Name: real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo NIH R35 GM133435 a D.F.

Todos os procedimentos experimentais de animais foram realizados com cérebros de camundongos fixos e seccionados de 200 μm, de acordo com o protocolo (nº 4395-01) aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Washington. Os camundongos do tipo selvagem (cepa C57BL/6J) são eutanizados com CO2. Em seguida, uma craniotomia é realizada para extrair seus cérebros para fixação em 4% de paraformaldeído em soro fisco tamponado. Os cérebros são embutidos em uma mistura de 3% d...

<ol>
	<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Cui, M., Zhang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+and+computational+pathology.">Artificial intelligence and computational pathology.</a> Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li><li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).</li><li>Ji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+detection+of+brain+tumors+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).</li><li>Hollon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+real-time+intraoperative+brain+tumor+diagnosis+using+stimulated+Raman+histology+and+deep+neural+networks.">Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks.</a> Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+assessment+of+skull+base+tumors+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).</li><li>Lu, F. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+neurosurgical+pathology+with+stimulated+Raman+imaging.">Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging.</a> Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+imaging+of+breast+calcifications+in+association+with+neoplastic+processes.">Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes.</a> Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).</li><li>Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+imaging+with+stimulated+Raman+scattering+by+chirped+femtosecond+lasers.">Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).</li><li>Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microscale+temperature+imaging+by+stimulated+Raman+scattering.">Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).</li><li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering.">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li><li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+intracellular+distribution+of+tyrosine+kinase+inhibitors+in+living+cells+with+quantitative+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering.">Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering.</a> Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism.">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li><li>Tsai, P. S., et al., Frostig, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles,+design,+and+construction+of+a+two-photon+laser-scanning+microscope+for+in+vitro+and+in+vivo+brain+imaging.">Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging.</a> In Vivo Optical Imaging of Brain. , 113-171 (2002).</li><li>Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+pathology+by+spectrally+sliced+femtosecond+stimulated+Raman+scattering+(SRS)+microscopy.">Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy.</a> PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).</li><li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source.">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator.">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li><li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging.">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li><li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li><li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li><li>Wright, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+for+enhanced+signal+in+CARS+microscopy.">Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy.</a> Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).</li></ol>

O esquema de imagem SRS de duas cores apresentado neste protocolo depende da implementação adequada de imagens SRS de uma cor. Em imagens de SRS de uma cor, as etapas críticas são alinhamento espacial, alinhamento temporal, profundidade de modulação e mudança de fase. A combinação espacial dos dois feixes é realizada por um espelhodicróico. Vários espelhos de direção são usados para ajuste fino ao enviar as vigas para o espelho dicroico. Uma vez que os feixes são combinados com o espelho dicroico, o alinh...

Os diagnósticos tradicionais de tecido dependem de protocolos de coloração seguidos de exame sob um microscópio óptico. Um método comum de coloração usado pelos patologistas é a coloração de H&E: manchas de hematoxilina nos núcleos celulares um azul arroxeado, e eosina mancha a matriz extracelular e citoplasma rosa. Essa simples coloração continua sendo o padrão ouro na patologia para muitas tarefas de diagnóstico de tecido, particularmente o diagnóstico de câncer. No entanto, a histopatologia H&E, particularmente a técnica de secção congelada usada em um ambiente intraoperatório, ainda tem limitações. O procedimento de coloração é um processo trabalhoso que envolve incorporação de tecidos, secção, fixação e coloração1. O tempo típico de retorno é de 20 minutos ou mais. O desempenho do H&E durante a seção congelada às vezes pode se tornar mais desafiador quando várias seções são processadas ao mesmo tempo devido à necessidade de avaliar características celulares ou padrões de crescimento em 3D para avaliação de margem. Além disso, técnicas histológicas intraoperatórias exigem técnicos e clínicos qualificados. A limitação no número de patologistas certificados pelo conselho em muitos hospitais é uma restrição para consulta intraoperatória em muitos casos. Tais limitações podem ser aliviadas com os interesses de desenvolvimento rápido na patologia digital e no diagnóstico baseado em inteligência artificial2. No entanto, os resultados de coloração do H&E são variáveis, dependendo da experiência do técnico, que apresenta desafios adicionais para o diagnóstico baseado em computador2.
