Name: real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door NIH R35 GM133435 tot D.F.

Alle experimentele dierprocedures werden uitgevoerd met 200 μm, vaste, gesegmenteerde muizenhersenen, in overeenstemming met het protocol (# 4395-01) goedgekeurd door het Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Washington. Wild-type muizen (C57BL/6J stam) worden geëuthanaseerd met CO2. Vervolgens wordt een craniotomie uitgevoerd om hun hersenen te extraheren voor fixatie in 4% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing. De hersenen zijn ingebed in een 3% agarose e...

<ol>
	<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Cui, M., Zhang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+and+computational+pathology.">Artificial intelligence and computational pathology.</a> Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li><li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).</li><li>Ji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+detection+of+brain+tumors+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).</li><li>Hollon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+real-time+intraoperative+brain+tumor+diagnosis+using+stimulated+Raman+histology+and+deep+neural+networks.">Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks.</a> Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+assessment+of+skull+base+tumors+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).</li><li>Lu, F. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+neurosurgical+pathology+with+stimulated+Raman+imaging.">Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging.</a> Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+imaging+of+breast+calcifications+in+association+with+neoplastic+processes.">Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes.</a> Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).</li><li>Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+imaging+with+stimulated+Raman+scattering+by+chirped+femtosecond+lasers.">Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).</li><li>Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microscale+temperature+imaging+by+stimulated+Raman+scattering.">Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).</li><li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering.">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li><li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+intracellular+distribution+of+tyrosine+kinase+inhibitors+in+living+cells+with+quantitative+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering.">Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering.</a> Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism.">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li><li>Tsai, P. S., et al., Frostig, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles,+design,+and+construction+of+a+two-photon+laser-scanning+microscope+for+in+vitro+and+in+vivo+brain+imaging.">Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging.</a> In Vivo Optical Imaging of Brain. , 113-171 (2002).</li><li>Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+pathology+by+spectrally+sliced+femtosecond+stimulated+Raman+scattering+(SRS)+microscopy.">Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy.</a> PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).</li><li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source.">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator.">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li><li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging.">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li><li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li><li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li><li>Wright, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+for+enhanced+signal+in+CARS+microscopy.">Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy.</a> Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).</li></ol>

Het tweekleurige SRS-beeldvormingsschema dat in dit protocol wordt gepresenteerd, hangt af van de juiste implementatie van SRS-beeldvorming met één kleur. In SRS-beeldvorming met één kleur zijn de kritieke stappen ruimtelijke uitlijning, temporele uitlijning, modulatiediepte en faseverschuiving. Ruimtelijk combineren van de twee balken wordt bereikt door een dichroïsche spiegel. Verschillende stuurspiegels worden gebruikt voor fijnafstelling bij het verzenden van de balken naar de dichroïsche spiegel. Zodra de balk...

Traditionele weefseldiagnostiek is gebaseerd op kleuringsprotocollen gevolgd door onderzoek onder een optische microscoop. Een veel voorkomende kleuringsmethode die door pathologen wordt gebruikt, is H & E-kleuring: hematoxyline kleurt celkernen een paarsblauw en eosine kleurt de extracellulaire matrix en cytoplasma roze. Deze eenvoudige kleuring blijft de gouden standaard in de pathologie voor veel weefseldiagnosetaken, met name kankerdiagnose. H&E-histopathologie, met name de bevroren sectietechniek die wordt gebruikt in een intraoperatieve setting, heeft echter nog steeds beperkingen. De kleuringsprocedure is een moeizaam proces waarbij weefsel wordt ingesloten, sectie, fixatie en kleuring1. De typische doorlooptijd is 20 minuten of langer. Het uitvoeren van H & E tijdens bevroren secties kan soms een grotere uitdaging worden wanneer meerdere secties tegelijk worden verwerkt vanwege de noodzaak om cellulaire kenmerken of groeipatronen in 3D te evalueren voor margebeoordeling. Bovendien vereisen intraoperatieve histologische technieken bekwame technici en clinici. Beperking van het aantal door de raad gecertificeerde pathologen in veel ziekenhuizen is in veel gevallen een beperking voor intraoperatief overleg. Dergelijke beperkingen kunnen worden verlicht met de snelle ontwikkelingsinteresses in digitale pathologie en op kunstmatige intelligentie gebaseerde diagnose2. De H&E-kleuringsresultaten zijn echter variabel, afhankelijk van de ervaring van de technicus, wat extra uitdagingen oplevert voor computergebaseerde diagnose2.
