Name: real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Denne studien ble støttet av NIH R35 GM133435 til D.F.

Alle eksperimentelle dyreprosedyrer ble utført med 200 μm, faste, seksjonerte musehjerner, i samsvar med protokollen (# 4395-01) godkjent av Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Washington. Wild-type mus (C57BL/6J-stamme) avlives med CO2. Deretter utføres en kraniotomi for å trekke ut hjernen for fiksering i 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann. Hjernene er innebygd i en 3% agarose og 0,3% gelatinblanding og seksjonert i 200 μm tykke skiver av en vibratom.
<p clas...

<ol>
	<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Cui, M., Zhang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+and+computational+pathology.">Artificial intelligence and computational pathology.</a> Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li><li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).</li><li>Ji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+detection+of+brain+tumors+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).</li><li>Hollon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+real-time+intraoperative+brain+tumor+diagnosis+using+stimulated+Raman+histology+and+deep+neural+networks.">Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks.</a> Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+assessment+of+skull+base+tumors+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).</li><li>Lu, F. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+neurosurgical+pathology+with+stimulated+Raman+imaging.">Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging.</a> Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+imaging+of+breast+calcifications+in+association+with+neoplastic+processes.">Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes.</a> Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).</li><li>Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+imaging+with+stimulated+Raman+scattering+by+chirped+femtosecond+lasers.">Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).</li><li>Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microscale+temperature+imaging+by+stimulated+Raman+scattering.">Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).</li><li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering.">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li><li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+intracellular+distribution+of+tyrosine+kinase+inhibitors+in+living+cells+with+quantitative+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering.">Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering.</a> Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism.">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li><li>Tsai, P. S., et al., Frostig, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles,+design,+and+construction+of+a+two-photon+laser-scanning+microscope+for+in+vitro+and+in+vivo+brain+imaging.">Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging.</a> In Vivo Optical Imaging of Brain. , 113-171 (2002).</li><li>Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+pathology+by+spectrally+sliced+femtosecond+stimulated+Raman+scattering+(SRS)+microscopy.">Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy.</a> PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).</li><li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source.">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator.">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li><li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging.">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li><li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li><li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li><li>Wright, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+for+enhanced+signal+in+CARS+microscopy.">Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy.</a> Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).</li></ol>

Det tofargede SRS-bildebehandlingsskjemaet som presenteres i denne protokollen, avhenger av riktig implementering av enfarget SRS-avbildning. I enfarget SRS-avbildning er de kritiske trinnene romlig justering, tidsjustering, modulasjonsdybde og faseskift. Romlig kombinere de to bjelkene oppnås av et dikroisk speil. Flere styrespeil brukes til finjustering når du sender bjelkene til det dikroiske speilet. Når bjelkene er kombinert med det dikroiske speilet, kan romlig justering bekreftes ved å plukke av den kombinerte...