Esses desafios podem ser potencialmente enfrentados com técnicas de imagem óptica sem rótulos. Uma dessas técnicas é a microscopia SRS. O SRS usa lasers pulsados sincronizados — bomba e Stokes — para excitar vibrações moleculares com alta eficiência3. Relatórios recentes demonstraram que a imagem de proteínas e lipídios da SRS pode gerar imagens equivalentes a H&E (também conhecida como histologia raman estimulada ou SRH) com tecido fresco intacto, o que contorna a necessidade de qualquer processamento de tecido, encurta significativamente o tempo necessário para o diagnóstico, e foi adaptado intraoperatóriamente4. Além disso, a imagem SRS pode fornecer imagens 3D, que oferecem informações adicionais para diagnóstico quando as imagens 2D são insuficientes5. O SRH é imparcial e gera imagens digitais prontamente disponíveis para diagnóstico baseado em computador. Ele surge rapidamente como uma possível solução para o diagnóstico de câncer intraoperatório e análise da margem do tumor, especialmente no câncer cerebral 6,7,8. Mais recentemente, a imagem srs de alterações químicas do tecido também foi sugerida para fornecer informações diagnósticas úteis que podem ajudar ainda mais os médicos a estratificar diferentes tipos de câncer ouestágios 9.
Apesar de seu tremendo potencial em aplicações de diagnóstico de tecidos, a imagem SRS é limitada principalmente a laboratórios acadêmicos especializados em óptica devido à complexidade associada à plataforma de imagem, que inclui lasers ultrarrápidos, microscópio de varredura a laser e sofisticados eletrônicos de detecção. Este protocolo fornece um fluxo de trabalho detalhado para demonstrar o uso de uma fonte de laser femtosegundo comum para imagens srs em tempo real e duas cores e a geração de imagens pseudo-H&E a partir do tecido cerebral do mouse. O protocolo abrangerá os seguintes procedimentos:
Alinhamento e otimização de chirp A maioria dos esquemas de imagem SRS usam picosegundos ou lasers femtosegundos como fonte de excitação. Com lasers femtosegundos, a largura de banda do laser é muito maior que a largura de linha raman. Para superar essa limitação, uma abordagem focalizante espectral é usada para chirp os lasers femtosegundos para uma escala de tempo picosegundo para alcançar a resolução espectral estreita10. A resolução espectral ideal só é alcançada quando o chirp temporal (também conhecido como dispersão de atraso de grupo ou apenas dispersão) é devidamente combinado para a bomba e os lasers stokes. O procedimento de alinhamento e as etapas necessárias para otimizar a dispersão dos raios laser usando hastes de vidro altamente dispersivas são demonstradas aqui.
Calibração de frequência Uma vantagem do srs focalizado espectral é que a excitação de Raman pode ser rapidamente ajustada alterando o atraso de tempo entre a bomba e os lasers Stokes. Tal ajuste oferece imagens rápidas e aquisição espectral confiável em comparação com comprimentos de onda a laser de ajuste. No entanto, a relação linear entre a frequência de excitação e o atraso de tempo requer calibração externa. Solventes orgânicos com picos raman conhecidos são usados para calibrar a frequência raman para srs focalizando espectral.
Imagem em tempo real, de duas cores É importante aumentar a velocidade de imagem nas aplicações de diagnóstico tecidual para encurtar o tempo necessário para analisar grandes amostras de tecido. A imagem simultânea de SRS de duas cores de lipídios e proteínas evita a necessidade de ajustar o laser ou o atraso de tempo, o que aumenta a velocidade de imagem em mais de duas vezes. Isso é conseguido usando uma nova técnica de modulação ortogonal e demodulação de dois canais com um amplificador lock-in11. Este artigo descreve o protocolo de modulação ortogonal e aquisição de imagens de dois canais.
