Name: real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Este estudio fue apoyado por NIH R35 GM133435 a D.F.

Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo con cerebros de ratón de 200 μm, fijos y seccionados, de acuerdo con el protocolo (# 4395-01) aprobado por el Comité del Instituto de Cuidado y Uso animal (IACUC) de la Universidad de Washington. Los ratones de tipo salvaje (cepa C57BL/6J) son sacrificados con CO2. Luego, se realiza una craneotomía para extraer sus cerebros para la fijación en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato. Los cerebros están incru...

<ol>
	<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Cui, M., Zhang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+and+computational+pathology.">Artificial intelligence and computational pathology.</a> Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li><li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).</li><li>Ji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+detection+of+brain+tumors+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).</li><li>Hollon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+real-time+intraoperative+brain+tumor+diagnosis+using+stimulated+Raman+histology+and+deep+neural+networks.">Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks.</a> Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+assessment+of+skull+base+tumors+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).</li><li>Lu, F. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+neurosurgical+pathology+with+stimulated+Raman+imaging.">Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging.</a> Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+imaging+of+breast+calcifications+in+association+with+neoplastic+processes.">Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes.</a> Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).</li><li>Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+imaging+with+stimulated+Raman+scattering+by+chirped+femtosecond+lasers.">Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).</li><li>Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microscale+temperature+imaging+by+stimulated+Raman+scattering.">Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).</li><li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering.">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li><li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+intracellular+distribution+of+tyrosine+kinase+inhibitors+in+living+cells+with+quantitative+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering.">Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering.</a> Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism.">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li><li>Tsai, P. S., et al., Frostig, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles,+design,+and+construction+of+a+two-photon+laser-scanning+microscope+for+in+vitro+and+in+vivo+brain+imaging.">Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging.</a> In Vivo Optical Imaging of Brain. , 113-171 (2002).</li><li>Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+pathology+by+spectrally+sliced+femtosecond+stimulated+Raman+scattering+(SRS)+microscopy.">Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy.</a> PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).</li><li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source.">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator.">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li><li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging.">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li><li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li><li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li><li>Wright, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+for+enhanced+signal+in+CARS+microscopy.">Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy.</a> Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).</li></ol>

El esquema de imágenes SRS de dos colores presentado en este protocolo depende de la implementación adecuada de imágenes SRS de un solo color. En las imágenes SRS de un solo color, los pasos críticos son la alineación espacial, la alineación temporal, la profundidad de modulación y el cambio de fase. La combinación espacial de los dos haces se logra mediante un espejo dicroico. Se utilizan varios espejos de dirección para un ajuste fino al enviar las vigas al espejo dicroico. Una vez que los haces se combinan c...

