cell med hjälp av verktygsprogrammet Polygonal. När du har omringat alla celler i det förvärvade fältet väljer du fem regioner av intresse i bakgrunden med hjälp av cirkelverktyget. Mät sedan den genomsnittliga signalintensiteten för en enda cell och bakgrunden för varje tidsram.Välj alla intressanta regioner och använd kommandot Multi-Measure i ROI Manager i ImageJ, eller något motsvarande kommando i kommersiell programvara. Efter att ha importerat data i MATLAB-programvaran, genomsnitt fem bakgrunds-ROI och subtrahera den genomsnittliga bakgrunden för varje bildruta från den genomsnittliga ROI-intensiteten för de ramar som förvärvats samtidigt. Senare analysera kalciumaktiviteten genom att bestämma kalciumtoppens amplitud, den integrerade förändringen av kalciumövergående, tid till topp, stigtid, halvbredd och frekvens.GFAP används för att visualisera astrocyter och Iba1 för att visualisera microglia. hSOD1G93A astrocyter svarar på ALS-immunglobulin G med större amplitud av kalciumtransienten, en mer betydande övergripande integrerad förändring och en kortare tid till topp än icke-transgena astrocyter. Svaret på ALS-immunglobulin G skiljer sig från svaret på ATP.hSOD1G93A astrocyter hade en högre nivå av kalciumjoner i butikerna, vilket avslöjades av butiksutarmning, vilket indikerar en överbelastning av denna jon. Microglia odlades och den genomsnittliga fluorescensintensiteten extraherades över tiden. Kalciumspåren av tre celler representerade att endast en cell svarade på ALS-immunglobulin G, medan alla celler svarade på ATP.Pseudofärgbilderna representerade fluorescensintensiteten och baslinjen som svar på ALS, IgG och ATP. Cellerna måste vara tillräckligt laddade och parametrarna för bildsystemet måste justeras på lämpligt sätt så att signalen inte separeras under experimentet. Tillsammans med kalciumemitterande kan lappklämning utföras.Således kan en mer fullständig bild av korrelationen mellan olika membranjonströmmar och kalciumemitterande erhållas. Förståelsen av intracellulär kalciumhomeostas är av väsentlig betydelse för utforskningen av flera svar på naturliga såväl som stressiga och yttre stimuli.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll för Tredimensionell Confocal Morfometrisk Analys av Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Användning av Trace Blink klassisk betingning att bedöma Hippocampus dysfunktion i en råtta modell av fetala alkoholeffekter spektrum

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Snabb och Raffinerad CD11b Magnetic Isolering av primär mikroglia med förbättrad renhet och mångsidighet

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsberoende ökning av nätverkssvaret till stimulering av neuronala cellkulturer på mikroelektroder

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering och isolering av mus primära mikroglia täthet lutning centrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cell-baserad analys att studera antikroppsmedierad Tau Clearance av mikroglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

En antikropps matning metod för att studera glutamat-Receptorhandel i dissocierade primära hippocampal kulturer

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Användning av kapillär elektrofores immunoassay att söka efter potentiella biomarkörer av amyotrofisk lateral skleros i humana trombocyter

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Användning av primär kultiverade hippocampala nervceller för att studera monteringen av Axon initiala segment

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Utvärdering av motorisk försämring i C. elegans Modeller av amyotrofisk lateral skleros

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...