Imagem SRS do modo epi A maioria das imagens SRS mostradas até o momento é realizada no modo de transmissão. A imagem do modo epi detecta fótons recattered do tecido12. Para aplicações patológicas, as amostras cirúrgicas podem ser bastante grandes. Para a imagem do modo de transmissão, a secção tecidual é muitas vezes necessária, o que indesejavelmente requer tempo extra. Em contraste, a imagem do modo epi pode funcionar com amostras cirúrgicas intactas. Como o mesmo objetivo é usado para coletar luz retorcido, também não há necessidade de alinhar um condensador de abertura numérica elevada necessário para a imagem de transmissão. O modo epi também é a única opção quando a seção tecidual é difícil, como com osso. Anteriormente, demonstramos que, para o tecido cerebral, a imagem do modo epi oferece qualidade de imagem superior para a espessura do tecido > 2 mm13. Este protocolo usa um divisor de feixe polarizador (PBS) para coletar fótons dispersos despolarizados pelo tecido. É possível coletar mais fótons com um detector anular em detrimento da complexidade do conjunto de detector personalizado12. A abordagem PBS é mais simples de implementar (semelhante à fluorescência), com o fotodiodo padrão já sendo usado para detecção do modo de transmissão.
Geração de imagens Pseudo-H&E Uma vez coletadas imagens srs de duas cores, elas podem ser recoloridas para simular a coloração de H&E. Este artigo demonstra o procedimento para converter imagens de SRS lipídicos e proteicos em imagens pseudo-H&E SRS para aplicações patológicas. O protocolo experimental detalha as etapas críticas necessárias para gerar imagens srs de alta qualidade. O procedimento aqui mostrado não é apenas aplicável ao diagnóstico tecidual, mas também pode ser adaptado para muitas outras aplicações de imagem hiperespectral srs, como imagem de drogas e imagem metabólica14,15.
Requisitos gerais do sistema O sistema laser para este protocolo deve ser capaz de produzir 2 raios laser femtosegundos sincronizados. Os sistemas possuem idealmente um Oscilador Paramétrico Óptico (OPO) para afinação de comprimento de onda amplo de um dos raios laser. A configuração deste protocolo usa um sistema de laser comercial Insight DS+ que produz dois lasers (um feixe fixo a 1.040 nm e um feixe tunable baseado em OPO, variando de 680 a 1.300 nm) com uma taxa de repetição de 80 MHz. Microscópios de varredura a laser, seja de grandes fabricantes de microscópios ou caseiros, podem ser usados para imagens SRS. O microscópio utilizado é um microscópio de varredura a laser vertical construído em cima de um quadro comercial de microscópio vertical. Um par de espelhos galvo de 5 mm são usados para escanear o raio laser. Para os usuários que optarem por adotar um microscópio de varredura a laser construído em casa, consulte um protocolo publicado anteriormente para a construção de um microscópio de varredura a laser16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-100-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 MHz bandpass filter</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>BBP-21.4+</td>
			<td>Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-200-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Half Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA2210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband half waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Quarter Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA4210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband quarter waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Sampler</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BSN11</td>
			<td>10:90 Plate Beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DMSP1000</td>
			<td>Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrooptic Amplitude Modulator</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>EO-AM-NR-C1</td>
			<td>Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>False H&#38;E Staining Script</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fanout Buffer</td>
			<td>PRL-414B</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Photodiode</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DET10A2</td>
			<td>Si Detector, 1 ns Rise Time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frequency Divider</td>
			<td>PRL-220A</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly Dispersive Glass Rods</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>CYLROD01</td>
			<td>High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight DS+</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Liquid Instruments</td>
			<td>Moku Lab</td>
			<td>Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BB05-E03-10</td>
			<td>Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Delay Stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-DMQ12P-DE52</td>
			<td>Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersion Condensor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CSC1003</td>
			<td>1.4 NA. Other condensers with NA&#62;1.2 can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS7054</td>
			<td>Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Shifter</td>
			<td>SigaTek</td>
			<td>SF50A2</td>
			<td>For shifting the phase of the modulation frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu Corp</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td>Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing Beam Splitter</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>PBS9025-620-1000</td>
			<td>Broadband polarizing beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refactive Index Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>refractiveindex.info</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retro-reflector</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>34-408</td>
			<td>BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF Power Amplifier</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>ZHL-1-2W+</td>
			<td>Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan Mirrors</td>
			<td>Cambridge Technologies</td>
			<td>6215H</td>
			<td>We used a 5mm mirror set with silver coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio</td>
			<td>ScanImage Basic</td>
			<td>Laser scanning microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FESH1000</td>
			<td>25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse FN1</td>
			<td>Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Immersion Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) surgiu como uma poderosa técnica de imagem óptica para diagnóstico de tecidos. Nos últimos anos, o SRS de duas cores mostrou-se capaz de fornecer imagens equivalentes à hematoxilina e eosina (H&E) que permitem um diagnóstico rápido e confiável do câncer cerebral. Tal capacidade permitiu aplicações emocionantes de diagnóstico de câncer intraoperatório. A imagem de tecido srs de duas cores pode ser feita com uma fonte de laser picosegundo ou femtosegundo. Os lasers Femtosegundos têm a vantagem de permitir modos de imagem flexíveis, incluindo imagens hiperespectrais rápidas e imagens srs em tempo real de duas cores. Uma abordagem espectral com pulsos laser chirped é tipicamente usado com lasers femtosegundos para alcançar alta resolução espectral. 
