Name: real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Denna studie stöddes av NIH R35 GM133435 till D.F.

Alla försöksdjursförsök utfördes med 200 μm, fasta, sektionerade mushjärlor, i enlighet med protokollet (# 4395-01) godkänt av Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Washington. Vilda möss (C57BL /6J-stammen) avlivas med CO2. Därefter utförs en kraniotomi för att extrahera sina hjärnor för fixering i 4% paraformaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning. Hjärnorna är inbäddade i en 3% agaros och 0,3% gelatinblandning och delas upp i 200 μm tjocka skivor av en vibratom....

<ol>
	<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Cui, M., Zhang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+and+computational+pathology.">Artificial intelligence and computational pathology.</a> Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li><li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).</li><li>Ji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+detection+of+brain+tumors+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).</li><li>Hollon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+real-time+intraoperative+brain+tumor+diagnosis+using+stimulated+Raman+histology+and+deep+neural+networks.">Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks.</a> Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+assessment+of+skull+base+tumors+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).</li><li>Lu, F. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+neurosurgical+pathology+with+stimulated+Raman+imaging.">Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging.</a> Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).</li><li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+imaging+of+breast+calcifications+in+association+with+neoplastic+processes.">Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes.</a> Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).</li><li>Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+imaging+with+stimulated+Raman+scattering+by+chirped+femtosecond+lasers.">Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).</li><li>Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microscale+temperature+imaging+by+stimulated+Raman+scattering.">Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).</li><li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering.">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li><li>Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li><li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+intracellular+distribution+of+tyrosine+kinase+inhibitors+in+living+cells+with+quantitative+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering.">Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering.</a> Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism.">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li><li>Tsai, P. S., et al., Frostig, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles,+design,+and+construction+of+a+two-photon+laser-scanning+microscope+for+in+vitro+and+in+vivo+brain+imaging.">Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging.</a> In Vivo Optical Imaging of Brain. , 113-171 (2002).</li><li>Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+pathology+by+spectrally+sliced+femtosecond+stimulated+Raman+scattering+(SRS)+microscopy.">Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy.</a> PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).</li><li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source.">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator.">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li><li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging.">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li><li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li><li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li><li>Wright, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+for+enhanced+signal+in+CARS+microscopy.">Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy.</a> Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).</li></ol>

Det tvåfärgade SRS-avbildningsschemat som presenteras i detta protokoll hänger på korrekt implementering av enfärgad SRS-avbildning. I enfärgad SRS-avbildning är de kritiska stegen rumslig inriktning, tidsmässig inriktning, moduleringsdjup och fasförskjutning. Rumslig kombination av de två strålarna åstadkoms av en dikroisk spegel. Flera styrspeglar används för finjustering när balkarna skickas till dikrospegeln. När balkarna har kombinerats med den dikroiska spegeln kan rumslig inriktning bekräftas geno...