El diagnóstico tisular tradicional se basa en protocolos de tinción seguidos de un examen bajo un microscopio óptico. Un método de tinción común utilizado por los patólogos es la tinción H&E: la hematoxilina tiñe los núcleos celulares de un azul violáceo, y la eosina tiñe la matriz extracelular y el citoplasma de rosa. Esta simple tinción sigue siendo el estándar de oro en patología para muchas tareas de diagnóstico de tejidos, particularmente el diagnóstico de cáncer. Sin embargo, la histopatología de H&E, particularmente la técnica de seccionamiento congelado utilizada en un entorno intraoperatorio, todavía tiene limitaciones. El procedimiento de tinción es un proceso laborioso que implica incrustación, seccionamiento, fijación y tinciónde tejidos 1. El tiempo de respuesta típico es de 20 minutos o más. Realizar H&E durante la sección congelada a veces puede ser más difícil cuando se procesan varias secciones a la vez debido a la necesidad de evaluar las características celulares o los patrones de crecimiento en 3D para la evaluación de márgenes. Además, las técnicas histológicas intraoperatorias requieren técnicos y clínicos calificados. La limitación en el número de patólogos certificados por la junta en muchos hospitales es una limitación para la consulta intraoperatoria en muchos casos. Tales limitaciones pueden aliviarse con los intereses de rápido desarrollo en patología digital y diagnóstico basado en inteligencia artificial2. Sin embargo, los resultados de tinción de H&E son variables, dependiendo de la experiencia del técnico, lo que presenta desafíos adicionales para el diagnóstico por computadora2.
Estos desafíos pueden abordarse potencialmente con técnicas de imágenes ópticas sin etiquetas. Una de esas técnicas es la microscopía SRS. SRS utiliza láseres pulsados sincronizados (bomba y Stokes) para excitar vibraciones moleculares con alta eficiencia3. Informes recientes han demostrado que las imágenes SRS de proteínas y lípidos pueden generar imágenes equivalentes a H&E (también conocidas como histología Raman estimulada o SRH) con tejido fresco intacto, lo que evita la necesidad de cualquier procesamiento tisular, acorta significativamente el tiempo necesario para el diagnóstico y se ha adaptado intraoperatoriamente4. Además, las imágenes SRS pueden proporcionar imágenes 3D, lo que ofrece información adicional para el diagnóstico cuando las imágenes 2D son insuficientes5. La SSR es imparcial y genera imágenes digitales que están fácilmente disponibles para el diagnóstico basado en computadora. Surge rápidamente como una posible solución para el diagnóstico intraoperatorio del cáncer y el análisis del margen tumoral, especialmente en el cáncer cerebral 6,7,8. Más recientemente, también se ha sugerido que las imágenes SRS de los cambios químicos del tejido proporcionan información diagnóstica útil que puede ayudar aún más a los médicos a estratificar diferentes tipos de cáncer o etapas9.
A pesar de su tremendo potencial en aplicaciones de diagnóstico de tejidos, las imágenes SRS se limitan principalmente a laboratorios académicos especializados en óptica debido a la complejidad asociada con la plataforma de imágenes, que incluye láseres ultrarrápidos, el microscopio de escaneo láser y la sofisticada electrónica de detección. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo detallado para demostrar el uso de una fuente láser de femtosegundo común para imágenes SRS de dos colores en tiempo real y la generación de imágenes pseudo-H&E a partir de tejido cerebral de ratón. El protocolo abarcará los siguientes procedimientos:
Optimización de alineación y chirrido La mayoría de los esquemas de imágenes SRS utilizan láseres de picosegundos o femtosegundos como fuente de excitación. Con los láseres de femtosegundo, el ancho de banda del láser es mucho mayor que el ancho de línea Raman. Para superar esta limitación, se utiliza un enfoque de enfoque espectral para chirriar los láseres de femtosegundo a una escala de tiempo de picosegundos para lograr una resolución espectral estrecha10. La resolución espectral óptima solo se logra cuando el chirrido temporal (también conocido como dispersión de retardo de grupo o simplemente dispersión) se combina adecuadamente para la bomba y los láseres Stokes. El procedimiento de alineación y los pasos necesarios para optimizar la dispersión de los rayos láser utilizando varillas de vidrio altamente dispersivas se muestran aquí.
