Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Zhangyong Ming og Mr. Rongji Hou for deres råd om LIMS udvidet ansøgning. Denne undersøgelse er støttet af PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (nr. 20-065-76) og Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Alle protokoller og trophectoderm (TE) biopsi (1.1.1.1 afsnit), der blev anvendt i denne undersøgelse, blev gennemgået og godkendt af den humane forskningsetiske komité på nr. 924 hospital den 18. september 2017 (NO: PLA924-2017-59). Patienterne/deltagerne gav deres skriftlige informerede samtykke til at deltage i dette studie.
1. DNA-isolering fra human embryobiopsi og hel genomisk amplifikation
<ol><li>Protokol for helgenomforstærkning 9,1...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+aneuploidy+rates+are+equivalent+in+natural+cycles+and+gonadotropin-stimulated+cycles.">Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles.</a> Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).</li><li>Adams, D. R., Eng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+to+diagnose+suspected+genetic+disorders.">Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).</li><li>Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+ion+torrent+semiconductor+chip+based+sequencing.">Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing.</a> Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).</li><li>Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+techniques:+Implications+for+clinical+prenatal+diagnosis.">Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis.</a> Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).</li><li>Dilliott, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+next-generation+sequencing+and+bioinformatics+pipeline+to+evaluate+genetic+determinants+of+constitutional+disease.">Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).</li><li>Ion ReproSeq&#8482; PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf</a> (2017)</li><li>PicoPLEX&#174; Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf">https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf</a> (2019)</li><li>. Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html">https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html</a> (2017)</li><li>Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Bayesian+inference+of+copy+number+variants+using+Hidden+Markov+models+with+wavelet+compression.">Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression.</a> PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).</li><li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+using+fluorescence+in+situ+hybridization+in+patients+with+repetitive+implantation+failure+and+advanced+maternal+age:+two+randomized+trials.">Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).</li><li>Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+screening+(PGS)+still+in+search+of+a+clinical+application:+a+systematic+review.">Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).</li><li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+pre-implantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations.">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li><li>Handyside, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=24-chromosome+copy+number+analysis:+a+comparison+of+available+technologies.">24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).</li><li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation.">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li><li>El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequence+assembly:+Four+stages+of+data+processing+and+computational+challenges.">Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges.</a> PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).</li><li>Jennings, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+validation+of+next-generation+sequencing-based+oncology+panels:+A+joint+consensus+recommendation+of+the+Association+for+Molecular+Pathology+and+College+of+American+Pathologists.">Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).</li><li>de Bourcy, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+comparison+of+single-cell+whole+genome+amplification+methods.">A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods.</a> PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).</li><li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+pre-implantation+genetic+screening+cycles.">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li><li>Damerla, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Torrent+sequencing+for+conducting+genome-wide+scans+for+mutation+mapping+analysis.">Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis.</a> Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).</li><li>Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+testing+for+aneuploidy:+what+technology+should+you+use+and+what+are+the+differences.">Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+improving+access+to+variant+interpretations+and+supporting+evidence.">ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence.</a> Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).</li><li>Genomes Project, C, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+reference+for+human+genetic+variation.">A global reference for human genetic variation.</a> Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).</li><li>McKusick, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+in+man+and+its+online+version,+OMIM.">Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM.</a> American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).</li><li>Zhao, M., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNVannotator:+A+comprehensive+annotation+server+for+copy+number+variation+in+the+human+genome.">CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome.</a> PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+next-generation+sequencing+in+pre-implantation+genetic+diagnosis+cycles+for+Robertsonian+and+reciprocal+translocations.">Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+allele+with+resolved+carrier+status+of+Robertsonian+and+reciprocal+translocation+in+human+pre-implantation+embryos.">Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).</li></ol>

Kromosomal aneuploidi af embryoner er årsagen til en stor del af graviditetstabet, uanset om det er undfanget naturligt eller in vitro befrugtning (IVF). I den kliniske praksis med IVF foreslås det, at screening af embryoaneuploidi og overførsel af euploidiembryoet kan forbedre resultatet af IVF. Fluorescens in situ hybridisering er den tidligste teknik, der er vedtaget til kønsselektion og PGT-A; Denne teknik kræver dog mere teknisk ekspertise fra laboratoriepersonale og er relativt arbejdskræven...