Traditionell vävnadsdiagnostik bygger på färgningsprotokoll följt av undersökning under ett optiskt mikroskop. En vanlig färgningsmetod som används av patologer är H & E-färgning: hematoxylin fläckar cellkärnor en purpurblå och eosin fläckar den extracellulära matrisen och cytoplasman rosa. Denna enkla färgning förblir guldstandarden inom patologi för många vävnadsdiagnosuppgifter, särskilt cancerdiagnos. H&E-histopatologi, särskilt den frysta sektioneringstekniken som används i en intraoperativ miljö, har dock fortfarande begränsningar. Färgningsförfarandet är en mödosam process som involverar vävnadsinbäddning, sektionering, fixering och färgning1. Den typiska handläggningstiden är 20 minuter eller längre. Att utföra H&E under fryst sektionering kan ibland bli mer utmanande när flera sektioner bearbetas samtidigt på grund av behovet av att utvärdera cellulära funktioner eller tillväxtmönster i 3D för marginalbedömning. Dessutom kräver intraoperativa histologiska tekniker skickliga tekniker och kliniker. Begränsning av antalet styrelsecertifierade patologer på många sjukhus är i många fall en begränsning för intraoperativ konsultation. Sådana begränsningar kan lindras med de snabba utvecklingsintressena för digital patologi och artificiell intelligensbaserad diagnos2. H&E-färgningsresultaten varierar dock beroende på teknikerns erfarenhet, vilket innebär ytterligare utmaningar för datorbaserad diagnos2.
Dessa utmaningar kan potentiellt hanteras med etikettfria optiska bildtekniker. En sådan teknik är SRS-mikroskopi. SRS använder synkroniserade pulserade lasrar - pump och Stokes - för att excitera molekylära vibrationer med hög effektivitet3. Nya rapporter har visat att SRS-avbildning av proteiner och lipider kan generera H&E-ekvivalenta bilder (även känd som stimulerad Raman-histologi eller SRH) med intakt färsk vävnad, vilket kringgår behovet av vävnadsbehandling, förkortar avsevärt den tid som behövs för diagnos och har anpassats intraoperativt4. Dessutom kan SRS-avbildning ge 3D-bilder, vilket ger ytterligare information för diagnos när 2D-bilder är otillräckliga5. SRH är opartisk och genererar digitala bilder som är lättillgängliga för datorbaserad diagnos. Det framträder snabbt som en möjlig lösning för intraoperativ cancerdiagnos och tumörmarginalanalys, särskilt vid hjärncancer 6,7,8. På senare tid har SRS-avbildning av kemiska förändringar i vävnad också föreslagits för att ge användbar diagnostisk information som ytterligare kan hjälpa kliniker att stratifiera olika cancertyper eller steg9.
Trots sin enorma potential i vävnadsdiagnosapplikationer är SRS-avbildning mestadels begränsad till akademiska laboratorier specialiserade på optik på grund av komplexiteten i samband med bildplattformen, som inkluderar ultrasnabba lasrar, laserskanningsmikroskopet och sofistikerad detektionselektronik. Detta protokoll ger ett detaljerat arbetsflöde för att demonstrera användningen av en gemensam femtosekundlaserkälla för realtid, tvåfärgad SRS-avbildning och generering av pseudo-H & E-bilder från mushjärnvävnad. Protokollet kommer att omfatta följande förfaranden:
Justering och chirp optimering De flesta SRS-bildscheman använder antingen pikosekund- eller femtosekundlasrar som excitationskälla. Med femtosekundlasrar är laserns bandbredd mycket större än Raman-linjebredden. För att övervinna denna begränsning används en spektral fokuseringsmetod för att kvittra femtosekundlasrarna till en pikosekunds tidsskala för att uppnå smal spektral upplösning10. Optimal spektral upplösning uppnås endast när den temporala chirp (även känd som gruppfördröjningsdispersionen eller bara dispersionen) är korrekt matchad för pumpen och Stokes-lasrarna. Justeringsförfarandet och de steg som behövs för att optimera spridningen av laserstrålarna med hjälp av högdispersiva glasstavar demonstreras här.
Frekvenskalibrering En fördel med spektralfokusering SRS är att Raman-excitationen snabbt kan ställas in genom att ändra tidsfördröjningen mellan pumpen och Stokes-lasrarna. Sådan inställning ger snabb avbildning och tillförlitligt spektralförvärv jämfört med att ställa in laservåglängder. Det linjära förhållandet mellan excitationsfrekvens och tidsfördröjning kräver emellertid extern kalibrering. Organiska lösningsmedel med kända Raman-toppar används för att kalibrera Raman-frekvensen för spektralfokusering SRS.
Tvåfärgsavbildning i realtid Det är viktigt att öka bildhastigheten i vävnadsdiagnosapplikationer för att förkorta den tid som behövs för att analysera stora vävnadsprover. Samtidig tvåfärgad SRS-avbildning av lipider och proteiner eliminerar behovet av att ställa in lasern eller tidsfördröjningen, vilket ökar bildhastigheten med mer än två gånger. Detta uppnås genom att använda en ny ortogonal moduleringsteknik och dubbelkanalig demodulering med en inlåsningsförstärkare11. Detta dokument beskriver protokollet för ortogonal modulering och tvåkanalig bildförvärv.
Epi-mode SRS-avbildning Majoriteten av SRS-avbildning som hittills visats utförs i överföringsläge. Epi-mode-avbildning detekterar bakåtstänkta fotoner från vävnad12. För patologiska applikationer kan kirurgiska prover vara ganska stora. För avbildning av överföringsläge är vävnadssektion ofta nödvändig, vilket oönskat kräver extra tid. Däremot kan epi-mode-avbildning fungera med intakta kirurgiska prover. Eftersom samma mål används för att samla in bakåtstiterat ljus finns det inte heller något behov av att justera en kondensor med hög numerisk bländare som krävs för överföringsavbildning. Epi-mode är också det enda alternativet när vävnadssektion är svårt, till exempel med ben. Tidigare har vi visat att för hjärnvävnad erbjuder epi-mode-avbildning överlägsen bildkvalitet för vävnadstjocklek > 2 mm13. Detta protokoll använder en polariserande stråldelare (PBS) för att samla spridda fotoner depolariserade av vävnad. Det är möjligt att samla fler fotoner med en ringformig detektor på bekostnad av komplexiteten hos anpassad detektormontering12. PBS-metoden är enklare att implementera (liknande fluorescens), med standardfotodioden som redan används för detektering av överföringsläge.