A aquisição de SRS de duas cores pode ser realizada com modulação ortogonal e detecção de lock-in. A complexidade do pulso, modulação e caracterização é um gargalo para a adoção generalizada desse método. Este artigo fornece um protocolo detalhado para demonstrar a implementação e otimização do SRS focado no espectral e imagens em tempo real de duas cores do tecido cerebral do camundongo no modo epi. Este protocolo pode ser usado para uma ampla gama de aplicações de imagem SRS que aproveitam a alta velocidade e capacidade de imagem espectroscópica do SRS.

Otimização da resolução espectral: A dispersão através de um material é afetada pelo meio dispersivo (comprimento e material) e comprimento de onda. A alteração do comprimento da haste de dispersão afeta a resolução espectral e o tamanho do sinal. É uma relação de dar e receber que pode ser ponderada de forma diferente dependendo da aplicação. As hastes esticam o pulso do feixe de ser larga em frequência e estreita no tempo para ser estreita em frequência e larga no tempo. <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica de imagem poderosa, não destrutiva e livre de rótulos. Uma aplicação emergente é a histologia raman estimulada, onde imagens de SRS de duas cores nas transições de proteína e lipídio de Raman são usadas para gerar imagens pseudo-hematoxilina e eosina. Aqui, demonstramos um protocolo para imagens de SRS em tempo real e duas cores para diagnóstico de tecido.

Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Este protocolo demonstrará a implementação e otimização da microscopia srs espectral e como ela pode ser usada para aplicações de histologia Raman estimuladas em tempo real. A principal vantagem desta técnica é a velocidade com que as amostras podem ser processadas uma vez que a instrumentação esteja adequadamente alinhada, já que o SRS não requer processamento e coloração de tecidos. Este protocolo é aplicável a outras aplicações srs, não apenas limitadas à histologia.Tais aplicações incluem pequenas moléculas, drogas, células e tecidos. Comece instalando um par de lentes acráticas para o feixe de bomba para ampliar o tamanho do raio laser em duas vezes como ponto de partida. Coloque uma lente de 100 e 200 milímetros a cerca de 300 milímetros uma da outra.Em seguida, alinhe o feixe da bomba através do centro de ambas as lentes. Em seguida, coloque um espelho após a segunda lente para enviar o feixe em direção a uma parede a mais de um metro de distância. Rastreie o feixe do espelho até a parede com um cartão IR e verifique se o feixe muda de tamanho.Cobrem o feixe se o feixe mudar de tamanho em função da distância. Combine os dois raios laser instalando um espelho dicroico com vários espelhos de direção para ajuste. Otimize a sobreposição espacial da bomba e stokes monitorando feixes após o espelhodicróico em duas posições diferentes em torno de um metro de distância.Ajuste iterativamente o espelho de direção seguido do espelhodicróico para alinhar o feixe de Stokes com o feixe da bomba. Certifique-se de que os feixes combinados sejam enviados para o centro dos espelhos de varredura do microscópio de varredura a laser, ajustando um par de espelhos de direção quando os espelhos de varredura estiverem na posição estacionada. Após o condensador, use outro par de lentes com distâncias focais de 100 milímetros e 30 milímetros, respectivamente, para retransmitir o feixe transmitido para o focdiodo, garantindo que ambos os feixes estejam contidos dentro do fotodiodo.Em seguida, instale dois filtros de passagem baixa para bloquear o feixe de Stokes modulado. Coloque um sampler de feixe no caminho do feixe de Stokes para pegar 10% do feixe e enviá-lo para um fotodiodo rápido para detectar o trem de pulso de 80 mega-hertz. Pegue uma das saídas do buffer de fanout e filtre-o com um filtro de passe de banda para obter uma onda sinusoidal de 20 mega-hertz.Em seguida, use um atenuador rf para ajustar o pico de saída para tensão