Deze uitdagingen kunnen mogelijk worden aangepakt met labelvrije optische beeldvormingstechnieken. Een van die technieken is SRS-microscopie. SRS maakt gebruik van gesynchroniseerde gepulseerde lasers - pomp en Stokes - om moleculaire trillingen met een hoog rendement te prikkelen3. Recente rapporten hebben aangetoond dat SRS-beeldvorming van eiwitten en lipiden H & E-equivalente beelden kan genereren (ook bekend als gestimuleerde Raman-histologie of SRH) met intact vers weefsel, wat de noodzaak van weefselverwerking omzeilt, de tijd die nodig is voor diagnose aanzienlijk verkort en intraoperatief is aangepast4. Bovendien kan SRS-beeldvorming 3D-beelden leveren, wat extra informatie biedt voor diagnose wanneer 2D-beelden onvoldoende zijn5. SRH is onbevooroordeeld en genereert digitale beelden die direct beschikbaar zijn voor computergebaseerde diagnose. Het komt snel naar voren als een mogelijke oplossing voor intraoperatieve kankerdiagnose en tumormargeanalyse, vooral bij hersenkanker 6,7,8. Meer recent is SRS-beeldvorming van chemische veranderingen van weefsel ook voorgesteld om nuttige diagnostische informatie te bieden die clinici verder kan helpen bij het stratificeren van verschillende soorten kanker of stadia9.
Ondanks het enorme potentieel in weefseldiagnosetoepassingen, is SRS-beeldvorming meestal beperkt tot academische laboratoria die gespecialiseerd zijn in optica vanwege de complexiteit die gepaard gaat met het beeldvormingsplatform, dat ultrasnelle lasers, de laserscanmicroscoop en geavanceerde detectie-elektronica omvat. Dit protocol biedt een gedetailleerde workflow om het gebruik van een gemeenschappelijke femtoseconde laserbron voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming en het genereren van pseudo-H & E-beelden van hersenweefsel van muizen te demonstreren. Het protocol heeft betrekking op de volgende procedures:
Optimalisatie van uitlijning en tjirp De meeste SRS-beeldvormingsschema's gebruiken picoseconde- of femtosecondelasers als excitatiebron. Bij femtoseconde lasers is de bandbreedte van de laser veel groter dan de Raman lijnbreedte. Om deze beperking te overwinnen, wordt een spectrale focusbenadering gebruikt om de femtosecondelasers naar een picoseconde tijdschaal te tsjilpen om een smalle spectrale resolutie10 te bereiken. Optimale spectrale resolutie wordt alleen bereikt wanneer het temporele getjilp (ook bekend als de groepsvertragingsdispersie of gewoon dispersie) goed is afgestemd op de pomp en de Stokes-lasers. De uitlijningsprocedure en de stappen die nodig zijn om de dispersie van de laserstralen te optimaliseren met behulp van zeer dispersieve glazen staven worden hier gedemonstreerd.
Frequentie kalibratie Een voordeel van spectraal focus SRS is dat de Raman excitatie snel kan worden afgestemd door de tijdsvertraging tussen de pomp en de Stokes lasers te veranderen. Een dergelijke afstemming biedt snelle beeldvorming en betrouwbare spectrale acquisitie in vergelijking met het afstemmen van lasergolflengten. De lineaire relatie tussen excitatiefrequentie en tijdvertraging vereist echter externe kalibratie. Organische oplosmiddelen met bekende Raman-pieken worden gebruikt om de Raman-frequentie te kalibreren voor spectraalfocusSRS.