Pseudo-H&E bildgenerering När tvåfärgade SRS-bilder har samlats in kan de färgas om för att simulera H&E-färgning. Detta dokument visar proceduren för att konvertera lipid- och protein SRS-bilder till pseudo-H & E SRS-bilder för patologiska applikationer. Det experimentella protokollet beskriver kritiska steg som behövs för att generera högkvalitativa SRS-bilder. Förfarandet som visas här är inte bara tillämpligt på vävnadsdiagnos utan kan också anpassas för många andra hyperspektrala SRS-avbildningsapplikationer som läkemedelsavbildning och metabolisk avbildning14,15.
Allmänna systemkrav Lasersystemet för detta protokoll måste kunna mata ut 2 synkroniserade femtosekundlaserstrålar. Systemen har idealiskt en optisk parametrisk oscillator (OPO) för bred våglängdsinställning av en av laserstrålarna. Installationen i detta protokoll använder ett kommersiellt lasersystem Insight DS + som matar ut två lasrar (en fast stråle vid 1 040 nm och en OPO-baserad avstämbar stråle, från 680 till 1 300 nm) med en repetitionshastighet på 80 MHz. Laserskanningsmikroskop, antingen från stora mikroskoptillverkare eller hembyggda, kan användas för SRS-avbildning. Det använda mikroskopet är ett upprätt laserskanningsmikroskop byggt ovanpå en kommersiell upprätt mikroskopram. Ett par 5 mm galvospeglar används för att skanna laserstrålen. För användare som väljer att anta ett hembyggt laserskanningsmikroskop, se ett tidigare publicerat protokoll för konstruktion av ett laserskanningsmikroskop16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-100-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 MHz bandpass filter</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>BBP-21.4+</td>
			<td>Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mm Achromatic Lens</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>AC254-200-B</td>
			<td>Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Half Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA2210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband half waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Quarter Waveplate</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>WPA4210-650-1100-M25.4</td>
			<td>Broadband quarter waveplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Sampler</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BSN11</td>
			<td>10:90 Plate Beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DMSP1000</td>
			<td>Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrooptic Amplitude Modulator</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>EO-AM-NR-C1</td>
			<td>Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>False H&#38;E Staining Script</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fanout Buffer</td>
			<td>PRL-414B</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Photodiode</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>DET10A2</td>
			<td>Si Detector, 1 ns Rise Time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frequency Divider</td>
			<td>PRL-220A</td>
			<td>Pulse Research Lab</td>
			<td>TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly Dispersive Glass Rods</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>CYLROD01</td>
			<td>High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight DS+</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td>Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in Amplifier</td>
			<td>Liquid Instruments</td>
			<td>Moku Lab</td>
			<td>Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>BB05-E03-10</td>
			<td>Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Delay Stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-DMQ12P-DE52</td>
			<td>Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersion Condensor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CSC1003</td>
			<td>1.4 NA. Other condensers with NA&#62;1.2 can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS7054</td>
			<td>Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Shifter</td>
			<td>SigaTek</td>
			<td>SF50A2</td>
			<td>For shifting the phase of the modulation frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu Corp</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td>Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing Beam Splitter</td>
			<td>Union Optic</td>
			<td>PBS9025-620-1000</td>
			<td>Broadband polarizing beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refactive Index Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>refractiveindex.info</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retro-reflector</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>34-408</td>
			<td>BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF Power Amplifier</td>
			<td>Minicircuits</td>
			<td>ZHL-1-2W+</td>
			<td>Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan Mirrors</td>
			<td>Cambridge Technologies</td>
			<td>6215H</td>
			<td>We used a 5mm mirror set with silver coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>Vidrio</td>
			<td>ScanImage Basic</td>
			<td>Laser scanning microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FESH1000</td>
			<td>25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse FN1</td>
			<td>Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Immersion Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time, two-color stimulated raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis

Stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi har uppstått som en kraftfull optisk bildteknik för vävnadsdiagnos. Under de senaste åren har tvåfärgade SRS visat sig kunna ge hematoxylin och eosin (H & E) -ekvivalenta bilder som möjliggör snabb och tillförlitlig diagnos av hjärncancer. Sådan förmåga har möjliggjort spännande intraoperativa cancerdiagnosapplikationer. Tvåfärgad SRS-avbildning av vävnad kan göras med antingen en pikosekund eller femtosekund laserkälla. Femtosekundlasrar har fördelen att de möjliggör flexibla bildlägen, inklusive snabb hyperspektral avbildning och SRS-avbildning i realtid i två färger. En spektralfokuseringsmetod med chirped laserpulser används vanligtvis med femtosekundlasrar för att uppnå hög spektral upplösning. 
Tvåfärgs SRS-förvärv kan realiseras med ortogonal modulering och inlåsningsdetektering. Komplexiteten i pulsklanderi, modulering och karakterisering är en flaskhals för det utbredda antagandet av denna metod. Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för att demonstrera implementering och optimering av spektralfokuserande SRS och realtids, tvåfärgad avbildning av mushjärnvävnad i epi-läge. Detta protokoll kan användas för ett brett spektrum av SRS-bildapplikationer som utnyttjar SRS: s höghastighets- och spektroskopiska bildkapacitet.