máxima para aproximadamente 500 milvolts. Envie a saída resultante para um câmbio de fase, o que permite um ajuste fino da fase RF com uma fonte de tensão. Envie esta saída para um amplificador de energia RF e conecte a saída do amplificador ao EOM.Depois de desbloquear o feixe de Stokes, otimize a profundidade de modulação do primeiro EOM colocando um fotodiodo no caminho do feixe. Ajuste a tensão EOM e a placa de onda de trimestre até que a profundidade de modulação pareça satisfatória. Coloque um fotodiodo após o espelhodicróico para detectar o raio laser.Bloqueie o feixe de Stokes primeiro, depois amplie um dos picos de pulso da bomba no osciloscópio. Coloque um cursor vertical para marcar a posição temporal deste pico com o osciloscópio. Agora bloqueie o feixe da bomba e desbloqueie a viga de Stokes.Traduza a etapa de atraso para corresponder temporariamente as posições de pico no osciloscópio à posição marcada na etapa anterior. Calculando a distância de atraso necessária para corresponder às duas vigas seguidas, alongando o caminho do feixe do feixe mais rápido ou encurtando o caminho do feixe do feixe mais lento. Em seguida, prepare uma amostra de slides de microscópio com DMSO e fita dupla face como um espaçador para segurar a amostra entre o slide e um deslizamento de tampa.Coloque a amostra no microscópio com o lado do deslizamento de tampa voltado para o objetivo do microscópio e observe a amostra da peça I sob iluminação de campo brilhante. Encontre o foco da amostra tanto na camada superior quanto inferior das bolhas de ar na interface da fita de vidro e, em seguida, mova o foco para estar entre as duas camadas da fita. Em seguida, defina a saída do feixe tunable para 798 nanômetros.Com base no rendimento óptico do condensador, ajuste a potência óptica para aproximadamente 40 miliwatts cada para a bomba e os feixes de Stokes no foco objetivo. Em seguida, abra a imagem de varredura no MATLAB e clique no botão de foco rotulado para iniciar a digitalização. Ajuste o espelho de direção antes que o scanner de galvo centralize o sinal DC no visor do canal um.Mova o estágio de atraso motorizado e observe de perto a saída de bloqueio mostrada no visor do canal dois. Por fim, ajuste o atraso de tempo para maximizar a intensidade do sinal CA. Ajuste o espelho dicroico para centralizar o sinal SRS no canal CA.Em seguida, ajuste a fase do amplificador de travamento para maximizar o sinal. Depois de montar a amostra deslize para o microscópio e ajustar a potência de ambos os feixes para aproximadamente 40 miliwatts cada um em foco de amostra, como demonstrado anteriormente. Abra a imagem de varredura do MATLAB.Em seguida, encontre o sinal máximo srs através da fase de atraso correspondente ao pico de 2,913 centímetros inversos raman do DMSO. Adquira uma imagem SRS correspondente ao pico de 2,913 centímetros inversos de Raman do DMSO. Abra a imagem no ImageJ e selecione uma pequena área no centro do quadro.Use a função de medida para calcular a média e o desvio padrão dos valores na área selecionada. Para calibração de acesso à frequência, salve uma varredura hiperespectral com a faixa de estágio de atraso cobrindo os picos de 2,913 e 2.994 centímetros inversos de Raman de DMSO. Em seguida, salve as posições de estágio correspondentes ao conjunto de dados hiperespectrais.Realizar regressão linear para as posições de palco e Raman muda em 2,913 e 2.994 centímetros inversos. Usando a equação de regressão linear, converta as posições de atraso nas frequências raman correspondentes. Para calibração da resolução espectral, estime a posição do estágio com base na posição anterior com o aumento do comprimento óptico do caminho devido à inserção de hastes.Realinhar a sobreposição espacial dos feixes devido ao leve desvio do feixe quando as hastes de vidro são adicionadas. Instale um divisor de feixe polarizador, uma placa de onda de quarto e um segundo EOM no caminho do feixe de imersão após o primeiro