Tradisjonell vevsdiagnostikk er avhengig av fargingsprotokoller etterfulgt av undersøkelse under et optisk mikroskop. En vanlig fargingsmetode som brukes av patologer er H&E-farging: hematoksylin flekker cellekjerner en purplish blå, og eosin flekker den ekstracellulære matrisen og cytoplasma rosa. Denne enkle fargingen forblir gullstandarden i patologi for mange vevsdiagnoseoppgaver, spesielt kreftdiagnose. Imidlertid har H&E histopatologi, spesielt den frosne seksjoneringsteknikken som brukes i en intraoperativ setting, fortsatt begrensninger. Fargingsprosedyren er en arbeidskrevende prosess som involverer vevsinnbygging, seksjonering, fiksering og farging1. Den typiske behandlingstiden er 20 min eller lenger. Å utføre H&E under frossen seksjonering kan noen ganger bli mer utfordrende når flere seksjoner behandles samtidig på grunn av behovet for å evaluere mobilfunksjoner eller vekstmønstre i 3D for marginvurdering. Videre krever intraoperative histologiske teknikker dyktige teknikere og klinikere. Begrensning i antall styresertifiserte patologer på mange sykehus er en begrensning for intraoperativ konsultasjon i mange tilfeller. Slike begrensninger kan lindres med de raske utviklingsinteressene i digital patologi og kunstig intelligensbasert diagnose2. H&E-fargeresultatene er imidlertid variable, avhengig av teknikerens erfaring, noe som gir ytterligere utfordringer for datamaskinbasert diagnose2.
Disse utfordringene kan potensielt løses med etikettfrie optiske bildeteknikker. En slik teknikk er SRS mikroskopi. SRS bruker synkroniserte pulserende lasere – pumpe og Stokes – til å begeistre molekylære vibrasjoner med høy effektivitet3. Nyere rapporter har vist at SRS-avbildning av proteiner og lipider kan generere H&E-tilsvarende bilder (også kjent som stimulert Raman histologi eller SRH) med intakt friskt vev, som omgår behovet for vevsbehandling, forkorter betydelig tiden som trengs for diagnose, og har blitt tilpasset intraoperativt4. Videre kan SRS-avbildning gi 3D-bilder, som gir tilleggsinformasjon for diagnose når 2D-bilder ikke ertilstrekkelige 5. SRH er objektiv og genererer digitale bilder som er lett tilgjengelige for datamaskinbasert diagnose. Det fremstår raskt som en mulig løsning for intraoperativ kreftdiagnose og tumormarginanalyse, spesielt i hjernekreft 6,7,8. Mer nylig har SRS-avbildning av kjemiske endringer i vev også blitt foreslått å gi nyttig diagnostisk informasjon som ytterligere kan hjelpe klinikere med å stratifisere forskjellige krefttyper eller stadier9.
Til tross for sitt enorme potensial i vevsdiagnoseapplikasjoner, er SRS-avbildning for det meste begrenset til akademiske laboratorier spesialisert på optikk på grunn av kompleksiteten knyttet til bildeplattformen, som inkluderer ultraraske lasere, laserskanningsmikroskopet og sofistikert deteksjonselelektronikk. Denne protokollen gir en detaljert arbeidsflyt for å demonstrere bruken av en vanlig femtosecond laserkilde for sanntids, tofarget SRS-avbildning og generering av pseudo-H&E-bilder fra musens hjernevev. Protokollen dekker følgende prosedyrer:
Justering og chirp-optimalisering De fleste SRS-bildebehandlingsordninger bruker enten picosecond- eller femtosecond-lasere som eksitasjonskilde. Med femtosecond lasere er båndbredden til laseren mye større enn Raman linewidth. For å overvinne denne begrensningen, brukes en spektral fokusering tilnærming til å kvitre femtosecond lasere til en picosecond tidsskala for å oppnå smal spektral oppløsning10. Optimal spektral oppløsning oppnås bare når den tidsmessige chirp (også kjent som gruppeforsinkelsesspredning eller bare spredning) er riktig tilpasset pumpen og Stokes-laserne. Justeringsprosedyren og trinnene som trengs for å optimalisere spredningen av laserstrålene ved hjelp av svært dispergerende glassstenger, demonstreres her.
Frekvenskalibrering En fordel med spektralfokuserende SRS er at Raman-eksitasjonen raskt kan justeres ved å endre tidsforsinkelsen mellom pumpen og Stokes-laserne. Slik tuning gir rask bildebehandling og pålitelig spektral oppkjøp sammenlignet med tuning laser bølgelengder. Den lineære sammenhengen mellom eksitasjonsfrekvens og tidsforsinkelse krever imidlertid ekstern kalibrering. Organiske løsningsmidler med kjente Raman-topper brukes til å kalibrere Raman-frekvensen for spektralfokuserende SRS.
Tofarget bildebehandling i sanntid Det er viktig å øke bildehastigheten i vevsdiagnoseapplikasjoner for å forkorte tiden som trengs for å analysere store vevsprøver. Samtidig tofarget SRS-avbildning av lipider og proteiner hindrer behovet for å justere laseren eller tidsforsinkelsen, noe som øker bildehastigheten med mer enn to ganger. Dette oppnås ved å bruke en ny ortogonal modulasjonsteknikk og tokanals demodulering med en innlåsingsforsterker11. Dette dokumentet beskriver protokollen for ortogonal modulasjon og tokanals bildeanskaffelse.
SRS-bildebehandling i epimodus Mesteparten av SRS-avbildningen som vises til dags dato, utføres i overføringsmodus. Epi-modus bildebehandling oppdager backscattered fotoner fra vev12. For patologiapplikasjoner kan kirurgiske prøver være ganske store. For avbildning av overføringsmodus er vevsseksjon ofte nødvendig, noe som uønsket krever ekstra tid. I motsetning til dette kan epimodusavbildning fungere med intakte kirurgiske prøver. Fordi det samme målet brukes til å samle tilbakescattered lys, er det heller ikke behov for å justere en høy numerisk blenderåpning kondensator som kreves for overføringsavbildning. Epi-modus er også det eneste alternativet når vevsseksjon er vanskelig, for eksempel med bein. Tidligere har vi vist at for hjernevev tilbyr epimodusavbildning overlegen bildekvalitet for vevstykkelse > 2 mm13. Denne protokollen bruker en polariserende strålesplitter (PBS) for å samle spredte fotoner depolarisert av vev. Det er mulig å samle flere fotoner med en ringformet detektor på bekostning av kompleksiteten til tilpasset detektormontering12. PBS-tilnærmingen er enklere å implementere (ligner fluorescens), med standard fotodiode som allerede brukes til deteksjon av overføringsmodus.