Calibración de frecuencia Una ventaja del SRS de enfoque espectral es que la excitación Raman se puede ajustar rápidamente cambiando el retardo de tiempo entre la bomba y los láseres Stokes. Dicha sintonización ofrece imágenes rápidas y una adquisición espectral confiable en comparación con la sintonización de longitudes de onda láser. Sin embargo, la relación lineal entre la frecuencia de excitación y el retardo de tiempo requiere calibración externa. Los disolventes orgánicos con picos Raman conocidos se utilizan para calibrar la frecuencia Raman para el ENFOQUE espectral SRS.
Imágenes en tiempo real a dos colores Es importante aumentar la velocidad de las imágenes en las aplicaciones de diagnóstico de tejidos para acortar el tiempo necesario para analizar muestras de tejido grande. Las imágenes simultáneas de SRS de dos colores de lípidos y proteínas evitan la necesidad de ajustar el láser o el retraso de tiempo, lo que aumenta la velocidad de imagen en más del doble. Esto se logra mediante el uso de una novedosa técnica de modulación ortogonal y demodulación de doble canal con un amplificador de bloqueo11. Este artículo describe el protocolo para la modulación ortogonal y la adquisición de imágenes de doble canal.
Imágenes SRS en modo Epi La mayoría de las imágenes SRS mostradas hasta la fecha se realizan en modo de transmisión. Las imágenes en modo epi detectan fotones retrodispersados del tejido12. Para aplicaciones de patología, las muestras quirúrgicas pueden ser bastante grandes. Para las imágenes en modo de transmisión, a menudo es necesario seccionar el tejido, lo que indeseablemente requiere tiempo adicional. Por el contrario, las imágenes en modo epi pueden funcionar con muestras quirúrgicas intactas. Debido a que el mismo objetivo se utiliza para recoger la luz retrodispersada, tampoco hay necesidad de alinear un condensador de alta apertura numérica requerido para la transmisión de imágenes. El modo Epi también es la única opción cuando la sección de tejido es difícil, como con el hueso. Anteriormente hemos demostrado que para el tejido cerebral, las imágenes en modo epi ofrecen una calidad de imagen superior para el grosor del tejido > 2 mm13. Este protocolo utiliza un divisor de haz polarizador (PBS) para recolectar fotones dispersos despolarizados por el tejido. Es posible recolectar más fotones con un detector anular a expensas de la complejidad del conjunto de detectorespersonalizados 12. El enfoque PBS es más simple de implementar (similar a la fluorescencia), con el fotodiodo estándar que ya se utiliza para la detección del modo de transmisión.
Generación de imágenes Pseudo-H&E Una vez que se recopilan las imágenes SRS de dos colores, se pueden volver a colorear para simular la tinción de H&E. Este artículo demuestra el procedimiento para convertir imágenes SRS de lípidos y proteínas en imágenes SRS pseudo-H&E para aplicaciones de patología. El protocolo experimental detalla los pasos críticos necesarios para generar imágenes SRS de alta calidad. El procedimiento que se muestra aquí no solo es aplicable al diagnóstico de tejidos, sino que también se puede adaptar para muchas otras aplicaciones de imágenes srS hiperespectrales, como imágenes de medicamentos e imágenes metabólicas14,15.
Requisitos generales del sistema El sistema láser para este protocolo debe ser capaz de emitir 2 rayos láser de femtosegundo sincronizados. Los sistemas cuentan idealmente con un oscilador óptico paramétrico (OPO) para el ajuste de longitud de onda amplia de uno de los rayos láser. La configuración de este protocolo utiliza un sistema láser comercial Insight DS+ que emite dos láseres (un haz fijo a 1.040 nm y un haz sintonizable basado en OPO, que van desde 680 a 1.300 nm) con una tasa de repetición de 80 MHz. Los microscopios de barrido láser, ya sea de los principales fabricantes de microscopios o de fabricación casera, se pueden utilizar para imágenes SRS. El microscopio utilizado es un microscopio de barrido láser vertical construido sobre un marco de microscopio vertical comercial. Se utilizan un par de espejos galvo de 5 mm para escanear el rayo láser. Para los usuarios que elijan adoptar un microscopio de escaneo láser casero, consulte un protocolo publicado previamente para la construcción de un microscopio de escaneo láser16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-100-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 MHz bandpass filter</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>BBP-21.4+</td>
			<td>Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-200-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Half Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA2210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband half waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Quarter Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA4210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband quarter waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Sampler</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BSN11</td>
