Name: real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af NIH R35 GM133435 til D.F.

Alle forsøgsdyreforsøg blev udført med 200 μm, faste, sektionerede musehjerner i overensstemmelse med protokollen (# 4395-01) godkendt af Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Washington. Vildtypemus (C57BL/6J-stamme) aflives med CO2. Derefter udføres en kraniotomi for at ekstrahere deres hjerner til fiksering i 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvand. Hjernerne er indlejret i en 3% agarose og 0,3% gelatineblanding og opdelt i 200 μm tykke skiver af et vibratom.
<p c...

<ol>
	<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Cui, M., Zhang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+and+computational+pathology.">Artificial intelligence and computational pathology.</a> Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li><li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).</li><li>Ji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+detection+of+brain+tumors+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).</li><li>Hollon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+real-time+intraoperative+brain+tumor+diagnosis+using+stimulated+Raman+histology+and+deep+neural+networks.">Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks.</a> Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+assessment+of+skull+base+tumors+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).</li><li>Lu, F. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+neurosurgical+pathology+with+stimulated+Raman+imaging.">Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging.</a> Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+imaging+of+breast+calcifications+in+association+with+neoplastic+processes.">Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes.</a> Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).</li><li>Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+imaging+with+stimulated+Raman+scattering+by+chirped+femtosecond+lasers.">Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).</li><li>Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microscale+temperature+imaging+by+stimulated+Raman+scattering.">Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).</li><li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering.">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li><li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+intracellular+distribution+of+tyrosine+kinase+inhibitors+in+living+cells+with+quantitative+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering.">Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering.</a> Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism.">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li><li>Tsai, P. S., et al., Frostig, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles,+design,+and+construction+of+a+two-photon+laser-scanning+microscope+for+in+vitro+and+in+vivo+brain+imaging.">Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging.</a> In Vivo Optical Imaging of Brain. , 113-171 (2002).</li><li>Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+pathology+by+spectrally+sliced+femtosecond+stimulated+Raman+scattering+(SRS)+microscopy.">Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy.</a> PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).</li><li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source.">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator.">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li><li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging.">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li><li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li><li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li><li>Wright, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+for+enhanced+signal+in+CARS+microscopy.">Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy.</a> Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).</li></ol>

Det tofarvede SRS-billeddannelsesskema, der præsenteres i denne protokol, afhænger af korrekt implementering af enfarvet SRS-billeddannelse. I enfarvet SRS-billeddannelse er de kritiske trin rumlig justering, tidsmæssig justering, moduleringsdybde og faseskift. Rumlig kombination af de to bjælker opnås af et dikroisk spejl. Flere styrespejle bruges til finjustering, når bjælkerne sendes til det dikroiske spejl. Når bjælkerne er kombineret med det dikroiske spejl, kan rumlig justering bekræftes ved at plukke den...