Real-time, tweekleurenbeeldvorming Het is belangrijk om de beeldvormingssnelheid in weefseldiagnosetoepassingen te verhogen om de tijd te verkorten die nodig is voor het analyseren van grote weefselmonsters. Gelijktijdige tweekleurige SRS-beeldvorming van lipiden en eiwitten voorkomt de noodzaak om de laser of tijdvertraging af te stemmen, waardoor de beeldvormingssnelheid meer dan twee keer toeneemt. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een nieuwe orthogonale modulatietechniek en tweekanaals demodulatie met een lock-in versterker11. Dit artikel beschrijft het protocol voor orthogonale modulatie en dual-channel beeldacquisitie.
Epi-mode SRS-beeldvorming De meeste SRS-beeldvorming die tot nu toe is getoond, wordt uitgevoerd in transmissiemodus. Epi-mode beeldvorming detecteert backscattered fotonen uit weefsel12. Voor pathologietoepassingen kunnen chirurgische monsters vrij groot zijn. Voor beeldvorming in transmissiemodus is vaak weefselsectie nodig, wat ongewenst extra tijd vereist. Epi-modus beeldvorming kan daarentegen werken met intacte chirurgische monsters. Omdat hetzelfde objectief wordt gebruikt om teruggekaatst licht te verzamelen, is het ook niet nodig om een condensor met een hoog numeriek diafragma uit te lijnen die nodig is voor transmissiebeeldvorming. Epi-modus is ook de enige optie wanneer weefselsectie moeilijk is, zoals bij bot. Eerder hebben we aangetoond dat voor hersenweefsel epi-mode beeldvorming superieure beeldvormingskwaliteit biedt voor weefseldikte > 2 mm13. Dit protocol maakt gebruik van een polariserende bundelsplitser (PBS) om verstrooide fotonen te verzamelen die door weefsel zijn gedepolariseerd. Het is mogelijk om meer fotonen te verzamelen met een ringvormige detector ten koste van de complexiteit van aangepaste detectorassemblage12. De PBS-aanpak is eenvoudiger te implementeren (vergelijkbaar met fluorescentie), waarbij de standaard fotodiode al wordt gebruikt voor detectie van transmissiemodi.
Pseudo-H&E-beeldgeneratie Zodra tweekleurige SRS-afbeeldingen zijn verzameld, kunnen ze opnieuw worden ingekleurd om H & E-kleuring te simuleren. Dit artikel demonstreert de procedure voor het converteren van lipide- en eiwit-SRS-afbeeldingen naar pseudo-H & E SRS-beelden voor pathologietoepassingen. Het experimentele protocol beschrijft kritieke stappen die nodig zijn om SRS-beelden van hoge kwaliteit te genereren. De hier getoonde procedure is niet alleen van toepassing op weefseldiagnose, maar kan ook worden aangepast voor vele andere hyperspectrale SRS-beeldvormingstoepassingen zoals beeldvorming van geneesmiddelen en metabole beeldvorming14,15.
