Name: primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Bu çalışma, Sırbistan Eğitim Bilim ve Teknolojik Kalkınma Bakanlığı Sözleşmesi No. 451-03-9/2021-14/ 200178, MDBF - NENS Eğitim ve Öğretim Kümesi projesi "Nöroinflamasyonda Glia Üzerine Üçlü Kurs" ve EC H2020 MSCA RISE hibe #778405 tarafından desteklenmiştir. İmmünohistokimya görüntülerini sağladıkları için Marija Adžić ve Mina Perić'e ve kağıt yazımında yardımcı oldukları için Danijela Bataveljić'e teşekkür ederiz.

Tüm deneyler, hayvanların bilimsel amaçlarla korunmasına ilişkin AB direktiflerine uygun olarak ve Belgrad Üniversitesi Biyoloji Fakültesi Etik Komisyonu'nun izniyle (onay numarası EK-BF-2016/08) gerçekleştirilmiştir. Hasta materyali (IgG'ler için serum) ile ilgili olarak, insanları içeren deneyler için Dünya Tabipler Birliği Etik Kurallarına (Helsinki Deklarasyonu) uygun olarak bilgilendirilmiş hastanın rızası ile rutin klinik muayene için toplanmıştır. Protokol, Sırbistan Klinik Merkezi Etik ...

Bu yazıda, sıçan hSOD1G93A modelinde ALS gibi hücre (pato) fizyolojisinin farklı yönlerini incelemek için hızlı ve "bütçeye uygun" bir araç olarak birincil hücre kültürleme yöntemi sunulmaktadır. Bu nedenle teknik, daha yüksek bir organizasyon seviyesinde (yani, doku dilimlerinde veya canlı bir hayvanda) ekstrapolasyon yapılabilen ve daha fazla araştırılabilen tek hücre seviyesindeki çalışmalar için uygundur. Bununla birlikte, bir teknik olarak hücre kültürlemenin birkaç uyarıs...