EOM. Desligue a entrada do sinal para o segundo EOM e, em seguida, conecte a entrada de sinal ao primeiro EOM e ligue-a.Modular o feixe de Stokes em 20 mega-hertz enviando o feixe através do primeiro EOM. Ajuste a inclinação e a posição do primeiro EOM para garantir que o feixe esteja centrado através do cristal EOM. Prepare uma amostra de slides de tecido com fita dupla face, deslizamento de microscópio e vidro de cobertura.Coloque a amostra no microscópio com o lado de deslizamento de cobertura voltado para o objetivo do microscópio. Para imagens SRS do modo epi, instale uma placa de meia onda antes que o feixe entre no microscópio para alterar a polarização do feixe que vai para o microscópio. Coloque um divisor de feixe polarizador acima do objetivo de permitir que o feixe refletido de costas despolarizada chegue ao detector.Em seguida, use uma lente de acromato de 75 milímetros e uma lente asférica de 30 milímetros para retransmitir os fótons espalhados de trás da abertura traseira do objetivo para o detector de fotos. Monte o detector para coletar a luz dispersa traseira dirigida pelo divisor de feixe polarizador. Em seguida, instale um filtro para impedir que o feixe modulado entre no detector.A variação dos comprimentos da haste afeta a resolução espectral. Quando não são usadas hastes de vidro, os dois picos raman da DMSO não são resolvidos. Um aumento no número de hastes de vidro começa a resolver os dois picos em um ponto satisfatório.O chirping combinado resolve ambos os picos e pode ser usado para calibrar posições de estágio para frequência. Dois tempos de trem de pulso atrasado de polarização ortogonal usado para imagem espectros DMSO mostram o atraso de tempo entre as excitações srs com profundidade de modulação aceitável e separação temporal. Em contraste, uma mudança de fase de duas cores pobres, dá origem a picos invertidos ou negativos.Em tempo real, duas imagens de SRS coloridas em 2,850 e 2.930 centímetros inversos de tecido cerebral ex vivo mouse são mostrados aqui. As imagens lipídicas e proteicas cruas foram codificadas por cores para produzir uma única imagem representando contribuições lipídicas e proteicas. Falsa hematoxilina e recoloração de eosina, também foram realizadas para imitar a hematoxilina e a coloração de eosina para aplicações patológicas.A sobreposição temporal espacial e a otimização da resolução espacial são os passos mais importantes para a abordagem espacial focalização do SRS. Este método é geralmente aplicável para outros experimentos de microscopia de sonda de bomba, como microscopia de absorção transitória. O método também permite a imagem de moléculas não fluorescentes em células e tecidos.O método aqui apresentado acelera o tempo de aquisição de imagens para futura tradução da histologia estimulada de Raman na clínica.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Bioengenharia

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal de mão tridimensional Optoacoustic imagem Sonda para Deep Tissue Angiografia Humano e Estudos pré-clínicos funcionais em Tempo Real

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Monitoramento em tempo real de High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Fígados Usando Movimento Harmônico Imaging para ultra-som focalizado (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Hand-Held fotoacústico clínico sistema de imagem para imagens de animais em tempo real não-invasiva pequenas

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Em Situ Microscopia para determinação em tempo real da morfologia unicelular em bioprocessos

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Microscopia Multifotol Intravital em Tempo Real para visualizar tratamentos focados de ultrassom e microbolhas para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Imagem de tecidos biológicos com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão de Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...