Algemene systeemvereisten Het lasersysteem voor dit protocol moet 2 gesynchroniseerde femtoseconde laserstralen kunnen produceren. Systemen zijn idealiter voorzien van een Optische Parametrische Oscillator (OPO) voor brede golflengteafstemming van een van de laserstralen. De opstelling in dit protocol maakt gebruik van een commercieel lasersysteem Insight DS + dat twee lasers uitvoert (een vaste straal bij 1.040 nm en een op OPO gebaseerde afstembare straal, variërend van 680 tot 1.300 nm) met een herhalingsfrequentie van 80 MHz. Laserscanmicroscopen, hetzij van grote microscoopfabrikanten of zelfgebouwd, kunnen worden gebruikt voor SRS-beeldvorming. De gebruikte microscoop is een rechtopstaande laserscanmicroscoop gebouwd bovenop een commercieel rechtopstaand microscoopframe. Een paar 5 mm galvo spiegels worden gebruikt om de laserstraal te scannen. Voor gebruikers die ervoor kiezen om een zelfgebouwde laserscanmicroscoop te gebruiken, raadpleegt u een eerder gepubliceerd protocol voor de constructie van een laserscanmicroscoop16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-100-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 MHz bandpass filter</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>BBP-21.4+</td>
			<td>Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-200-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Half Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA2210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband half waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Quarter Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA4210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband quarter waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Sampler</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BSN11</td>
			<td>10:90 Plate Beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DMSP1000</td>
			<td>Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrooptic Amplitude Modulator</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>EO-AM-NR-C1</td>
			<td>Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>False H&#38;E Staining Script</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fanout Buffer</td>
			<td>PRL-414B</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Photodiode</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DET10A2</td>
			<td>Si Detector, 1 ns Rise Time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frequency Divider</td>
			<td>PRL-220A</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly Dispersive Glass Rods</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>CYLROD01</td>
			<td>High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight DS+</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Liquid Instruments</td>
			<td>Moku Lab</td>
			<td>Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BB05-E03-10</td>
			<td>Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Delay Stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-DMQ12P-DE52</td>
			<td>Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersion Condensor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CSC1003</td>
			<td>1.4 NA. Other condensers with NA&#62;1.2 can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS7054</td>
			<td>Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Shifter</td>
			<td>SigaTek</td>
			<td>SF50A2</td>
			<td>For shifting the phase of the modulation frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu Corp</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td>Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing Beam Splitter</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>PBS9025-620-1000</td>
			<td>Broadband polarizing beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refactive Index Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>refractiveindex.info</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retro-reflector</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>34-408</td>
			<td>BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF Power Amplifier</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>ZHL-1-2W+</td>
			<td>Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan Mirrors</td>
			<td>Cambridge Technologies</td>
			<td>6215H</td>
			<td>We used a 5mm mirror set with silver coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio</td>
			<td>ScanImage Basic</td>
			<td>Laser scanning microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FESH1000</td>
			<td>25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse FN1</td>
			<td>Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Immersion Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is naar voren gekomen als een krachtige optische beeldvormingstechniek voor weefseldiagnose. In de afgelopen jaren is aangetoond dat tweekleurige SRS in staat is om hematoxyline- en eosine (H & E) -equivalente beelden te leveren die een snelle en betrouwbare diagnose van hersenkanker mogelijk maken. Een dergelijk vermogen heeft spannende intraoperatieve kankerdiagnosetoepassingen mogelijk gemaakt. Tweekleurige SRS-beeldvorming van weefsel kan worden gedaan met een picoseconde of femtoseconde laserbron. Femtoseconde lasers hebben het voordeel dat ze flexibele beeldvormingsmodi mogelijk maken, waaronder snelle hyperspectrale beeldvorming en real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming. Een spectraal-focusbenadering met getjilpte laserpulsen wordt meestal gebruikt met femtosecondelasers om een hoge spectrale resolutie te bereiken. 
Tweekleurige SRS-acquisitie kan worden gerealiseerd met orthogonale modulatie en lock-in detectie. De complexiteit van pulsgefluit, modulatie en karakterisering is een knelpunt voor de wijdverspreide toepassing van deze methode. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om de implementatie en optimalisatie van spectraal-gerichte SRS en real-time, tweekleurige beeldvorming van hersenweefsel van muizen in de epi-modus te demonstreren. Dit protocol kan worden gebruikt voor een breed scala aan SRS-beeldvormingstoepassingen die gebruikmaken van de hoge snelheid en spectroscopische beeldvormingsmogelijkheden van SRS.