Hücre kültürü teknikleri, sağlık ve hastalıkta hücresel nörofizyolojinin çeşitli alanlarında sayısız ilerlemeye yol açmıştır. Özellikle, bir laboratuar hayvanının nöronal dokusundan yeni izole edilmiş birincil hücre kültürleri, deneycinin farklı biyokimyasal ortamlardaki ve fizyolojik kurulumlardaki çeşitli hücrelerin davranışlarını yakından incelemesine izin verir. Hızlandırılmış video mikroskobu ile birlikte Ca2 + duyarlı boyalar gibi farklı floresan fizyolojik göstergelerin kullanılması, hücresel biyofiziksel ve biyokimyasal süreçler hakkında gerçek zamanlı olarak daha iyi bir fikir verir.
ALS, üst ve alt motor nöronları etkileyen yıkıcı bir nörodejeneratif hastalıktır1. Hastalık ailesel tipte kompleks bir patogeneze sahiptir, ancak çoğunlukla sporadik formdadır (vakaların %90'ı)2. Hücre dışı otonom mekanizmaların, öncelikle glial hücrelerin temel rolü nedeniyle ALS patofizyolojisine katkıda bulunduğu iyi bilinmektedir3. ALS ayrıca inflamasyonun humoral ve hücresel faktörlerinin tutulumu olan nöroinflamatuar bir hastalık olarak da karakterizedir.
İmmünoglobulin G, ALS ve diğer nörodejeneratif hastalıklarda moleküler bir belirteç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu belirtecin serum seviyesinin incelenmesi, hastalıkta nöroinflamasyonun varlığını ve evresinigösterebilir 4,5,6, beyin omurilik sıvısındaki varlığı ise kan beyin bariyerinin ihlalini gösterebilir 7. IgG'ler ayrıca ALS hastalarının omurilik motor nöronlarında birikintiler olarak tanımlandı7. Bununla birlikte, bu yaklaşım IgG düzeyinin hastalığın evresi ve özellikleri ile korelasyonunda bazı tutarsızlıklar göstermiştir6.
ALS hastalarının serumlarından izole edilen IgG (ALS IgG), naif astrositlerde8 ve nöronlarda glutamat salınımında kalsiyum yanıtı indükleyebilir ve bu da ALS patolojisi9'un bir işareti olan eksitotoksik bir etkiye işaret eder. Bununla birlikte, hSOD1G93A ALS sıçan modeli üzerine yapılan çalışmalar (insan SOD1 mutasyonu10'un birden fazla kopyasını içeren), kültürlenmiş nöroglial hücrelerde11, dokularda 12,13,14 veya canlı hayvanlarda oksidatif stresin bir dizi belirtecini göstermiştir 13. ALS sıçan modelinden kültürlenen astrositlerin, peroksit tarafından indüklenen oksidatif strese, transgenik olmayan çöp arkadaşlarından gelen astrogliadan daha yatkın olmaları dikkat çekicidir11.
Kültürdeki mikroglial hücreler ALS IgG'den daha az belirgin bir şekilde etkilenir. Yani, bir BV-2 mikroglial hücre hattı, sadece 4/11 ALS IgG hasta örneklerinin uygulanmasına yanıt olarak oksidatif stresin floresan belirteçlerinden gelen sinyalde bir artış gösterdi15. Mikroglia'nın birçok nöroinflamatuar patolojiye katıldığı, ALS16,17'nin hücre dışı otonom mekanizmasında oksidatif strese ve geç progresyon fazına katkıda bulunduğu iyi bilinmektedir. Bununla birlikte, ALS IgGs ile ilgili veriler, bu hücrelerin ALS iltihabının bu humoral faktörlerine astrositler kadar reaktif olmayabileceğini göstermiştir. ALS murin modellerinden primer astrositlerle, sadece yavrularda değil, aynı zamanda semptomatik hayvanlarda, beyinde veya omurilikte 18,19,20,21 üzerinde çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Bu aynı zamanda mikroglial primer kültürler için de geçerlidir, ancak astrositlerden daha az ölçüde ve çoğunlukla embriyonik aşamadaki beyin bölgelerinden22,23,24.
Kültürdeki hücreler üzerinde Ca2 + 'nın hızlandırılmış video görüntülemesini, öncelikle eksitotoksisitenin fizyolojik bir belirteci olarak bu iyonun hücre içi geçicilerini takip etmenin bir aracı olarak kullanıyoruz. Böylece, bu geçicilerin biyofiziksel karakterizasyonu ile (genlik, geçici altındaki alan, yükselme zamanı, frekans) araştırmacı, nörodejenerasyonun çeşitli hücresel modellerinden deneysel tanı parametreleri elde edebilir. Bu nedenle bu teknik, IgG'lerin hastalık biyobelirteçleri olarak kantitatif fizyolojik değerlendirmesinin bir avantajını sunar. ALS indüksiyonunda IgGs ve Ca2+'nın rolü hakkında geniş bir literatür bulunmaktadır. Bu çalışmaların çoğu, hasta IgG'leri deney hayvanlarına 25,26,27,28,29 enjekte ederek ALS'yi indükleyerek gerçekleştirildi ve daha sonra hücre içi Ca 2+ yükselmesi ve IgG birikintileri görüldü. Bir dizi çalışma, ALS IgG'lerin in vitro30,31,32 motor sinaps üzerindeki etkisini araştırdı. Yukarıdaki bağlamda, burada sunulan teknik, ALS'nin hücre dışı otonom mekanizmasında önemli oyuncular olarak glial hücrelere odaklanmakta ve nöroinflamasyonun humoral faktörleri olarak IgG'lere potansiyel eksitotoksik yanıtlarını ölçmektedir. Bu yaklaşım, farklı hücre kültürü sistemlerinde ve genel inflamasyonun hücresel modellerinde bütün serumlar, BOS veya sitokinler gibi diğer humoral faktörlerin test edilmesinde daha geniş bir uygulamaya sahip olabilir.