Traditionel vævsdiagnostik er afhængig af farvningsprotokoller efterfulgt af undersøgelse under et optisk mikroskop. En almindelig farvningsmetode, der anvendes af patologer, er H & E-farvning: hæmatoxylin pletter cellekerner en purpurblå, og eosin pletter den ekstracellulære matrix og cytoplasma pink. Denne enkle farvning forbliver guldstandarden i patologi for mange vævsdiagnoser opgaver, især kræftdiagnose. H&E-histopatologien, især den frosne sektioneringsteknik, der anvendes i intraoperative omgivelser, har dog stadig begrænsninger. Farvningsproceduren er en besværlig proces, der involverer vævsindlejring, sektionering, fiksering og farvning1. Den typiske ekspeditionstid er 20 min eller længere. Udførelse af H&E under frossen sektionering kan nogle gange blive mere udfordrende, når flere sektioner behandles på én gang på grund af behovet for at evaluere cellulære funktioner eller vækstmønstre i 3D til marginvurdering. Desuden kræver intraoperative histologiske teknikker dygtige teknikere og klinikere. Begrænsning i antallet af bestyrelsescertificerede patologer på mange hospitaler er i mange tilfælde en begrænsning for intraoperativ konsultation. Sådanne begrænsninger kan afhjælpes med de hurtigt udviklende interesser i digital patologi og kunstig intelligensbaseret diagnose2. H&E-farvningsresultaterne varierer imidlertid afhængigt af teknikerens erfaring, hvilket giver yderligere udfordringer for computerbaseret diagnose2.
Disse udfordringer kan potentielt løses med etiketfri optiske billeddannelsesteknikker. En sådan teknik er SRS-mikroskopi. SRS bruger synkroniserede pulserende lasere - pumpe og Stokes - til at ophidse molekylære vibrationer med høj effektivitet3. Nylige rapporter har vist, at SRS-billeddannelse af proteiner og lipider kan generere H & E-ækvivalente billeder (også kendt som stimuleret Raman-histologi eller SRH) med intakt frisk væv, som omgår behovet for enhver vævsbehandling, forkorter den tid, der er nødvendig til diagnose, betydeligt og er blevet tilpasset intraoperativt4. Desuden kan SRS-billeddannelse give 3D-billeder, som giver yderligere oplysninger til diagnose, når 2D-billeder er utilstrækkelige5. SRH er upartisk og genererer digitale billeder, der er let tilgængelige til computerbaseret diagnose. Det viser sig hurtigt som en mulig løsning til intraoperativ kræftdiagnose og tumormargenanalyse, især i hjernekræft 6,7,8. For nylig er SRS-billeddannelse af kemiske ændringer i væv også blevet foreslået for at give nyttige diagnostiske oplysninger, der yderligere kan hjælpe klinikere med at stratificere forskellige kræfttyper eller stadier9.
På trods af sit enorme potentiale inden for vævsdiagnoseapplikationer er SRS-billeddannelse for det meste begrænset til akademiske laboratorier specialiseret i optik på grund af kompleksiteten forbundet med billeddannelsesplatformen, som omfatter ultrahurtige lasere, laserscanningsmikroskopet og sofistikeret detektionselektronik. Denne protokol giver en detaljeret arbejdsgang for at demonstrere brugen af en fælles femtosekundlaserkilde til realtids, tofarvet SRS-billeddannelse og generering af pseudo-H & E-billeder fra musehjernevæv. Protokollen vil omfatte følgende procedurer:
Justering og kvidren optimering De fleste SRS-billeddannelsesordninger bruger enten picosekund- eller femtosekundlasere som excitationskilde. Med femtosekundlasere er laserens båndbredde meget større end Raman-linjebredden. For at overvinde denne begrænsning bruges en spektralfokuseringsmetode til at kvidre femtosekundlaserne til en picosekundtidsskala for at opnå smal spektralopløsning10. Optimal spektralopløsning opnås kun, når den tidsmæssige kvidren (også kendt som gruppens forsinkelsesspredning eller bare spredning) er korrekt matchet for pumpen og Stokes-laserne. Justeringsproceduren og de trin, der er nødvendige for at optimere spredningen af laserstrålerne ved hjælp af stærkt dispergerende glasstænger, demonstreres her.
Kalibrering af frekvens En fordel ved spektralfokuserende SRS er, at Raman-excitationen hurtigt kan indstilles ved at ændre tidsforsinkelsen mellem pumpen og Stokes-laserne. En sådan tuning giver hurtig billeddannelse og pålidelig spektral erhvervelse sammenlignet med tuning laser bølgelængder. Det lineære forhold mellem excitationsfrekvens og tidsforsinkelse kræver imidlertid ekstern kalibrering. Organiske opløsningsmidler med kendte Raman-toppe bruges til at kalibrere Raman-frekvensen til spektralfokusering af SRS.
Tofarvet billeddannelse i realtid Det er vigtigt at øge billeddannelseshastigheden i vævsdiagnoseapplikationer for at forkorte den tid, der er nødvendig til analyse af store vævsprøver. Samtidig tofarvet SRS-billeddannelse af lipider og proteiner undgår behovet for at indstille laseren eller tidsforsinkelsen, hvilket øger billeddannelseshastigheden med mere end to gange. Dette opnås ved hjælp af en ny ortogonal moduleringsteknik og dobbeltkanals demodulation med en fastlåsningsforstærker11. Dette papir beskriver protokollen for ortogonal modulering og dual-channel billedoptagelse.
Epi-mode SRS-billeddannelse Størstedelen af SRS-billeddannelse, der er vist til dato, udføres i transmissionstilstand. Epi-mode imaging registrerer backscattered fotoner fra væv12. Til patologiske anvendelser kan kirurgiske prøver være ret store. Til transmissionstilstandsbilleddannelse er vævssektionering ofte nødvendig, hvilket uønsket kræver ekstra tid. I modsætning hertil kan epi-mode billeddannelse arbejde med intakte kirurgiske prøver. Fordi det samme mål bruges til at indsamle backscattered lys, er der heller ikke behov for at justere en høj numerisk blændekondensator, der kræves til transmissionsbilleddannelse. Epi-mode er også den eneste mulighed, når vævssektionering er vanskelig, såsom med knogle. Tidligere har vi vist, at for hjernevæv tilbyder epi-mode imaging overlegen billeddannelseskvalitet for vævstykkelse > 2 mm13. Denne protokol bruger en polariserende strålesplitter (PBS) til at indsamle spredte fotoner depolariseret af væv. Det er muligt at indsamle flere fotoner med en ringformet detektor på bekostning af kompleksiteten af tilpasset detektorsamling12. PBS-tilgangen er enklere at implementere (svarende til fluorescens), idet standardfotodioden allerede bruges til transmissionstilstandsdetektion.