Aneuploidi er abnormiteten i antallet af kromosomer ved tilstedeværelsen af et eller flere ekstra kromosomer eller fraværet af et eller flere kromosomer. Embryoner, der bærer en form for aneuploidi, såsom tab af et X-kromosom (Turner syndrom), ekstra kopier af autosomer, som trisomier af autosom 21 (Downs syndrom), 13 (Patau syndrom) og 18 (Edwards syndrom) eller ekstra kønskromosomer som 47, XXY (Klinefelter syndrom) og 47, XXX (Triple X syndrom), kan overleve til sigt med fødselsdefekter1. Aneuploidi er den primære årsag til aborter i første trimester og in vitro befrugtning (IVF)svigt 2. Det rapporteres, at aneuploidihastigheden kan variere fra 25.4% -84.5% gennem de forskellige alderslag i den naturlige cyklus og medicinsk kontrolgruppe i IVF-praksis3.
Næste generations sekventeringsteknologi bliver vildt anvendt til bestemmelse af genetisk information klinisk; det giver praktisk adgang til genomsekvens med effektivitet og høj gennemstrømning. Især næste generations sekventering revolutionerede også diagnosen af lidelser med genetiske faktorer og test for abnormitet i genomet4. Ved hjælp af halvledersekventeringsteknologi til direkte overførsel af kemiske signaler i sekventeringsbioreaktion til digitale data giver det halvlederbaserede sekvenssystem en direkte realtidsdetektion til sekvensdata i 3-7 h 5,6.
I en IVF-procedure undersøger præimplantationsgenetisk test (PGT) embryoets genetiske profil, inden den overføres til livmoderen for at forbedre IVF-resultatet og reducere risikoen for genetiske lidelser hos nyfødte 1,7. I PGT kombineret med NGS-teknikker forstærkes genetisk materiale ekstraheret fra mindre end 10 celler med helgenomforstærkningssæt eller et uafhængigt udviklet helgenom-amplifikationsreagens. Dette kræver kun et trin i forstærkningsfasen og kræver ikke forforstærkning for at opnå helgenomforstærkningsprodukter. Primere eller paneler til kopinummervariant og speciel genlokalisering er designet og anvendt i det konstruerede bibliotek.
En typisk arbejdsgang for præimplantationsgenetisk testning-aneuploidi (PGT-A) i NGS involverer serielle procedurer og kræver en intens arbejdsbyrde for laboratoriepersonale8. Nogle fejloperation forårsaget procedure roll-back kan føre til uønsket tab af både tid og ressourcer i laboratoriet. En kortfattet og klar standardoperationsprocedure (SOP) for PGS-NGS-arbejdsgangen er nyttig; Ordformatprotokoller kan dog ikke præsentere mere detaljerede oplysninger om prøvebehandling, enhedsmanipulation og instrumenters indstillinger, som kan visualiseres i en videoprotokol. I denne artikel kan en valideret arbejdsgang kombineret med en visualiseret demonstration af driftsdetaljer tilbyde mere direkte og intuitive henvisningsprotokoller i PGT-praksis på en halvledersekventeringsplatform.
Protokollen beskriver her en metode, der understøtter batching op til 16 embryobiopsier parallelt. For større partier anbefales det at bruge en kommerciel kitbaseret protokol til halvledersekventering, såsom Reproes-PGS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

Næste generations sekventering har fået stigende betydning i den kliniske anvendelse i bestemmelsen af genetiske varianter. I den genetiske test før implantation har denne teknik sine unikke fordele i skalerbarhed, gennemstrømning og omkostninger. Til præimplantationsgenetisk test til aneuploidianalyse giver det halvlederbaserede næste generations sekventeringssystem (NGS), der præsenteres her, en omfattende tilgang til bestemmelse af strukturelle genetiske varianter med en minimumsopløsning på 8 Mb. Fra prøveoptagelse til den endelige rapport kræver arbejdsprocessen flere trin med tæt overholdelse af protokoller. Da forskellige kritiske trin kunne bestemme resultatet af forstærkning, bibliotekets kvalitet, dækning af læsninger og output af data, kunne beskrivende information med anden visuel demonstration end ord give flere detaljer til operationen og manipulationen, hvilket kan have stor indflydelse på resultaterne af alle kritiske trin. De metoder, der præsenteres heri, vil vise de procedurer, der er involveret i helgenomforstærkning (WGA) af biopsierede Trophectoderm (TE) celler, genomisk bibliotekskonstruktion, sequencerstyring og endelig generering af kopinummervarianters rapporter.

Når sekvensplanen er færdig efter den kørende proces i maskinen, rapporterer sekvensserversystemet oversigten med beskrivende oplysninger om genererede data, chipstatus, isp-indlæsningshastighed og bibliotekskvalitet, som vist i figur 2. I denne resultatdemonstration blev der opnået 17,6 G data i den samlede base, og den samlede belastningshastighed for ISP var 88% i chippens samlede brønde; varmekortet viste, at prøven var jævnt belastet på chippens samlede areal (<strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Protokollen præsenterer de overordnede procedurer i laboratoriet, der kræves i genetisk test før implantation for aneuploidi på en halvlederbaseret næste generations sekventeringsplatform. Her præsenterer vi de detaljerede trin i helgenomforstærkning, udvælgelse af DNA-fragment, bibliotekskonstruktion, skabelonforberedelse og sekventering af arbejdsflow med repræsentative resultater.