Optimera spektral upplösning: Dispersion genom ett material påverkas av det dispersiva mediet (längd och material) och våglängd. Ändring av dispersionsstångens längd påverkar spektralupplösningen och signalstorleken. Det är ett ge-och-ta-förhållande som kan vägas olika beroende på ansökan. Stavarna sträcker ut strålpulsen från att vara bred i frekvens och smal i tid till att vara smal i frekvens och bred i tiden. Figur 7 visar effekten av varierande sta...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis at JoVE.com

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi är en kraftfull, icke-destruktiv och etikettfri bildteknik. En framväxande tillämpning är stimulerad Raman-histologi, där tvåfärgad SRS-avbildning vid protein- och lipid Raman-övergångarna används för att generera pseudo-hematoxylin- och eosinbilder. Här demonstrerar vi ett protokoll för realtid, tvåfärgad SRS-avbildning för vävnadsdiagnos.

Realtid, tvåfärgad stimulerad Raman-spridningsavbildning av mushjärnan för vävnadsdiagnos

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Detta protokoll kommer att demonstrera implementering och optimering av spektralfokusering SRS-mikroskopi och hur den kan användas för realtidsstimulerade Raman-histologiapplikationer. Den största fördelen med denna teknik är den hastighet med vilken prover kan bearbetas när instrumenteringen är korrekt inriktad, eftersom SRS inte kräver vävnadsbehandling och färgning. Detta protokoll är tillämpligt på andra SRS-applikationer, inte bara begränsat till histologi.Sådana tillämpningar innefattar små molekyler, läkemedel, celler och vävnader. Börja med att installera ett par akromatiska linser för pumpstrålen för att förstora laserstrålens storlek med två gånger som utgångspunkt. Placera en 100 och 200 millimeter lins på ungefär 300 millimeter från varandra.Rikta sedan pumpstrålen genom mitten av båda linserna. Placera sedan en spegel efter den andra linsen för att skicka strålen mot en vägg mer än en meter bort. Spåra strålen från spegeln till väggen med ett IR-kort och kontrollera om strålen ändras i storlek.Collimate strålen om strålen ändras i storlek som en funktion av avståndet. Kombinera de två laserstrålarna genom att installera en dikroisk spegel med flera styrspeglar för justering. Optimera den rumsliga överlappningen av pumpen och Stokes genom att övervaka balkar efter den dikroiska spegeln på två olika positioner runt en meters mellanrum.Justera styrspegeln iterativt följt av den dikroiska spegeln för att rikta in Stokes-strålen mot pumpstrålen. Se till att de kombinerade strålarna skickas till mitten av skanningsspeglarna i laserskanningsmikroskopet genom att justera ett par styrspeglar när skanningsspeglarna är parkerade. Efter kondensorn, använd ett annat par linser med brännvidder på 100 millimeter respektive 30 millimeter för att vidarebefordra den överförda strålen till fotodioden, vilket säkerställer att båda strålarna finns i fotodioden.Installera sedan två lågpassfilter för att blockera den modulerade Stokes-strålen. Placera en strålprovtagare i Stokes strålbana för att plocka upp 10% av strålen och skicka den till en snabb fotodiod för att detektera pulståget på 80 megahertz. Ta en av utgångarna från fläktbufferten och filtrera den med ett bandpassfilter för att få en 20 megahertz sinusformad våg.Använd sedan en RF-dämpare för att justera utgångstoppen till toppspänningen till cirka 500 millivolt. Skicka den resulterande utgången till en fasskiftare, vilket möjliggör finjustering av RF-fasen med en spänningskälla. Skicka denna utgång till en RF-effektförstärkare och anslut förstärkarens utgång till EOM.Efter att ha avblockerat Stokes-strålen, optimera moduleringsdjupet för den första EOM genom att placera en fotodiod i strålbanan. Justera EOM-spänningen och kvartsvågsplattan tills moduleringsdjupet verkar tillfredsställande. Placera en fotodiod efter den dikroiska spegeln för att detektera laserstrålen.Blockera Stokes-strålen först och zooma sedan in på en av pumpens pulstoppar på oscilloskopet. Placera en vertikal markör för att markera den tidsmässiga positionen för denna topp med oscilloskopet. Blockera nu pumpstrålen och avblockera Stokes-strålen.Översätt fördröjningssteget så att det tillfälligt matchar topppositionerna på oscilloskopet med den markerade positionen i föregående steg. Genom att beräkna det fördröjningsavstånd som krävs för att matcha de två balkarna följt av att förlänga strålbanan för den snabbare strålen eller förkorta strålbanan för den långsammare strålen. Förbered sedan ett mikroskopbildprov med DMSO och dubbelsidig tejp som en distans för att hålla provet mellan bilden och en täckglas.Placera provet på mikroskopet med täcksidan vänd mot mikroskopmålet och observera provet från I-stycket under ljusfältsbelysning. Hitta provets fokus på både det övre och nedre lagret av luftbubblor vid glasbandets gränssnitt och flytta sedan fokus för att vara mellan de två lagren av tejpen. Ställ sedan in den avstämbara strålutgången till 798 nanometer.Baserat på kondensorns optiska genomströmning, justera den optiska effekten till cirka 40 milliwatt vardera för pumpen och Stokes-strålarna vid objektivfokus. Öppna sedan skanningsbilden i MATLAB och klicka på knappen märkt fokus för att börja skanna. Justera styrspegeln före galvoskannern för att centrera likströmssignalen på kanal ett-displayen.Flytta det motoriserade fördröjningssteget och observera noga inlåsningsutgången som visas på kanal två-displayen. Justera slutligen tidsfördröjningen för att maximera AC-signalintensiteten. Justera den dikroiska spegeln för att centrera SRS-signalen på AC-kanalen.Justera sedan fasen på inlåsningsförstärkaren för att maximera signalen. Efter