Pseudo-H&E-billedgenerering Når SRS-billeder i to farver er indsamlet, kan de farves igen for at simulere H&E-farvning. Dette papir demonstrerer proceduren for konvertering af lipid- og protein SRS-billeder til pseudo-H & E SRS-billeder til patologiske applikationer. Den eksperimentelle protokol beskriver kritiske trin, der er nødvendige for at generere SRS-billeder i høj kvalitet. Proceduren vist her gælder ikke kun for vævsdiagnose, men kan også tilpasses til mange andre hyperspektrale SRS-billeddannelsesapplikationer såsom lægemiddelbilleddannelse og metabolisk billeddannelse14,15.
Generelle systemkrav Lasersystemet til denne protokol skal kunne udsende 2 synkroniserede femtosekundlaserstråler. Systemer har ideelt set en optisk parametrisk oscillator (OPO) til bred bølgelængdeindstilling af en af laserstrålerne. Opsætningen i denne protokol bruger et kommercielt lasersystem Insight DS+, der udsender to lasere (en fast stråle ved 1.040 nm og en OPO-baseret tunbar stråle, der spænder fra 680 til 1.300 nm) med en gentagelseshastighed på 80 MHz. Laserscanningsmikroskoper, enten fra større mikroskopproducenter eller hjemmebyggede, kan bruges til SRS-billeddannelse. Det anvendte mikroskop er et opretstående laserscanningsmikroskop bygget oven på en kommerciel opretstående mikroskopramme. Et par 5 mm galvo spejle bruges til at scanne laserstrålen. For brugere, der vælger at vedtage et hjemmebygget laserscanningsmikroskop, henvises til en tidligere offentliggjort protokol til konstruktion af et laserscanningsmikroskop16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-100-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 MHz bandpass filter</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>BBP-21.4+</td>
			<td>Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-200-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Half Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA2210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband half waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Quarter Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA4210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband quarter waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Sampler</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BSN11</td>
			<td>10:90 Plate Beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DMSP1000</td>
			<td>Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrooptic Amplitude Modulator</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>EO-AM-NR-C1</td>
			<td>Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>False H&#38;E Staining Script</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fanout Buffer</td>
			<td>PRL-414B</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Photodiode</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DET10A2</td>
			<td>Si Detector, 1 ns Rise Time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frequency Divider</td>
			<td>PRL-220A</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly Dispersive Glass Rods</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>CYLROD01</td>
			<td>High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight DS+</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Liquid Instruments</td>
			<td>Moku Lab</td>
			<td>Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BB05-E03-10</td>
			<td>Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Delay Stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-DMQ12P-DE52</td>
			<td>Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersion Condensor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CSC1003</td>
			<td>1.4 NA. Other condensers with NA&#62;1.2 can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS7054</td>
			<td>Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Shifter</td>
			<td>SigaTek</td>
			<td>SF50A2</td>
			<td>For shifting the phase of the modulation frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu Corp</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td>Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing Beam Splitter</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>PBS9025-620-1000</td>
			<td>Broadband polarizing beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refactive Index Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>refractiveindex.info</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retro-reflector</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>34-408</td>
			<td>BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF Power Amplifier</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>ZHL-1-2W+</td>
			<td>Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan Mirrors</td>
			<td>Cambridge Technologies</td>
			<td>6215H</td>
			<td>We used a 5mm mirror set with silver coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio</td>
			<td>ScanImage Basic</td>
			<td>Laser scanning microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FESH1000</td>
			<td>25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse FN1</td>
			<td>Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Immersion Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis

Stimuleret Raman scattering (SRS) mikroskopi har vist sig som en kraftfuld optisk billeddannelsesteknik til vævsdiagnose. I de senere år har tofarvet SRS vist sig at være i stand til at levere hæmatoxylin og eosin (H & E) -ækvivalente billeder, der muliggør hurtig og pålidelig diagnose af hjernekræft. En sådan kapacitet har muliggjort spændende intraoperative kræftdiagnoseapplikationer. Tofarvet SRS-billeddannelse af væv kan udføres med enten en picosekund eller femtosekund laserkilde. Femtosekundlasere har den fordel, at de muliggør fleksible billedbehandlingstilstande, herunder hurtig hyperspektral billeddannelse og tofarvet SRS-billeddannelse i realtid. En spektralfokuserende tilgang med kvidrede laserimpulser bruges typisk med femtosekundlasere for at opnå høj spektralopløsning. 
Tofarvet SRS-erhvervelse kan realiseres med ortogonal modulering og lock-in-detektion. Kompleksiteten af pulskvidren, modulering og karakterisering er en flaskehals for den udbredte vedtagelse af denne metode. Denne artikel indeholder en detaljeret protokol til at demonstrere implementeringen og optimeringen af spektralfokuserende SRS og tofarvet billeddannelse i realtid af musehjernevæv i epi-tilstand. Denne protokol kan bruges til en bred vifte af SRS-billedbehandlingsapplikationer, der udnytter SRS's højhastigheds- og spektroskopiske billeddannelseskapacitet.