Pseudo-H&E-bildegenerering Når tofargede SRS-bilder er samlet inn, kan de fargelegges på nytt for å simulere H&E-flekker. Dette dokumentet demonstrerer prosedyren for å konvertere lipid- og protein SRS-bilder til pseudo-H&E SRS-bilder for patologiapplikasjoner. Den eksperimentelle protokollen beskriver kritiske trinn som trengs for å generere SRS-bilder av høy kvalitet. Prosedyren som vises her gjelder ikke bare for vevsdiagnose, men kan også tilpasses for mange andre hyperspektrale SRS-avbildningsapplikasjoner som medikamentavbildning og metabolsk avbildning 14,15.
Generelle systemkrav Lasersystemet for denne protokollen må kunne sende ut 2 synkroniserte femtosecond laserstråler. Systemer har ideelt sett en optisk parametrisk oscillator (OPO) for bred bølgelengdejustering av en av laserstrålene. Oppsettet i denne protokollen bruker et kommersielt lasersystem Insight DS+ som sender ut to lasere (en fast stråle på 1040 nm og en OPO-basert justerbar stråle, fra 680 til 1300 nm) med en repetisjonshastighet på 80 MHz. Laserskanningsmikroskoper, enten fra store mikroskopprodusenter eller hjemmebygde, kan brukes til SRS-avbildning. Det brukte mikroskopet er et oppreist laserskanningsmikroskop bygget på toppen av en kommersiell oppreist mikroskopramme. Et par 5 mm galvospeil brukes til å skanne laserstrålen. For brukere som velger å ta i bruk et hjemmebygd laserskanningsmikroskop, kan du se en tidligere publisert protokoll for bygging av et laserskanningsmikroskop16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-100-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 MHz bandpass filter</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>BBP-21.4+</td>
			<td>Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-200-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Half Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA2210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband half waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Quarter Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA4210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband quarter waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Sampler</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BSN11</td>
			<td>10:90 Plate Beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DMSP1000</td>
			<td>Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrooptic Amplitude Modulator</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>EO-AM-NR-C1</td>
			<td>Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>False H&#38;E Staining Script</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fanout Buffer</td>
			<td>PRL-414B</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Photodiode</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DET10A2</td>
			<td>Si Detector, 1 ns Rise Time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frequency Divider</td>
			<td>PRL-220A</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly Dispersive Glass Rods</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>CYLROD01</td>
			<td>High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight DS+</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Liquid Instruments</td>
			<td>Moku Lab</td>
			<td>Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BB05-E03-10</td>
			<td>Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Delay Stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-DMQ12P-DE52</td>
			<td>Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersion Condensor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CSC1003</td>
			<td>1.4 NA. Other condensers with NA&#62;1.2 can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS7054</td>
			<td>Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Shifter</td>
			<td>SigaTek</td>
			<td>SF50A2</td>
			<td>For shifting the phase of the modulation frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu Corp</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td>Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing Beam Splitter</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>PBS9025-620-1000</td>
			<td>Broadband polarizing beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refactive Index Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>refractiveindex.info</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retro-reflector</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>34-408</td>
			<td>BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF Power Amplifier</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>ZHL-1-2W+</td>
			<td>Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan Mirrors</td>
			<td>Cambridge Technologies</td>
			<td>6215H</td>
			<td>We used a 5mm mirror set with silver coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio</td>
			<td>ScanImage Basic</td>
			<td>Laser scanning microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FESH1000</td>
			<td>25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse FN1</td>
			<td>Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Immersion Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis

Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi har dukket opp som en kraftig optisk bildeteknikk for vevsdiagnose. De siste årene har tofarget SRS vist seg å kunne gi hematoksylin- og eosin (H&E)-ekvivalente bilder som tillater rask og pålitelig diagnose av hjernekreft. Slik evne har muliggjort spennende intraoperative kreftdiagnoseapplikasjoner. Tofarget SRS-avbildning av vev kan gjøres med enten en picosecond eller femtosecond laserkilde. Femtosecond-lasere har fordelen av å muliggjøre fleksible bildemoduser, inkludert rask hyperspektral avbildning og tofarget SRS-bildebehandling i sanntid. En spektralfokuserende tilnærming med chirped laserpulser brukes vanligvis med femtosecond lasere for å oppnå høy spektral oppløsning. 
Tofarget SRS-oppkjøp kan realiseres med ortogonal modulasjon og låsedeteksjon. Kompleksiteten av puls chirping, modulasjon og karakterisering er en flaskehals for den utbredte adopsjonen av denne metoden. Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for å demonstrere implementering og optimalisering av spektralfokuserende SRS og sanntids, tofarget avbildning av musehjernevev i epimodus. Denne protokollen kan brukes til et bredt spekter av SRS-bildebehandlingsprogrammer som utnytter SRS' høyhastighets- og spektroskopiske bildebehandlingsevne.