montering av provet glider du på mikroskopet och justerar effekten av båda strålarna till cirka 40 milliwatt vardera vid provfokus som visats tidigare. Öppna skanningsbilden från MATLAB.Hitta sedan den maximala SRS-signalen genom att skanna genom fördröjningssteget som motsvarar 2 913 invers centimeter Raman-toppen av DMSO. Skaffa en SRS-bild som motsvarar 2 913 invers centimeter Raman-toppen av DMSO. Öppna bilden i ImageJ och välj ett litet område i mitten av ramen.Använd måttfunktionen för att beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för värden i det valda området. För kalibrering av frekvensåtkomst, spara en hyperspektral skanning med fördröjningsstegsområdet som täcker 2, 913 och 2 994 inversa centimeter Raman-toppar av DMSO. Spara sedan scenpositionerna som motsvarar den hyperspektrala datauppsättningen.Utför linjär regression för scenpositionerna och Raman skiftar vid 2, 913 och 2 994 inversa centimeter. Använd den linjära regressionsekvationen och konvertera fördröjningspositionerna till motsvarande Raman-frekvenser. För kalibrering av spektral upplösning, uppskatta scenpositionen baserat på föregående position med den ökade optiska banlängden på grund av införandet av stavar.Justera balkarnas rumsliga överlappning på grund av strålens lilla avvikelse när glasstavar läggs till. Installera en polariserande stråldelare, en kvartsvågsplatta och en andra EOM i soaks-strålbanan efter den första EOM. Koppla ur signalingången till den andra valången, anslut sedan signalingången till den första valången och slå på den.Modulera Stokes-strålen vid 20 megahertz genom att skicka strålen genom den första EOM. Justera lutningen och läget för den första valströmsepunkten för att säkerställa att strålen är centrerad genom EOM-kristallen. Förbered ett vävnadsbildprov med dubbelsidig tejp, mikroskopglid och täckglas.Placera provet på mikroskopet med täcksidan vänd mot mikroskopmålet. För epi-mode SRS-avbildning, installera en halvvågsplatta innan strålen kommer in i mikroskopet för att ändra polarisationen av strålen som går in i mikroskopet. Placera en polariserande stråldelare ovanför målet så att den depolariserade ryggreflekterade strålen kan nå detektorn.Använd sedan en 75 millimeter akromatlins och en 30 millimeter asfärisk lins för att vidarebefordra de bakre spridda fotonerna från målets bakre bländare till fotodetektorn. Montera detektorn för att samla det bakre spridda ljuset som riktas av polariserande stråldelare. Installera sedan ett filter för att blockera den modulerade strålen från att komma in i detektorn.Varierande stavlängder påverkar spektralupplösningen. När inga kvittrande stavar i glas används löses inte de två Raman-topparna från DMSO alls. En ökning av antalet glasklockstänger börjar lösa de två topparna vid en tillfredsställande punkt.Matchad chirping löser båda topparna och kan användas för att kalibrera scenpositioner till frekvens. Två gånger försenade pulståg med ortogonal polarisation som används för att avbilda DMSO-spektra visar tidsfördröjningen mellan SRS-excitaterna med acceptabelt moduleringsdjup och tidsmässig separation. Däremot ger en dålig tvåfärgad SRS-fasförskjutning upphov till inverterade eller negativa toppar.Realtid tvåfärgad SRS-avbildning vid 2, 850 och 2, 930 inversa centimeter ex vivo mus hjärnvävnad visas här. De råa lipid- och proteinbilderna färgkodades för att producera en enda bild som visar lipid- och proteinbidrag. Falsk hematoxylin och eosinfärgning utfördes också för att efterlikna hematoxylin och eosinfärgning för patologiska applikationer.Rumslig temporal överlappning och optimering av rumslig upplösning är de viktigaste stegen för SRS:s rumsliga fokuseringsmetod. Denna metod är allmänt tillämplig för andra pumpsondmikroskopiexperiment såsom övergående absorptionsmikroskopi. Metoden möjliggör också avbildning av icke-fluorescerande molekyler i celler och vävnad.Metoden som presenteras här påskyndar bildupptagningstiden för framtida översättning av stimulerad Raman-histologi i kliniken.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Beröringsfri, Label-free övervakning av celler och extracellulär matris med Raman-spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Handhållna Tredimensionell optoakustisk Imaging Probe för djup vävnad Human angiografi och funktionella Prekliniska studier i realtid

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Använda Cell-substrat Impedans och levande cell imaging att mäta Realtids Förändringar i Cellular Adhesion och De-vidhäftning inducerad av Matrix Ändring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Realtid Övervakning av hög intensitet fokuserat ultraljud (HIFU) ablation av<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Lever Använda Harmonic Motion Imaging för fokuserat ultraljud (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Handhållna kliniska Photoacoustic Imaging System för realtid noninvasiv små djur Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Ett protokoll för realtid 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ Mikroskopi för real tids bestämning av encellig morfologi i bioprocesser

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In vivo tvåfärgad 2-Photon Imaging av genetiskt märkta reporter celler i huden

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Intravital multifotonmikroskopi i realtid för att visualisera fokuserade ultraljuds- och mikrobubblebehandlingar för att öka blod- hjärnbarriären permeabilitet

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

In vivo Avbildning av biologiska vävnader med kombinerad tvåfoto fluorescens och stimulerad Raman spridningsmikroskopi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...