Optimering af spektralopløsning: Dispersion gennem et materiale påvirkes af det dispergerende medium (længde og materiale) og bølgelængde. Ændring af dispersionsstangens længde påvirker spektralopløsningen og signalstørrelsen. Det er et give-and-take-forhold, der kan vejes forskelligt afhængigt af applikationen. Stængerne strækker strålepulsen ud fra at være bred i frekvens og smal i tid til at være smal i frekvens og bred i tid. Figur 7 viser effekten af ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimuleret Raman scattering (SRS) mikroskopi er en kraftfuld, ikke-destruktiv og etiketfri billeddannelsesteknik. En ny applikation er stimuleret Raman histologi, hvor tofarvet SRS-billeddannelse ved protein- og lipid Raman-overgangene bruges til at generere pseudo-hæmatoxylin- og eosinbilleder. Her demonstrerer vi en protokol til realtids, tofarvet SRS-billeddannelse til vævsdiagnose.

Realtids, tofarvet stimuleret Raman-spredningsbilleddannelse af musehjerne til vævsdiagnose

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Denne protokol vil demonstrere implementering og optimering af spektralfokuserende SRS-mikroskopi, og hvordan den kan bruges til realtidsstimulerede Raman-histologiapplikationer. Den største fordel ved denne teknik er den hastighed, hvormed prøver kan behandles, når instrumenteringen er korrekt justeret, da SRS ikke kræver vævsbehandling og farvning. Denne protokol gælder for andre SRS-applikationer, ikke kun begrænset til histologi.Sådanne anvendelser indbefatter små molekyler, lægemidler, celler og væv. Begynd med at installere et par akromatiske linser til pumpestrålen for at forstørre laserstrålestørrelsen med det dobbelte som udgangspunkt. Placer et 100 og 200 millimeter objektiv på cirka 300 millimeter fra hinanden.Juster derefter pumpestrålen gennem midten af begge linser. Placer derefter et spejl efter det andet objektiv for at sende strålen mod en væg mere end en meter væk. Spor strålen fra spejlet til væggen med et IR-kort, og kontroller, om strålen ændres i størrelse.Kollimate strålen, hvis strålen ændres i størrelse som en funktion af afstanden. Kombiner de to laserstråler ved at installere et dikroisk spejl med flere ratspejle til justering. Optimer den rumlige overlapning af pumpen og Stokes ved at overvåge stråler efter det dikroiske spejl på to forskellige positioner omkring en meter fra hinanden.Justerativt styrespejlet efterfulgt af det dikroiske spejl for at justere Stokes-strålen med pumpestrålen. Sørg for, at de kombinerede stråler sendes til midten af laserscanningsmikroskopets scanningsspejle ved at justere et par ratspejle, når scanningsspejlene er i parkeret position. Efter kondensatoren skal du bruge et andet par linser med brændvidder på henholdsvis 100 millimeter og 30 millimeter til at videresende den transmitterede stråle til fotodioden, hvilket sikrer, at begge stråler er indeholdt i fotodioden.Installer derefter to lavpasfiltre for at blokere den modulerede Stokes-stråle. Placer en stråleprøveudtager i Stokes-strålebanen for at opfange 10% af strålen og sende den til en hurtig fotodiode for at detektere 80 megahertz-pulstoget. Tag en af udgangene fra fanoutbufferen, og filtrer den med et båndpasfilter for at opnå en 20 megahertz sinusformet bølge.Brug derefter en RF-dæmper til at justere udgangstoppen til spidsspænding til ca. 500 millivolt. Send det resulterende output til en faseskifter, som muliggør finjustering af RF-fasen med en spændingskilde. Send denne udgang til en RF-effektforstærker, og tilslut forstærkerens udgang til EOM'en.Når du har fjernet blokeringen af Stokes-strålen, skal du optimere moduleringsdybden for den første EOM ved at placere en fotodiode i strålebanen. Juster EOM-spændingen og kvartbølgepladen, indtil moduleringsdybden ser ud til at være tilfredsstillende. Placer en fotodiode efter det dikroiske spejl for at detektere laserstrålen.Bloker Stokes-strålen først, og zoom derefter ind på en af pumpens pulstoppe på oscilloskopet. Placer en lodret markør for at markere den tidsmæssige position af denne top med oscilloskopet. Bloker nu pumpestrålen, og fjern blokeringen af Stokes-strålen.Oversæt forsinkelsesfasen for midlertidigt at matche toppositionerne på oscilloskopet til den markerede position i det foregående trin. Ved at beregne den forsinkelsesafstand, der kræves for at matche de to bjælker, efterfulgt af forlængelse af den hurtigere stråles strålebane eller forkortelse af den langsommere stråles strålebane. Forbered derefter en mikroskopdiasprøve med DMSO og dobbeltsidet tape som afstandsforehold for at holde prøven mellem diaset og et dækslip.Placer prøven på mikroskopet med dækslipsiden vendt mod mikroskopets mål, og observer prøven fra I-stykket under lysfeltbelysning. Find prøvens fokus på både det øverste og nederste lag af luftbobler ved glasbåndgrænsefladen, og flyt derefter fokus til at være mellem de to lag af båndet. Indstil derefter den indstillelige stråleudgang til 798 nanometer.Baseret på kondensatorens optiske gennemstrømning skal du justere den optiske effekt til at være ca. 40 milliwatt hver for pumpen og Stokes-strålerne ved det objektive fokus. Åbn derefter scanningsbilledet i MATLAB, og klik på knappen mærket fokus for at starte scanningen. Juster styrespejlet før galvo-scanneren for at centrere DC-signalet på kanal 1-displayet.Flyt det motoriserede forsinkelsestrin, og observer nøje den fastlåsningsudgang, der vises på kanal to-displayet. Til sidst skal du justere tidsforsinkelsen for at maksimere VEKselstrømssignalintensiteten. Juster det dikroiske spejl for at centrere SRS-signalet på vekselstrømskanalen.Juster derefter fasen af indlåsningsforstærkeren for at maksimere signalet. Efter