			<td>10:90 Plate Beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DMSP1000</td>
			<td>Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrooptic Amplitude Modulator</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>EO-AM-NR-C1</td>
			<td>Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>False H&#38;E Staining Script</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fanout Buffer</td>
			<td>PRL-414B</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Photodiode</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DET10A2</td>
			<td>Si Detector, 1 ns Rise Time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frequency Divider</td>
			<td>PRL-220A</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly Dispersive Glass Rods</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>CYLROD01</td>
			<td>High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight DS+</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Liquid Instruments</td>
			<td>Moku Lab</td>
			<td>Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BB05-E03-10</td>
			<td>Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Delay Stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-DMQ12P-DE52</td>
			<td>Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersion Condensor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CSC1003</td>
			<td>1.4 NA. Other condensers with NA&#62;1.2 can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS7054</td>
			<td>Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Shifter</td>
			<td>SigaTek</td>
			<td>SF50A2</td>
			<td>For shifting the phase of the modulation frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu Corp</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td>Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing Beam Splitter</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>PBS9025-620-1000</td>
			<td>Broadband polarizing beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refactive Index Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>refractiveindex.info</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retro-reflector</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>34-408</td>
			<td>BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF Power Amplifier</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>ZHL-1-2W+</td>
			<td>Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan Mirrors</td>
			<td>Cambridge Technologies</td>
			<td>6215H</td>
			<td>We used a 5mm mirror set with silver coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio</td>
			<td>ScanImage Basic</td>
			<td>Laser scanning microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FESH1000</td>
			<td>25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse FN1</td>
			<td>Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Immersion Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) se ha convertido en una poderosa técnica de imagen óptica para el diagnóstico de tejidos. En los últimos años, se ha demostrado que el SRS de dos colores puede proporcionar imágenes equivalentes a hematoxilina y eosina (H&E) que permiten un diagnóstico rápido y confiable del cáncer cerebral. Tal capacidad ha permitido emocionantes aplicaciones de diagnóstico de cáncer intraoperatorio. Las imágenes SRS de dos colores del tejido se pueden realizar con una fuente láser de picosegundos o femtosegundos. Los láseres de femtosegundo tienen la ventaja de permitir modos de imagen flexibles, incluidas imágenes hiperespectrales rápidas e imágenes SRS de dos colores en tiempo real. Un enfoque de enfoque espectral con pulsos láser chirriados se usa típicamente con láseres de femtosegundo para lograr una alta resolución espectral. 
La adquisición de SRS de dos colores se puede realizar con modulación ortogonal y detección de bloqueo. La complejidad del canto de pulso, la modulación y la caracterización es un cuello de botella para la adopción generalizada de este método. Este artículo proporciona un protocolo detallado para demostrar la implementación y optimización de SRS de enfoque espectral e imágenes en tiempo real de dos colores del tejido cerebral de ratón en el modo epi. Este protocolo se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones de imágenes SRS que aprovechan la alta velocidad y la capacidad de imágenes espectroscópicas de SRS.