Optimalisere spektraloppløsning: Dispersjon gjennom et materiale påvirkes av dispergeringsmediet (lengde og materiale) og bølgelengde. Endring av dispersjonsstanglengden påvirker spektraloppløsningen og signalstørrelsen. Det er et gi-og-ta-forhold som kan veies annerledes avhengig av applikasjonen. Stengene strekker ut strålepulsen fra å være bred i frekvens og smal i tide til å være smal i frekvens og bred i tide. Figur 7 viser effekten av varierende stangleng...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi er en kraftig, ikke-ødeleggende og etikettfri bildeteknikk. En fremvoksende applikasjon stimuleres Raman histologi, hvor tofarget SRS-avbildning ved protein- og lipid Raman-overgangene brukes til å generere pseudo-hematoksylin- og eosinbilder. Her demonstrerer vi en protokoll for sanntids, tofarget SRS-avbildning for vevsdiagnose.

Sanntids, tofarget stimulert ramanspredningsavbildning av musehjerne for vevsdiagnose

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Denne protokollen vil demonstrere implementering og optimalisering av spektralfokuserende SRS-mikroskopi og hvordan den kan brukes til sanntids stimulerte Raman histologiapplikasjoner. Den største fordelen med denne teknikken er hastigheten som prøver kan behandles når instrumenteringen er riktig justert, da SRS ikke krever vevsbehandling og farging. Denne protokollen gjelder for andre SRS-applikasjoner, ikke bare begrenset til histologi.Slike applikasjoner inkluderer små molekyler, stoffer, celler og vev. Begynn med å installere et par akromatiske linser for pumpestrålen for å forstørre laserstrålestørrelsen med todelt som utgangspunkt. Plasser en 100 og 200 millimeter linse på omtrent 300 millimeter fra hverandre.Juster deretter pumpestrålen gjennom midten av begge linsene. Deretter plasserer du et speil etter det andre objektivet for å sende strålen mot en vegg mer enn en meter unna. Spor strålen fra speilet til veggen med et IR-kort og sjekk om bjelken endres i størrelse.Kollater strålen hvis strålen endres i størrelse som en funksjon av avstand. Kombiner de to laserstrålene ved å installere et dikroisk speil med flere styrespeil for justering. Optimaliser romlig overlapping av pumpen og Stokes ved å overvåke bjelker etter det dikroiske speilet i to forskjellige posisjoner rundt en meter fra hverandre.Juster styrespeilet etterfulgt av det dikroiske speilet for å justere Stokes-strålen etter pumpestrålen. Forsikre deg om at de kombinerte bjelkene sendes til midten av skannespeilene på laserskanningsmikroskopet ved å justere et par styrespeil når skannespeilene er i parkert posisjon. Etter kondensatoren, bruk et annet par linser med brennvidder på henholdsvis 100 millimeter og 30 millimeter for å videresende den overførte strålen til fotodioden, og sørg for at begge bjelkene er inneholdt i fotodioden.Monter deretter to low pass-filtre for å blokkere den modulerte Stokes-strålen. Plasser en bjelkeprøve i Stokes bjelkesti for å plukke opp 10% av strålen og send den til en rask fotodiode for å oppdage 80 megahertz pulstog. Ta en av utgangene til viftebufferen og filtrer den med et båndpassfilter for å få en 20 megahertz sinusformet bølge.Bruk deretter en RF-demper for å justere utgangstoppen til toppspenning til ca. 500 millivolt. Send den resulterende utgangen til en faseskifter, som tillater finjustering av RF-fasen med en spenningskilde. Send denne utgangen til en RF-effektforsterker og koble forsterkerens utgang til EOM.Etter å ha fjernet blokkeringen av Stokes-strålen, optimaliserer du modulasjonsdybden til den første EOM ved å plassere en fotodiode i strålebanen. Juster EOM-spennings- og kvartbølgeplaten til modulasjonsdybden ser tilfredsstillende ut. Plasser en fotodiode etter det dikroiske speilet for å oppdage laserstrålen.Blokker Stokes-strålen først, og zoom deretter inn på en av pumpepulstoppene på oscilloskopet. Plasser en vertikal markør for å markere den tidsmessige posisjonen til denne toppen med oscilloskopet. Blokker nå pumpestrålen, og fjern blokkeringen av Stokes-strålen.Oversett forsinkelsesfasen slik at den midlertidig samsvarer med toppposisjonene på oscilloskopet med den markerte posisjonen i forrige trinn. Ved å beregne forsinkelsesavstanden som kreves for å matche de to bjelkene etterfulgt av å forlenge strålebanen til den raskere strålen eller forkorte strålebanen til den langsommere strålen. Deretter forbereder du en mikroskoplyseprøve med DMSO og dobbeltsidig tape som avstandsstykke for å holde prøven mellom lysbildet og en deksleslip.Plasser prøven på mikroskopet med dekslene vendt mot mikroskopmålet og følg prøven fra I-stykket under brightfield-belysning. Finn fokuset på prøven både på det øverste og nederste laget av luftbobler ved glassbåndgrensesnittet, og flytt deretter fokuset for å være mellom de to lagene på båndet. Sett deretter den justerbare stråleutgangen til 798 nanometer.Basert på kondensatorens optiske gjennomstrømning justerer du den optiske effekten til ca. 40 milliwatt hver for pumpen og Stokes-bjelkene med objektivt fokus. Åpne deretter skannebildet i MATLAB og klikk på knappen merket fokus for å begynne å skanne. Juster styrespeilet før galvoskanneren for å midtstille DC-signalet på kanalen en skjerm.Beveg det motoriserte forsinkelsesstadiet og følg låseutgangen som vises på kanal to-displayet nøye. Juster til slutt tidsforsinkelsen for å maksimere ac-signalintensiteten. Juster det dikroiske speilet for å midtstille SRS-signalet på vekselstrømskanalen.Juster deretter fasen på låseforsterkeren for å maksimere signalet. Etter montering av