Præimplantationsgenetisk test for aneuploidi på en halvlederbaseret næste generations sekventeringsplatform

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Denne protokol præsenterer proceduren fra enkeltcelleforstærkning til endelige rapporteringsdata i den genetiske test før implantation for aneuploidi på en halvlederbaseret næste generations sekventeringsplatform. Denne procedure kan hjælpe seerne med at få en god forståelse af den eksperimentelle arbejdsgang for PGT-A-sekventering og replikere denne teknik i et diagnostisk laboratorium med en halvlederbaseret NGS-platform. Begynd med at pipettere 25 mikroliter af hele genomforstærkningsprodukterne og overføre dem til et 1,5 milliliter centrifugerør, der er forudindlæst med 25 mikroliter nukleasefrit vand.Vortex og bland DNA-rensningsperlerne. Aliquot 50 mikroliter af denne opløsning i hvert prøverør. Hvirvel og centrifuge kort i fem sekunder.Indstil røret i fem minutter ved stuetemperatur til DNA-bindingsprocessen. Indsæt 1,5 milliliter centrifugerøret i et magnetisk stativ. Vent derefter, indtil alle de magnetiske perler tiltrækkes af rørets sidevæg.Overfør forsigtigt supernatanten til et nyt 1,5 ml centrifugerør. Undgå at pipettere perlerne ud. Ifølge det oprindelige prøvevolumen.Pipetter 30 mikroliter magnetiske perler, hvirvel og centrifuge kort i fem sekunder. Indstil røret i fem minutter ved stuetemperatur til DNA-bindingsprocessen. Indsæt 1,5 millimeter centrifugerørene i magnetstativet.Vent derefter, indtil alle de magnetiske perler tiltrækkes af rørets sidevæg. Fjern forsigtigt og kassér supernatanten. Undgå at pipettere perlerne ud.Pipetter 300 mikroliter 70% ethanol i 1,5 milliliter centrifugerøret. Drej derefter forsigtigt røret to gange i en 180-graders vinkel, og flyt perlerne langs rørvæggen for en grundig vask. Piftet og kassér supernatanten.Undgå at pipettere perlerne ud. Gentag vaskeproceduren en gang. Placer en ny forstærkningsplade i systemet, når det rene program er afsluttet.Indsæt opsamlingsrørene, hver fyldt med 150 mikroliter brudopløsning to i rotoren, og placer derefter broen på opsamlingsrørene. Tilsæt reaktionsolien til halvdelen af røret og emulgatorbrudopløsningen til en tredjedel af røret. Placer et nyt filter til skabelonforberedelse på et rørstativ med prøveportalen placeret opad.Hvirvelopløsningen i fem sekunder og centrifuge kort i fem sekunder. Derefter overføres opløsningen til filterets prøveportal efter pipettering af 800 mikroliter tre gange. Centrifuger røret for at mindske bobler før den sidste injektion.Undgå at sprøjte luft ind i filteret. Injicer 200 mikroliter reaktionsolie to efter den blandede opløsning. Vend filterets prøveportal nedad, og udskift vasketilpasningen med filteret.Indsæt prøvenålen i rotorlågets midterste hul, og tryk derefter nålen mod bunden. Klik på knappen Kør på skærmen, og vælg programmet i henhold til det tilsvarende sæt. Vælg derefter Assisteret for at kontrollere alle trin.Klik på Næste, indtil kørslen er startet. Løbet tager cirka 4,5 timer at afslutte. Vælg Næste, når programmet er færdigt.Systemet starter en 10-minutters centrifugeringsproces. Efter centrifugering skal du klikke på knappen Åbn låg og flytte opsamlingsrørene til stativer. Hvis proceduren ikke bevæger sig til næste trin om 15 minutter, skal du trykke på det sidste spin for at centrifugere igen.Fjern supernatanten i opsamlingsrøret, og efterlad 100 mikroliter opløsning i røret. Den resterende prøve blandes ved pipettering, og prøven overføres til det nye 1,5 ml centrifugerør mærket OT. Når du pipetterer supernatanten, skal du undgå at røre bunden af røret langs siderne. Pipetter 100 mikroliter nukleasefrit vand i hvert opsamlingsrør, og opløsningen overføres til OT-røret, der vaskes ved gentagen pipettering.Tilsæt 600 mikroliter nukleasefrit vand til OT-røret for at udgøre det samlede volumen på en milliliter. Vortex i 30 sekunder i centrifuge ved 15.500 gange G i otte minutter. Fjern forsigtigt supernatanten og efterlader 100 mikroliter opløsning i OT-røret.Brug spidsen til at kassere olielaget helt. Tilsæt 900 mikroliter nukleasefrit vand, hvirvel i 30 sekunder og centrifuge ved 15.500 gange G i otte minutter. Fjern supernatanten, indtil 20 mikroliter af opløsningen er tilbage, og tilsæt skabelonens resuspenderende opløsning for at udgøre volumenet på 100 mikroliter.Derefter hvirvel i 30 sekunder og kortvarigt centrifuge i to sekunder. Fortsæt til næste trin inden