Spectrale resolutie optimaliseren: Dispersie door een materiaal wordt beïnvloed door het dispersieve medium (lengte en materiaal) en golflengte. Het veranderen van de lengte van de dispersiestaaf heeft invloed op de spectrale resolutie en de signaalgrootte. Het is een geven-en-nemen relatie die afhankelijk van de toepassing anders kan worden gewogen. De staven rekken de bundelpuls uit van breed in frequentie en smal in de tijd tot smal in frequentie en breed in de tijd. Figuur 7<...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.

Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Dit protocol demonstreert de implementatie en optimalisatie van spectrale focus SRS-microscopie en hoe het kan worden gebruikt voor real-time gestimuleerde Raman-histologietoepassingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de snelheid waarmee monsters kunnen worden verwerkt zodra de instrumentatie goed is uitgelijnd, omdat SRS geen weefselverwerking en kleuring vereist. Dit protocol is van toepassing op andere SRS-toepassingen, niet alleen beperkt tot histologie.Dergelijke toepassingen omvatten kleine moleculen, medicijnen, cellen en weefsels. Begin met het installeren van een paar achromatische lenzen voor de pompstraal om de grootte van de laserstraal tweevoudig te vergroten als uitgangspunt. Plaats een lens van 100 en 200 millimeter op ongeveer 300 millimeter van elkaar.Lijn vervolgens de pompstraal uit door het midden van beide lenzen. Plaats vervolgens een spiegel na de tweede lens om de straal naar een muur op meer dan een meter afstand te sturen. Traceer de straal van de spiegel naar de muur met een IR-kaart en controleer of de straal van grootte verandert.Collimeer de bundel als de bundel in grootte verandert als functie van de afstand. Combineer de twee laserstralen door een dichroïsche spiegel te installeren met verschillende stuurspiegels voor aanpassing. Optimaliseer de ruimtelijke overlap van de pomp en Stokes door stralen na de dichroïsche spiegel op twee verschillende posities op ongeveer een meter afstand van elkaar te bewaken.Pas de stuurspiegel, gevolgd door de dichroïsche spiegel, iteratief aan om de Stokes-straal uit te lijnen met de pompbalk. Zorg ervoor dat de gecombineerde stralen naar het midden van de scanspiegels van de laserscanmicroscoop worden gestuurd door een paar stuurspiegels aan te passen wanneer de scanspiegels zich in de geparkeerde positie bevinden. Gebruik na de condensor een ander paar lenzen met brandpuntsafstanden van respectievelijk 100 millimeter en 30 millimeter om de uitgezonden straal door te geven aan de fotodiode, zodat beide stralen zich in de fotodiode bevinden.Installeer vervolgens twee laagdoorlaatfilters om de gemoduleerde Stokes-balk te blokkeren. Plaats een beam sampler in het Stokes beam pad om 10% van de beam op te pikken en stuur deze naar een snelle fotodiode om de 80 megahertz pulstrein te detecteren. Neem een van de uitgangen van de fanout buffer en filter deze met een band pass filter om een sinusoïdale golf van 20 megahertz te verkrijgen.Gebruik vervolgens een RF-verzwakker om de uitgangspiek aan te passen aan de piekspanning tot ongeveer 500 millivolt. Stuur de resulterende uitgang naar een faseverschuiver, die een fijne aanpassing van de RF-fase met een spanningsbron mogelijk maakt. Stuur deze uitgang naar een RF eindversterker en sluit de uitgang van de versterker aan op de EOM.Na het deblokkeren van de Stokes-bundel optimaliseert u de modulatiediepte van de eerste EOM door een fotodiode in het straalpad te plaatsen. Pas de EOM-spanning en kwartgolfplaat aan totdat de modulatiediepte bevredigend lijkt. Plaats een fotodiode achter de dichroïsche spiegel om de laserstraal te detecteren.Blokkeer eerst de Stokes-bundel en zoom vervolgens in op een van de pomppulspieken op de oscilloscoop. Plaats een verticale cursor