Bu yazıda, Sprague Dawley sıçanlarının kortekslerinden glial hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların birincil kültürlerinin nasıl hazırlanacağı ve bu hücrelerin hasta sera kaynaklı IgG ile ALS patofizyolojisini incelemek için nasıl daha fazla kullanılacağı açıklanmaktadır. Protokoller, kültürlenmiş hücrelerin boya yüklenmesi (Şekil 1) ve hızlandırılmış video görüntüleme deneylerinde Ca2+ değişikliklerinin kayıtları için detaylandırılmıştır. Video kayıtlarının örnekleri, glial hücrelerin ALS IgG'ye ATP'ye kıyasla nasıl tepki verdiğini gösterecektir, ikincisi pürinerjik membran reseptörlerini aktive eder. İlk kez gösterilen, hSOD1G93A ALS sıçan beyninden izole edilen astrositlerin, transgenik olmayan kontrollere kıyasla ALS IgG'ye daha belirgin bir Ca2+ yanıtı ile nasıl tepki verdiğine ve bu sürecin Ca2 + depo operasyonundaki farklılıklarla nasıl ilişkilendirileceğine dair bir örnektir. Ayrıca, ALS IgG ile akut olarak meydan okuyan mikroglial hücrelerde, hücre içi kalsiyumun sadece mütevazı bir cevabı ile kalsiyum görüntülemenin bir örneği gösterilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62 554 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2138-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>HN-2338-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Nipro, Japan</td>
			<td>SY3-5SC-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm circular glass coverslip</td>
			<td>Menzel Glasser, Germany</td>
			<td>630-2113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1</td>
			<td>Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>EDS-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8221;evolve&#8221;-EM 512 Digital Camera System</td>
			<td>Photometrics, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ Software</td>
			<td>Open source under the GNU General Public Licence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Technology Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Iba1</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td>
			<td>011-27991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biowest, France</td>
			<td>P5455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighSpeed Solution Exchange System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Math Works, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>MAB360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>324590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Sientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carlo Erba Reagents, Spain</td>
			<td>471686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker DELFIA PlateShake</td>
			<td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Carl ROTH GmbH</td>
			<td>X987.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargine</td>
			<td>Tocris Bioscience, UK</td>
			<td>1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X - 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td>
			<td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiFluor Imaging System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiChrome Polychromator System</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiView high performance setup</td>
			<td>Visitron System Gmbh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Short Arc lamp</td>
			<td>Ushio, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cultures of rat astrocytes and microglia and their use in the study of amyotrophic lateral sclerosis