Optimización de la resolución espectral: La dispersión a través de un material se ve afectada por el medio dispersivo (longitud y material) y la longitud de onda. Cambiar la longitud de la varilla de dispersión afecta la resolución espectral y el tamaño de la señal. Es una relación de toma y daca que se puede sopesar de manera diferente dependiendo de la aplicación. Las varillas estiran el pulso del haz de ser ancho en frecuencia y estrecho en el tiempo a ser estrecho en frecuencia y ancho e...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una técnica de imagen potente, no destructiva y sin etiquetas. Una aplicación emergente es la histología Raman estimulada, donde las imágenes SRS de dos colores en las transiciones Raman de proteínas y lípidos se utilizan para generar imágenes de pseudo-hematoxilina y eosina. Aquí, demostramos un protocolo para imágenes SRS de dos colores en tiempo real para el diagnóstico de tejidos.

Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Este protocolo demostrará la implementación y optimización de la microscopía SRS de enfoque espectral y cómo se puede utilizar para aplicaciones de histología Raman estimulada en tiempo real. La principal ventaja de esta técnica es la velocidad a la que se pueden procesar las muestras una vez que la instrumentación está correctamente alineada, ya que SRS no requiere procesamiento y tinción de tejidos. Este protocolo es aplicable a otras aplicaciones de SRS, no solo a la histología.Tales aplicaciones incluyen moléculas pequeñas, medicamentos, células y tejidos. Comience instalando un par de lentes acromáticas para el haz de la bomba para aumentar el tamaño del rayo láser por dos veces como punto de partida. Coloque una lente de 100 y 200 milímetros a aproximadamente 300 milímetros entre sí.A continuación, alinee el haz de la bomba a través del centro de ambas lentes. A continuación, coloque un espejo después de la segunda lente para enviar el haz hacia una pared a más de un metro de distancia. Traza el haz desde el espejo hasta la pared con una tarjeta IR y comprueba si el haz cambia de tamaño.Colimar el haz si el haz cambia de tamaño en función de la distancia. Combine los dos rayos láser instalando un espejo dicroico con varios espejos de dirección para su ajuste. Optimice la superposición espacial de la bomba y Stokes mediante la monitorización de haces después del espejo dicroico en dos posiciones diferentes a un metro de distancia.Ajuste iterativamente el espejo de dirección seguido del espejo dicroico para alinear el haz stokes con el haz de la bomba. Asegúrese de que los haces combinados se envíen al centro de los espejos de escaneo del microscopio de escaneo láser ajustando un par de espejos de dirección cuando los espejos de escaneo estén en la posición estacionada. Después del condensador, use otro par de lentes con distancias focales de 100 milímetros y 30 milímetros, respectivamente, para retransmitir el haz transmitido al fotodiodo, asegurando que ambos haces estén contenidos dentro del fotodiodo.A continuación, instale dos filtros de paso bajo para bloquear el haz stokes modulado. Coloque un muestreador de haz en la trayectoria del haz stokes para recoger el 10% del haz y enviarlo a un fotodiodo rápido para detectar el tren de pulsos de 80 megahercios. Tome una de las salidas del búfer de fanout y filtre con un filtro de paso de banda para obtener una onda sinusoidal de 20 megahercios.Luego use un atenuador de RF para ajustar el pico de salida al voltaje máximo a aproximadamente 500 milivoltios. Envíe la salida resultante a una palanca de cambios de fase, que permite un ajuste fino de la fase de RF con una fuente de voltaje. Envíe esta salida a un amplificador de potencia de RF y conecte la salida del amplificador a la MOE.Después de desbloquear el haz de Stokes, optimice la profundidad de modulación de la primera MOE colocando un fotodiodo en la trayectoria del haz. Ajuste el voltaje EOM y la placa de cuarto de onda hasta que la profundidad de modulación parezca satisfactoria. Coloque un fotodiodo después del espejo dicroico para detectar el rayo láser.Bloquee primero el haz de Stokes, luego amplíe uno de los picos de pulso de la bomba en el osciloscopio. Coloque un cursor vertical para marcar la posición temporal de este pico con el osciloscopio. Ahora bloquee el haz de la bomba y desbloquee el haz de Stokes.Traduzca la etapa de retardo para que coincida temporalmente con las posiciones máximas del osciloscopio con la posición marcada en el paso anterior. Calculando la distancia de retardo requerida para que coincida con los dos haces seguido de alargar la trayectoria del haz del haz más rápido o acortar la trayectoria del haz del haz más lento. A continuación, prepare una muestra de diapositiva de microscopio con DMSO y cinta adhesiva de doble cara como espaciador para mantener la muestra entre la diapositiva y una cubierta.Coloque la muestra en el microscopio con el lado de la lata hacia el objetivo del microscopio y observe la muestra de la pieza I bajo iluminación de campo brillante. Busque el foco de la muestra en la capa superior e inferior de burbujas de aire en la interfaz de la cinta de vidrio, luego mueva el foco para que esté entre las dos capas de la cinta. A continuación, ajuste la salida del haz sintonizable a 798 nanómetros.En función del rendimiento óptico del condensador, ajuste la potencia óptica para que sea de aproximadamente 40 milivatios cada uno para la bomba y los haces stokes en el foco objetivo. A continuación, abra escanear imagen en MATLAB y haga clic en el botón etiquetado enfoque para comenzar a escanear. Ajuste el espejo de dirección antes del escáner galvo para centrar la señal de CC en la pantalla del canal uno.Mueva la etapa de retardo motorizado y observe de cerca la salida de bloqueo que se muestra en la pantalla del canal dos. Finalmente, ajuste el retardo de tiempo para maximizar