om de temporele positie van deze piek met de oscilloscoop te markeren. Blokkeer nu de pompbalk en deblokkeer de Stokes-balk.Vertaal de vertragingsfase om de piekposities op de oscilloscoop tijdelijk af te stemmen op de gemarkeerde positie in de vorige stap. Door de vertragingsafstand te berekenen die nodig is om de twee balken overeen te laten komen, gevolgd door het verlengen van het bundelpad van de snellere bundel of het verkorten van het bundelpad van de langzamere bundel. Maak vervolgens een microscoopglaasje met DMSO en dubbelzijdige tape als afstandhouder om het monster tussen de dia en een coverslip te houden.Plaats het monster op de microscoop met de coverslipzijde naar het microscoopobjectief gericht en observeer het monster van het I-stuk onder felle veldverlichting. Zoek de focus van het monster op zowel de bovenste als de onderste laag luchtbellen op de interface van de glastape en verplaats de focus om tussen de twee lagen van de tape te zijn. Stel vervolgens de instelbare bundeluitgang in op 798 nanometer.Stel op basis van de optische doorvoer van de condensor het optische vermogen in op ongeveer 40 milliwatt per stuk voor de pomp- en Stokes-bundels op de objectieve focus. Open vervolgens de scanafbeelding in MATLAB en klik op de knop met het label focus om het scannen te starten. Pas de stuurspiegel voor de galvo-scanner aan om het DC-signaal op het display van kanaal één te centreren.Verplaats de gemotoriseerde vertragingstrap en observeer nauwgezet de vergrendelingsuitgang die wordt weergegeven op het display van kanaal twee. Pas ten slotte de tijdvertraging aan om de ac-signaalintensiteit te maximaliseren. Pas de dichroïsche spiegel aan om het SRS-signaal op het AC-kanaal te centreren.Pas vervolgens de fase van de lock-in versterker aan om het signaal te maximaliseren. Na montage van het monster glijdt u op de microscoop en stelt u het vermogen van beide bundels aan op ongeveer 40 milliwatt elk bij monsterfocus zoals eerder aangetoond. Open scanafbeelding van MATLAB.Zoek vervolgens het maximale SRS-signaal door door de vertragingsfase te scannen die overeenkomt met de 2.913 inverse centimeter Raman-piek van DMSO. Verkrijg een SRS-afbeelding die overeenkomt met de 2.913 inverse centimeter Raman-piek van DMSO. Open de afbeelding in ImageJ en selecteer een klein gebied in het midden van het frame.Gebruik de meetfunctie om het gemiddelde en de standaarddeviatie van waarden in het geselecteerde gebied te berekenen. Voor kalibratie van frequentietoegang slaat u een hyperspectrale scan op met het vertragingsstadiumbereik dat de Raman-pieken van 2, 913 en 2, 994 inverse centimeter van DMSO bestrijkt. Sla vervolgens de faseposities op die overeenkomen met de hyperspectrale gegevensset.Voer lineaire regressie uit voor de podiumposities en Raman verschuift op 2, 913 en 2, 994 inverse centimeters. Gebruik de lineaire regressievergelijking om de vertragingsposities om te zetten in de overeenkomstige Raman-frequenties. Voor kalibratie van spectrale resolutie schat u de podiumpositie op basis van de vorige positie met de toegenomen optische padlengte als gevolg van het inbrengen van staafjes.Richt de ruimtelijke overlap van de balken opnieuw uit vanwege de kleine afwijking van de balk wanneer glazen staven worden toegevoegd. Installeer een polariserende bundelsplitser, een kwartgolfplaat en een tweede EOM in het soaks beam-pad na de eerste EOM. Koppel de signaalingang los van de tweede EOM, sluit vervolgens de signaalingang aan op de eerste EOM en schakel deze in.Moduleer de Stokes-bundel op 20 megahertz door de bundel door de eerste EOM te sturen. Pas de kanteling en positie van de eerste EOM aan om ervoor te zorgen dat de straal door het EOM-kristal wordt gecentreerd. Bereid een weefseldiamonster voor met dubbelzijdige tape, microscoopglaasje en afdekglas.Plaats het