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarının kortekslerinden glial hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların birincil kültürlerinin nasıl hazırlanacağını ve bu hücrelerin sıçan hSOD1G93A modelinde amiyotrofik lateral skleroz (ALS) patofizyolojisini incelemek amacıyla nasıl kullanılacağını göstermektedir. İlk olarak, protokol astrositlerin ve mikrogliaların doğum sonrası sıçan kortekslerinden nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini ve daha sonra astrositlerin glial fibriler asidik protein (GFAP) belirtecini ve iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (Iba1) mikroglial belirtecini kullanarak immünositokimya ile bu kültürlerin saflık için nasıl karakterize edileceğini ve test edileceğini göstermektedir. Bir sonraki aşamada, kültürlenmiş hücrelerin boya yüklemesi (kalsiyuma duyarlı Fluo 4-) ve canlı hücreler üzerindeki video görüntüleme deneylerinde Ca2+ değişikliklerinin kayıtları için yöntemler açıklanmaktadır.
Video kayıtlarının örnekleri şunlardan oluşur: (1) ALS hastalarından izole edilen immünoglobulin G'ye (IgG) akut olarak maruz kalan kültürlü astrositlerin Ca2+ görüntüleme vakaları, aynı deneyde gösterildiği gibi ATP'ye verilen cevaba kıyasla karakteristik ve spesifik bir yanıt göstermektedir. Örnekler ayrıca, hSOD1G93A astrositlerinde ALS IgG tarafından uyarılan hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda, transgenik olmayan kontrollere kıyasla daha belirgin bir geçici artış göstermektedir; (2) Endoplazmik retikulum Ca 2+ ATPaz'ın rekabetçi olmayan bir inhibitörü olan thapsigargin (Thg) tarafından kalsiyum depolarının tükenmesi sırasında kültürlenmiş astrositlerin Ca 2+ görüntülenmesi, ardından kayıt çözeltisine kalsiyum ilavesiyle ortaya çıkan depo tarafından işletilen kalsiyum girişi, hSOD1G93A'da ve transgenik olmayan astrositlerde Ca 2+ depo çalışması arasındaki farkı gösterir; (3) Kültürlü mikroglianın Ca 2+ görüntülemesi ağırlıklı olarak ALS IgG'ye yanıt eksikliği gösterirken, ATP uygulaması Ca2+ değişikliğine neden olmuştur. Bu makale aynı zamanda kritik hücre yoğunluğu ve kültürlerin saflığı ile ilgili olası uyarıları ve uyarıları vurgulamakta, Ca2+ boya ve boya yükleme tekniklerinin doğru konsantrasyonunu seçmektedir.