for 12 timer efter prøvebehandling Læg 100 mikroliter af det fortyndede bibliotek, 130 mikroliter C1-perler, 300 mikroliter tre x skabelonvaskeopløsning og 300 mikroliter af smelteopløsningen til de otte brøndstrimler. Installer de otte brøndstrimler på berigelsesmodulet, læg pipettspidsen i, og sæt centrifugerøret på 200 mikroliter i opsamlingspositionen.Klik på Start for at køre programmet. Der pipetteres 55 mikroliter af prøveopløsningen, og den injiceres i prøvehullet på chippen. Sæt chippen på centrifugen.Hold hakket mod ydersiden og prøveportalen indeni. Balancer det derefter med en anden brugt chip og centrifuge i 10 minutter. Forbered indlæsningsløsningen som beskrevet i tekstmanuskriptet.Blæs 100 mikroliter luft ind i skummende opløsning. Pipetter opløsningen gentagne gange, indtil boblerne er i tæt, skummende tilstand, og hold skumvolumenet på ca. 250 mikroliter. Placer chippen på bænken efter centrifuge.Injicer 100 mikroliter skum i prøvehullet, og fjern den ekstruderede opløsning i udgangsportalen. Centrifuger derefter chippen kort i 30 sekunder. Gentag denne proces én gang.Injicer 100 mikroliter ved 50% vaskebuffer to gange, og fjern den ekstruderede opløsning i udportalen efter hver injektion. Derefter injiceres 100 mikroliter ved 50% udglødningsbuffer tre gange, og fjern den ekstruderede opløsning i udportalen efter hver injektion. Injicer 65 mikroliter ved 50% enzymreaktionsbuffer, undgå bobler og fjern den ekstruderede opløsning i udportalen.Stabiliser den indlæste chip ved stuetemperatur i fem minutter, og installer chippen på sequencer-chipportalen. Vælg det planlagte program kontroller oplysningerne og start kørslen. Den repræsentative kørsel opnåede i alt 17, 6 gigabyte data, og den samlede belastningshastighed for ionkuglepartiklen var 88% i chipens samlede brønde.Varmekortet bekræftede endda prøvebelastning på det samlede chipareal. 77% af de samlede læsninger var brugbare. Alle brønde fyldt med internetudbyder viste 100% skabelonberigelse, hvor 78% var klonale.Ud af alle klonale skabeloner blev 97% kvalificeret som det endelige bibliotek. Den gennemsnitlige længde af læsningen var 177 basepar, mens medianen og tilstanden var henholdsvis 176 og 174 basepar. Peak counts af thymin, cytosin og adenin i skabelonerne var ca. 76 over den kvalificerede cutoff linje på 50.I alle adresserbare brønde med levende internetudbydere kvalificerede 99,5% sig som det konstruerede bibliotek, og 20% af polyklonale biblioteker og biblioteker af lav kvalitet blev filtreret ud, mens 76,6% af internetudbydere var kvalificerede til yderligere analyse. Resultatet af kopinummervariation fra en enkelt prøve viste en 182,16 megabaseparmosaiktrisomi på P 16,3 til Q 35,2 på kromosom fire og et 33-punkts 13 megabasepar monosomisegment af Q 11,1 til Q 13,33 på kromosom 22. Ved fragmentudvælgelse bør tidsintervallerne mellem trinene ændres i henhold til størrelsen af prøverne i samme batch for at forhindre over- og manglende eksponering for for- og bagendeprøver.

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering af DNA forurening i RNA prøver baseret på ribosomale DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimering og sammenligningsanalyse af planteorganell DNA-berigelsesmetoder egnet til næste generations sekventering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: En High Throughput sekventering-baseret teknik til identifikation af sent replikerende regioner i genomet

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Målrettet næste generation Sequencing og bioinformatik rørledningen for at evaluere genetiske determinanter for forfatningsmæssige sygdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forstærkning af nær fuld længde HIV-1 provirus for næste Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Gensplejsning af Dictyostelium discoideum celler baseret på udvælgelse og vækst på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halvleder sekvensering for præimplantations genetisk testning for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massespektrometri-baseret Proteomics analyser ved hjælp af OpenProt Database til at afsløre nye proteiner oversat fra ikke-kanoniske åbne læserammer

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA Next-generations sekvensering og en Bioinformatik pipeline til identificering af udtrykte linje-1s på det locus-specifikke niveau

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...