monster op de microscoop met de coverslipzijde naar het microscoopobjectief gericht. Voor epi-mode SRS-beeldvorming installeert u een halvegolfplaat voordat de bundel de microscoop binnengaat om de polarisatie van de bundel die in de microscoop gaat te veranderen. Plaats een polariserende bundelsplitser boven het objectief om de gedepolariseerde teruggekaatste straal de detector te laten bereiken.Gebruik vervolgens een achromaatlens van 75 millimeter en een asferische lens van 30 millimeter om de verstrooide fotonen van de achterkant van het objectief door te geven aan de fotodetector. Monteer de detector om het verstrooide licht terug te verzamelen dat wordt geleid door de polariserende bundelsplitser. Installeer vervolgens een filter om te voorkomen dat de gemoduleerde straal de detector binnendringt.Het variëren van de staaflengtes heeft invloed op de spectrale resolutie. Wanneer er geen glazen tjilpende staven worden gebruikt, worden de twee Raman-pieken van DMSO helemaal niet opgelost. Een toename van het aantal glazen tjilpende staven begint de twee pieken op een bevredigend punt op te lossen.Afgestemd getjilp lost beide pieken op en kan worden gebruikt om podiumposities op frequentie te kalibreren. Twee tijdsvertragende pulstreinen van orthogonale polarisatie die worden gebruikt om DMSO-spectra in beeld te brengen, tonen de tijdsvertraging tussen de SRS-excitaties met acceptabele modulatiediepte en temporele scheiding. Een slechte tweekleurige SRS-faseverschuiving daarentegen geeft aanleiding tot omgekeerde of negatieve pieken.Real-time twee kleuren SRS-beeldvorming op 2, 850 en 2, 930 inverse centimeters ex vivo muis hersenweefsel worden hier getoond. De ruwe lipide- en eiwitafbeeldingen werden kleurgecodeerd om een enkele afbeelding te produceren met lipide- en eiwitbijdragen. Valse hematoxyline en eosine herkleuring, werden ook uitgevoerd om hematoxyline en eosine kleuring na te bootsen voor pathologische toepassingen.Ruimtelijke temporele overlap en ruimtelijke resolutie optimalisatie zijn de belangrijkste stappen voor de ruimtelijke focusbenadering van SRS. Deze methode is algemeen toepasbaar voor andere pompsondemicroscopie-experimenten zoals transiënte absorptiemicroscopie. De methode maakt het ook mogelijk om niet-fluorescerende moleculen in cellen en weefsel in beeld te brengen.De hier gepresenteerde methode versnelt de beeldverwervingstijd voor toekomstige vertaling van gestimuleerde Raman-histologie in de kliniek.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-contact, Label-free monitoring van cellen en extracellulaire matrix met behulp van Raman spectroscopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Hand-held Driedimensionale opto-akoestische Imaging Probe voor Deep Tissue Human-angiografie en Functional preklinisch Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Real-time monitoring van High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation van<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Levers behulp Harmonic Motion Imaging voor Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Hand-held klinische Photoacoustic Imaging systeem voor Real-time niet-invasieve kleine dierlijke Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Een Protocol voor Real-time 3D één deeltje Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ Microscopie voor real-time bepaling van eencellige morfologie in bioprocessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In vivo tweekleurige 2-Fobe beeldvorming van genetisch gelabelde reporter cellen in de huid

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Real-time intravitale multifotonenmicroscopie om gerichte echografie en microbubbelbehandelingen te visualiseren om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te vergroten

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...