Kültürde farklı glial hücre tiplerinin karakterizasyonu Deneyler için astrositlerin üretilmesi genellikle 15-21 gün sürerken, mikroglial hücrelerin büyümesi 10-15 gün sürer. Kültürün hücre saflığını değerlendirmek için immün boyama yapıldı. Şekil 1 , astrositik işaretleyici GFAP ve mikroglial işaretleyici Iba1'in ilgili kültürlerdeki çift etiketleme ekspresyonunu göstermektedir.
Kalsiyum görüntülemenin sağl?...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Burada, hSOD1G93A sıçan modelinde amiyotrofik lateral sklerozun patofizyolojisi üzerine araştırmalar için hücre içi Ca2+'nın hızlandırılmış video görüntülemesi için sıçan kortekslerinden glial hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların primer kültürlerinin nasıl hazırlanacağına dair bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Astrositleri ve Mikroglia'nın Birincil Kültürleri ve Amiyotrofik Lateral Skleroz Çalışmalarında Kullanımları

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Bu protokol, sağlıkta ve hastalıkta her hücre tipi yanıtını karakterize eden hücreler arası kalsiyum sinyal paternini ortaya çıkarmaya izin verir. Bu teknik, karmaşık hücresel davranışın hızlı ve ayrıntılı biyofiziksel karakterizasyonunu sağlar. Bu IgG kaynaklı kalsiyum sinyalini nöroinflamatuar hastalıkların kişiselleştirilmiş tıbbı için parmak izi olarak kullanmayı planlıyoruz.Gerçek hayat ortamında, tüm süreçleri ve olayları, özellikle mikroskop altında olanları görmek ve takip etmek kolay değildir. Bu nedenle, görsel veriler önemlidir. Bir ila üç günlük yavruların kafasını kestikten sonra, küçük açılı makas kullanarak cildi keserek kafatasını ortaya çıkarın.Daha sonra foramen magnumunu yörüngelere doğru keserek kafatasını açın ve dik bir orta hat kesimi yapın. Beyni kafatasından çıkarın ve PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Her iki yarım küre arasındaki bağlantıları koparmak için forsepsin ucunu kullanın ve bir yarımküreyi merkezden yana doğru hafifçe iterek yarım küreleri kavisli forseps ile ayırın.Meninksleri dikkatlice yırtarak çıkarmak için düz ve kavisli forseps kullanın. Daha sonra hipokampüsü kavisli forsepslerle sıkıştırarak çıkarın ve atın veya başka bir hücre kültürü hazırlığı için kullanın. Daha sonra, korteksi üç mililitre soğuk PBS içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir mililitrelik bir uçla 10 ila 15 kez yukarı ve aşağı pipet yaparak dokuyu homojenize edin.Hücreleri beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve bir mililitrelik bir uçla pipetleyerek peleti üç mililitre soğuk PBS'de yeniden askıya alın. Bir kez daha santrifüj yapın ve peleti% 10 FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş iki mililitre tam DMEM'de yeniden askıya alın.Homojenatı iki mililitrelik bir tüpe aktardıktan sonra, homojenatı tek hücrelerin süspansiyonunu yapmak için 21 ve 23 gauge iğnelerden geçirin. Bir korteksten hazırlanan hücre süspansiyonunu, üç mililitre tam DMEM içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına dökün ve Petri kabını hafifçe sallayın, böylece süspansiyon eşit olarak dağıtılır. Nemlendirilmiş bir inkübatördeki hücreleri, 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ve %95 hava ile inkübe edin.Astrosit büyümesini teşvik etmek için, eski ortamı çıkarın ve gevşek bir şekilde bağlanmış glial hücreleri ve FBS izlerini% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştıklarında çıkarmak için hücreyi önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Daha sonra, bir mililitre önceden ısıtılmış tripsin çözeltisi ekleyerek altta yatan astrosit tabakasını tripsinize edin ve iki ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelerin ayrılmaya başlayıp başlamadığını kontrol etmek için bir mikroskop kullanın ve dört mililitre tam DMEM ekleyin.Hücre süspansiyonunu toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra tüpü beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj edin. Süpernatantı atın ve peleti bir mililitre tam ortamda yeniden askıya alın.Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Ardından, kültür yemeğini hazırlayın ve kültür ortamı ekleyin. Hücreleri, beş mililitre taze tam DMEM'de santimetre kare başına 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda yeniden plakalayın ve her ortam değişiminden önce hücreleri tam DMEM ile yıkayın.% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştıktan sonra, tripsinizasyonu tekrarlayın ve yedi milimetrelik poli-L-lizin kaplı dairesel cam kapak kayması üzerine beş kez 10 ila üçüncü astrositleri tohumlayın. 