la intensidad de la señal de CA. Ajuste el espejo dicroico para centrar la señal SRS en el canal de CA.A continuación, ajuste la fase del amplificador de bloqueo para maximizar la señal. Después de montar la muestra, portaobjetos en el microscopio y ajustando la potencia de ambos haces a aproximadamente 40 milivatios cada uno en el foco de la muestra, como se demostró anteriormente. Abra la imagen de escaneo desde MATLAB.Luego encuentre la señal SRS máxima escaneando a través de la etapa de retardo correspondiente al pico Raman de 2, 913 centímetros inversos de DMSO. Adquiera una imagen SRS correspondiente al pico Raman de 2, 913 centímetros inversos de DMSO. Abra la imagen en ImageJ y seleccione un área pequeña en el centro del marco.Utilice la función de medida para calcular la media y la desviación estándar de los valores en el área seleccionada. Para la calibración de acceso de frecuencia, guarde una exploración hiperespectral con el rango de etapa de retardo que cubre los picos Raman de 2, 913 y 2, 994 centímetros inversos de DMSO. A continuación, guarde las posiciones de escenario correspondientes al conjunto de datos hiperespectrales.Realice regresión lineal para las posiciones de etapa y cambios Raman a 2, 913 y 2, 994 centímetros inversos. Usando la ecuación de regresión lineal, convierta las posiciones de retardo a las frecuencias Raman correspondientes. Para la calibración de la resolución espectral, estime la posición de la etapa en función de la posición anterior con el aumento de la longitud de la trayectoria óptica debido a la inserción de varillas.Realinear la superposición espacial de las vigas debido a la ligera desviación de la viga cuando se agregan varillas de vidrio. Instale un divisor de haz polarizador, una placa de cuarto de onda y una segunda MOE en la trayectoria del haz de remojo después de la primera MOE. Desenchufe la entrada de señal a la segunda MOE, luego conecte la entrada de señal a la primera MOE y enciéndala.Modula el haz de Stokes a 20 megahercios enviando el haz a través de la primera MOE. Ajuste la inclinación y la posición de la primera MOE para asegurarse de que el haz esté centrado a través del cristal de la MOE. Prepare una muestra de portaobjetos de tejido con cinta adhesiva de doble cara, portaobjetos de microscopio y vidrio de cubierta.Coloque la muestra en el microscopio con el lado de la cubierta hacia el objetivo del microscopio. Para las imágenes SRS en modo epi, instale una placa de media onda antes de que el haz entre en el microscopio para cambiar la polarización del haz que entra en el microscopio. Coloque un divisor de haz polarizador sobre el objetivo para permitir que el haz reflejado trasero despolarizado llegue al detector.A continuación, use una lente de acromato de 75 milímetros y una lente asférica de 30 milímetros para transmitir los fotones dispersos posteriores desde la apertura posterior del objetivo al fotodetector. Monte el detector para recoger la luz dispersa trasera dirigida por el divisor de haz polarizador. A continuación, instale un filtro para impedir que el haz modulado entre en el detector.Variar las longitudes de las varillas afecta la resolución espectral. Cuando no se utilizan varillas de chirrido de vidrio, los dos picos Raman de DMSO no se resuelven en absoluto. Un aumento en el número de varillas de canto de vidrio comienza a resolver los dos picos en un punto satisfactorio.El canto emparejado resuelve ambos picos y se puede usar para calibrar las posiciones del escenario a la frecuencia. Dos trenes de pulsos retardados en el tiempo de polarización ortogonal utilizados para obtener imágenes de espectros DMSO muestran el retraso de tiempo entre las excitaciones SRS con profundidad de modulación aceptable y separación temporal. En contraste, un mal cambio de fase SRS de dos colores, da lugar a picos invertidos o negativos.Aquí se muestran imágenes SRS de dos colores en tiempo real a 2, 850 y 2, 930 centímetros inversos de tejido cerebral de ratón ex vivo. Las imágenes de lípidos y proteínas en bruto se codificaron por colores para producir una sola imagen que representara las contribuciones de lípidos y proteínas. También se realizaron falsos recoloreos de hematoxilina y eosina para imitar la tinción de hematoxilina y eosina para aplicaciones patológicas.La superposición espacio-temporal y la optimización de la resolución espacial son los pasos más importantes para el enfoque de enfoque espacial de SRS. Este método es generalmente aplicable para otros experimentos de microscopía de sonda de bomba, como la microscopía de absorción transitoria. El método también permite obtener imágenes de moléculas no fluorescentes en células y tejidos.El método presentado aquí acelera el tiempo de adquisición de imágenes para la futura traducción de la histología Raman estimulada en la clínica.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Investigación

Bioingeniería

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal de mano-tridimensional optoacústica Imaging Sonda de Tejido Profundo Angiografía Humano y Estudios preclínicos funcionales en Tiempo Real

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Monitoreo en tiempo real de Ultrasonido de alta intensidad (HIFU) Ablación de<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine hígados Uso Movimiento armónico Imaging para Ultrasonido Focalizado (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Fotoacústica clínica mano sistema de imagen por imagen no invasiva en tiempo real de Animal pequeño

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopía para la determinación en tiempo real de la morfología de una sola célula en bioprocesos

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Microscopía multifotónica intravital en tiempo real para visualizar ultrasonido enfocado y tratamientos de microburbujas para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...