montering glider prøven på mikroskopet og justerer effekten af begge stråler til ca. 40 milliwatt hver ved prøvefokus som vist tidligere. Åbn scanningsbillede fra MATLAB.Find derefter det maksimale SRS-signal ved at scanne gennem forsinkelsestrinnet svarende til DMSO's 2.913 inverse centimeter Raman-top. Erhverv et SRS-billede svarende til DMSO's 2.913 omvendte centimeter Raman-top. Åbn billedet i ImageJ, og vælg et lille område i midten af rammen.Brug målefunktionen til at beregne gennemsnits- og standardafvigelsen for værdier i det valgte område. Til kalibrering af frekvensadgang skal du gemme en hyperspektral scanning med forsinkelsestrinområdet, der dækker DMSO's 2, 913 og 2.994 omvendte centimeter Raman-toppe. Gem derefter de scenepositioner, der svarer til det hyperspektrale datasæt.Udfør lineær regression for scenepositionerne, og Raman skifter ved 2, 913 og 2.994 inverse centimeter. Ved hjælp af den lineære regressionsligning skal du konvertere forsinkelsespositionerne til de tilsvarende Raman-frekvenser. Til kalibrering af spektralopløsning estimeres trinpositionen baseret på den foregående position med den øgede optiske banelængde på grund af indsættelse af stænger.Justering af bjælkerne rumlig overlapning på grund af strålens lille afvigelse, når der tilføjes glasstænger. Installer en polariserende strålesplitter, en kvart bølgeplade og en anden EOM i soaks beam-stien efter den første EOM. Tag signalindgangen ud til den anden EOM, sæt derefter signalindgangen i den første EOM, og tænd den.Moduler Stokes-strålen ved 20 megahertz ved at sende strålen gennem den første EOM. Juster hældningen og positionen af den første EOM for at sikre, at strålen er centreret gennem EOM-krystallen. Forbered en vævsdiasprøve med dobbeltsidet tape, mikroskopdias og dækglas.Placer prøven på mikroskopet med dækslipsiden vendt mod mikroskopets mål. Til epi-mode SRS-billeddannelse skal du installere en halvbølgeplade, før strålen kommer ind i mikroskopet for at ændre polariseringen af strålen, der går ind i mikroskopet. Placer en polariserende strålesplitter over målet for at tillade den depolariserede reflekterede stråle at nå detektoren.Brug derefter en 75 millimeter achhromatlinse og en 30 millimeter asfærisk linse til at videresende de bageste spredte fotoner fra målets bageste blænde til fotodetektoren. Monter detektoren for at opsamle det tilbagespredte lys, der styres af den polariserende strålesplitter. Installer derefter et filter for at blokere den modulerede stråle fra at komme ind i detektoren.Varierende stanglængder påvirker spektralopløsningen. Når der ikke anvendes glaskviddestænger, løses de to Raman-toppe fra DMSO slet ikke. En stigning i antallet af glaskvidrende stænger begynder at løse de to toppe på et tilfredsstillende punkt.Matchet kvidren løser begge toppe og kan bruges til at kalibrere scenepositioner til frekvens. To tidsforsinkede pulstog med ortogonal polarisering, der bruges til at afbilde DMSO-spektre, viser tidsforsinkelsen mellem SRS-excitationerne med acceptabel moduleringsdybde og tidsmæssig adskillelse. I modsætning hertil giver et dårligt tofarvet SRS-faseskift anledning til omvendte eller negative toppe.Realtids SRS-billeddannelse i to farver ved 2, 850 og 2.930 omvendte centimeter ex vivo-musehjernevæv er vist her. De rå lipid- og proteinbilleder blev farvekodet for at producere et enkelt billede, der skildrede lipid- og proteinbidrag. Falsk hæmatoxylin og eosin omfarvning, blev også udført for at efterligne hæmatoxylin og eosin farvning til patologiske anvendelser.Rumlig tidsmæssig overlapning og optimering af rumlig opløsning er de vigtigste trin for SRS's rumlige fokuseringstilgang. Denne metode er generelt anvendelig til andre pumpesondemikroskopiforsøg såsom forbigående absorptionsmikroskopi. Metoden giver også mulighed for billeddannelse af ikke-fluorescerende molekyler i celler og væv.Metoden, der præsenteres her, fremskynder billedoptagelsestiden for fremtidig oversættelse af stimuleret Raman-histologi i klinikken.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri overvågning af celler og ekstracellulær matrix ved hjælp af Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Håndholdt Tre-dimensionel Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Menneskelig angiografi og Funktionelle Prækliniske studier i Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Brug af Cell-substrat Impedans og levende celler Imaging at måle realtid Ændringer i cellulær adhæsion og De-vedhæftning induceret af Matrix Ændring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Real-time overvågning af High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) ablation af<em&gt; In vitro</em&gt; Canine Lever Brug Harmonisk Motion Imaging for fokuseret ultralyd (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Håndholdte kliniske Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasiv små dyr Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

En protokol til Real-time 3D enkelt partikel Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ Mikroskopi for realtids bestemmelse af enkelt celle morfologi i Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In vivo to-farvet 2-foton billeddannelse af genetisk mærkede reporter celler i huden

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Real-Time Intravital Multiphoton Mikroskopi til at visualisere fokuseret ultralyd og microbubble behandlinger for at øge blod - hjerne barriere permeabilitet

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Billeddannelse af biologisk væv med kombineret to-fotonfluorescens og stimuleret Raman-spredningsmikroskopi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...