10 dakika boyunca takmalarına izin verin ve tam DMEM ekleyin. Bunları 48 saat sonra deneylerde kullanın.Mikroglial kültürleri hazırladıktan sonra, mikroglia'yı teşvik etmek için, glial hücrelerin akıcı hale gelmesine izin verin ve mikroglia 10 ila 15 gün sonra astrosit tabakasının üstünde görünecektir. Petri kabını yörüngesel bir çalkalayıcıda 220 RPM'de iki saat çalkalayın. Şimdi, ayrılan ve gevşek bir şekilde tutturulmuş hücreleri, süpernatantı bir mililitrelik pipet ucuyla aspire ederek hafifçe yıkayın.Süpernatantı birkaç kez hücre tabakasına yavaşça dağıtın ve bu yıkama adımı sırasında tüm hücre tabakası yüzeyinin kaplanmasını sağlayın. Ortamı ayrılmış hücrelerle toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha önce gösterildiği gibi hücreleri merkeze alın, yeniden askıya alın ve sayın.Yedi milimetrelik poli-L-lizin kaplı dairesel cam kapak kayması üzerinde beş kez 10 ila üçüncü mikroglia tohumlayın. 10 dakika boyunca takmalarına izin verin ve tam DMEM ekleyin. Bunları 48 saat sonra deneylerde kullanın.DMEM'in tamamını yıkamak için, bir kapak kaymasını hücre dışı çözelti içeren bir kaba aktarın. Beş mikromolar'ın nihai konsantrasyonunu elde etmek için bir milimolar Fluo-4'yi hücre dışı çözelti ile seyrelterek boya yükleme çözeltisini hazırlayın. Kapak kaymasını karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca boya yükleme çözeltisindeki hücrelerle birlikte yerleştirin ve hücreleri 20 dakika boyunca hücre dışı çözelti içinde yıkayın.Kapak kaymasını bir mililitre çalışma solüsyonu ile kayıt odasına yerleştirin. Deneme boyunca tutarlı sayıda hücreye sahip görüş alanını seçin. Görüntülemeye başlayın ve üç ila beş dakika boyunca bazal floresan seviyesini elde ederek taban çizgisini belirleyin.Ardından çalışma çözümünün akışını durdurun ve istenen süre boyunca test çözümüne geçin. Her test çözeltisi arasında, hücreleri üç ila beş dakika boyunca çalışma çözeltisinin sabit bir akışıyla yıkayın. Çözeltinin üstünden sabit bir emme ayarlayarak kayıt odasındaki çözelti hacmini bir mililitrede tutun.En yüksek sinyal yoğunluğu çerçevesini seçin ve Poligonal araç uygulamasını kullanarak bir hücreyi çevreleyin. Edinilen alandaki tüm hücreleri çevreledikten sonra, Daire aracını kullanarak arka planda beş ilgi alanı seçin. Ardından, tek bir hücrenin ortalama sinyal yoğunluğunu ve her zaman dilimi için arka planı ölçün.İlgilendiğiniz tüm bölgeleri seçin ve ImageJ'deki ROI Manager'da Multi-Measure komutunu veya ticari yazılımlardaki eşdeğer bir komutu kullanın. Verileri MATLAB yazılımına aktardıktan sonra, ortalama beş arka plan yatırım getirisini elde edin ve her karenin ortalama arka planını aynı anda elde edilen karelerin ortalama yatırım getirisi yoğunluğundan çıkarın. Daha sonra, kalsiyum zirvesinin genliğini, kalsiyum geçicisinin entegre değişimini, zirveye ulaşma süresini, yükselme süresini, yarı genişliği ve sıklığı belirleyerek kalsiyum aktivitesini analiz edin.GFAP, astrositleri görselleştirmek için ve Iba1 mikrogliayı görselleştirmek için kullanılır. hSOD1G93A astrositleri, ALS immünoglobulin G'ye, kalsiyum geçicisinin daha büyük genliği, daha önemli bir genel entegre değişim ve transgenik olmayan astrositlerden daha kısa bir zirve süresi ile yanıt verir. ALS immünoglobulin G'ye verilen yanıt, ATP'ye verilen yanıttan ayırt edilebilir.hSOD1G93A astrositleri, depo tükenmesinin ortaya çıkardığı gibi depolarda daha yüksek bir kalsiyum iyonu seviyesine sahipti ve bu da bu iyonun aşırı yüklendiğini gösteriyordu. Mikroglia kültürlendi ve ortalama floresan yoğunluğu zamanla ekstrakte edildi. Üç hücrenin kalsiyum izleri, sadece bir hücrenin ALS immünoglobulin G'ye yanıt verdiğini, tüm hücrelerin ATP'ye yanıt verdiğini temsil ediyordu.Sahte renkli görüntüler, ALS, IgG ve ATP'ye yanıt olarak floresan yoğunluğunu ve taban çizgisini temsil ediyordu. Hücrelerin yeterince yüklenmesi ve görüntüleme sisteminin parametrelerinin uygun şekilde ayarlanması gerekir, böylece sinyal deney sırasında ayrılmaz. Kalsiyum yayma ile birlikte, yama kelepçeleme yapılabilir.Böylece, farklı membran iyon akımları ile kalsiyum yayan arasındaki korelasyonun daha eksiksiz bir resmi elde edilebilir. Hücre içi kalsiyum homeostazının anlaşılması, doğal olduğu kadar stresli ve dışsal uyaranlara verilen çeşitli yanıtların araştırılması için çok önemlidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Hipokampal disfonksiyon Fetal alkol spektrum bozuklukları, fare modeli değerlendirmek için izleme Eyeblink Klasik koşullanma kullanımı

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Antikor aracılıklı Tau izni Microglia tarafından eğitim için tahlil hücre tabanlı

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

İnsan Trombositlerinde Amotrofik Lateral Sklerozun Potansiyel Biyobelirteçlerini Aramak İçin Kapiller Elektroforez İmmünoassay Kullanımı

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Axon İlk Segmentlerinin Montajını İncelemek için Birincil Kültürlü Hipokampal Nöronların Kullanımı

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

C. elegans Amyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Motor Bozukluğun Değerlendirilmesi

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...