prøvesklien på mikroskopet og justering av kraften til begge bjelkene til ca. 40 milliwatt hver ved prøvefokus som vist tidligere. Åpne skannebildet fra MATLAB.Finn deretter det maksimale SRS-signalet ved å skanne gjennom forsinkelsesstadiet som tilsvarer den 2913 inverse centimeter Raman-toppen av DMSO. Skaff deg et SRS-bilde som tilsvarer den omvendte centimeter store Raman-toppen på 2913 DMSO. Åpne bildet i ImageJ, og velg et lite område midt i rammen.Bruk målefunksjonen til å beregne gjennomsnitts- og standardavviket for verdier i det valgte området. For kalibrering av frekvenstilgang lagrer du en hyperspektral skanning med forsinkelsesstadiumområdet som dekker de 2, 913 og 2, 994 inverse centimeter Raman-toppene i DMSO. Lagre deretter sceneposisjonene som tilsvarer hyperspektraldatasettet.Utfør lineær regresjon for sceneposisjonene og Raman-skiftene ved 2, 913 og 2 994 inverse centimeter. Bruk den lineære regresjonsligningen til å konvertere forsinkelsesposisjonene til de tilsvarende Raman-frekvensene. For kalibrering av spektraloppløsning, beregn sceneposisjonen basert på forrige posisjon med den økte optiske banelengden på grunn av innsetting av stenger.Omjuster bjelkene romlig overlapping på grunn av den lille avviket fra bjelken når glassstenger tilsettes. Monter en polariserende bjelkesplitter, en kvart bølgeplate og en annen EOM i soaks strålebanen etter den første EOM. Koble signalinngangen til den andre EOM, koble deretter signalinngangen til den første EOM-en og slå den på.Moduler Stokes-strålen på 20 megahertz ved å sende strålen gjennom den første EOM. Juster hellingen og posisjonen til den første EOM for å sikre at strålen er sentrert gjennom EOM-krystallen. Forbered en vevssklieprøve med dobbeltsidig tape, mikroskopsklie og dekkglass.Plasser prøven på mikroskopet med dekslene vendt mot mikroskopmålet. For epi-modus SRS-avbildning, installer en halvbølgeplate før strålen kommer inn i mikroskopet for å endre polariseringen av strålen som går inn i mikroskopet. Plasser en polariserende bjelkesplitter over målet for å la den depolariserte bakreflekterte strålen nå detektoren.Deretter bruker du en 75 millimeter akromatlinse og en 30 millimeter asfærisk linse for å videresende de bakre spredte fotonene fra bakåpningen av målet til fotodetektoren. Monter detektoren for å samle det bakspredningslyset som ledes av polariserende strålesplitter. Monter deretter et filter for å blokkere den modulerte strålen fra å komme inn i detektoren.Varierende stanglengder påvirker spektraloppløsningen. Når ingen glass chirping stenger brukes, de to Raman topper fra DMSO er ikke løst i det hele tatt. En økning i antall glass chirping stenger begynner å løse de to toppene på et tilfredsstillende punkt.Matchet chirping løser begge toppene og kan brukes til å kalibrere sceneposisjoner til frekvens. To ganger forsinkede pulstog av ortoggonal polarisering som brukes til å avbilde DMSO-spektra, viser tidsforsinkelsen mellom SRS-eksitasjonene med akseptabel modulasjonsdybde og tidsseparasjon. Derimot gir et dårlig tofarget SRS-faseskift, opphav til inverterte eller negative topper.Sanntids tofargers SRS-avbildning ved 2, 850 og 2930 inverse centimeter ex vivo mus hjernevev er vist her. De rå lipid- og proteinbildene var fargekodet for å produsere et enkelt bilde som skildrer lipid- og proteinbidrag. Falsk hematoksylin og eosin recoloring, ble også utført for å etterligne hematoksylin og eosinfarging for patologiske anvendelser.Romlig tidsoverlapping og optimalisering av romlig oppløsning er de viktigste trinnene for den romlige fokuseringsmetoden til SRS. Denne metoden gjelder vanligvis for andre mikroskopieksperimenter for pumpesonder, for eksempel forbigående absorpsjonsmikroskopi. Metoden muliggjør også avbildning av ikke-fluorescerende molekyler i celler og vev.Metoden som presenteres her fremskynder bildeanskaffelsestiden for fremtidig oversettelse av stimulert Raman-histologi i klinikken.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri Overvåking av celler og ekstracellulær matriks med Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Håndholdt Tredimensjonal Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Menneskelig angiografi og Funksjonell prekliniske studier i Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Ved hjelp av Cell-substrat Impedans og Live Cell Imaging å måle sanntid Endringer i Cellular Grep og De-adhesjon indusert av Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Sanntidsovervåking av High Intensity fokusert ultralyd (HIFU) Ablation av<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Livers Bruke Harmonic Motion Imaging for fokusert ultralyd (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Håndholdt klinisk Photoacoustic tenkelig System for sanntid ikke-invasiv liten dyr Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

En protokoll for sanntids 3D enkelt partikkel sporing

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ Mikroskopi for Real-Time bestemmelse av single-celle morfologi i Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In vivo to-Color 2-Foton Imaging av genetisk-Tagged reporter celler i huden

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Intravital multifotonmikroskopi i sanntid for å visualisere fokuserte ultralyd- og mikroboblebehandlinger for å øke blod-hjernebarrierens permeabilitet

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Avbildning av biologisk vev med kombinert to-foton fluorescens og stimulert ramanspredningsmikroskopi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...