Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

We willen Dr. Zhangyong Ming en de heer Rongji Hou bedanken voor hun advies over de uitgebreide toepassing van LIMS. Deze studie wordt ondersteund door PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) en Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Alle protocollen en de trophectoderm (TE) biopsie (1.1.1.1 sectie) toegepast in deze studie werden beoordeeld en goedgekeurd door de humane onderzoeksethiek commissie van no. 924 ziekenhuis op 18 september 2017 (NO: PLA924-2017-59). De patiënten/deelnemers gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan dit onderzoek.
1. DNA-isolatie van biopsie van menselijke embryo's en volledige genomische amplificatie
<ol><li>Protocol voor versterking van het geh...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+aneuploidy+rates+are+equivalent+in+natural+cycles+and+gonadotropin-stimulated+cycles.">Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles.</a> Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).</li><li>Adams, D. R., Eng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+to+diagnose+suspected+genetic+disorders.">Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).</li><li>Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+ion+torrent+semiconductor+chip+based+sequencing.">Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing.</a> Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).</li><li>Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+techniques:+Implications+for+clinical+prenatal+diagnosis.">Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis.</a> Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).</li><li>Dilliott, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+next-generation+sequencing+and+bioinformatics+pipeline+to+evaluate+genetic+determinants+of+constitutional+disease.">Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).</li><li>Ion ReproSeq&#8482; PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf</a> (2017)</li><li>PicoPLEX&#174; Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf">https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf</a> (2019)</li><li>. Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html">https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html</a> (2017)</li><li>Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Bayesian+inference+of+copy+number+variants+using+Hidden+Markov+models+with+wavelet+compression.">Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression.</a> PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).</li><li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+using+fluorescence+in+situ+hybridization+in+patients+with+repetitive+implantation+failure+and+advanced+maternal+age:+two+randomized+trials.">Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).</li><li>Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+screening+(PGS)+still+in+search+of+a+clinical+application:+a+systematic+review.">Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).</li><li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+pre-implantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations.">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li><li>Handyside, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=24-chromosome+copy+number+analysis:+a+comparison+of+available+technologies.">24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).</li><li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation.">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li><li>El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequence+assembly:+Four+stages+of+data+processing+and+computational+challenges.">Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges.</a> PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).</li><li>Jennings, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+validation+of+next-generation+sequencing-based+oncology+panels:+A+joint+consensus+recommendation+of+the+Association+for+Molecular+Pathology+and+College+of+American+Pathologists.">Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).</li><li>de Bourcy, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+comparison+of+single-cell+whole+genome+amplification+methods.">A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods.</a> PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).</li><li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+pre-implantation+genetic+screening+cycles.">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li><li>Damerla, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Torrent+sequencing+for+conducting+genome-wide+scans+for+mutation+mapping+analysis.">Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis.</a> Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).</li><li>Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+testing+for+aneuploidy:+what+technology+should+you+use+and+what+are+the+differences.">Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+improving+access+to+variant+interpretations+and+supporting+evidence.">ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence.</a> Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).</li><li>Genomes Project, C, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+reference+for+human+genetic+variation.">A global reference for human genetic variation.</a> Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).</li><li>McKusick, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+in+man+and+its+online+version,+OMIM.">Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM.</a> American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).</li><li>Zhao, M., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNVannotator:+A+comprehensive+annotation+server+for+copy+number+variation+in+the+human+genome.">CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome.</a> PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+next-generation+sequencing+in+pre-implantation+genetic+diagnosis+cycles+for+Robertsonian+and+reciprocal+translocations.">Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+allele+with+resolved+carrier+status+of+Robertsonian+and+reciprocal+translocation+in+human+pre-implantation+embryos.">Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).</li></ol>

Chromosomale aneuploïdie van embryo's is de oorzaak van een groot deel van het zwangerschapsverlies, of het nu op natuurlijke wijze is verwekt of in-vitrofertilisatie (IVF). In de klinische praktijk van IVF wordt voorgesteld dat het screenen van de embryo-aneuploïdie en het terugplaatsen van het euploïdie-embryo de uitkomst van IVF zou kunnen verbeteren. Fluorescentie in situ hybridisatie is de vroegste techniek die wordt toegepast voor geslachtsselectie en PGT-A; deze techniek vereist echter meer te...

Aneuploïdie is de afwijking in het aantal chromosomen door de aanwezigheid van een of meer extra chromosomen of de afwezigheid van een of meer chromosomen. Embryo's die een vorm van aneuploïdie dragen, zoals het verlies van één X-chromosoom (syndroom van Turner), extra kopieën van autosomen, zoals trisomieën van autosoom 21 (syndroom van Down), 13 (Patau-syndroom) en 18 (Syndroom van Edwards), of extra geslachtschromosomen zoals 47, XXY (Klinefelter-syndroom) en 47, XXX (Triple X-syndroom), kunnen overleven met geboorteafwijkingen1. Aneuploïdie is de primaire oorzaak van miskramen in het eerste trimester en falen van in vitro fertilisatie (IVF)2. Er wordt gemeld dat het aneuploïdiepercentage kan variëren van 25,4% -84,5% door de verschillende leeftijdslagen van de natuurlijke cyclus en de medicinale controlegroep in IVF-praktijk3.
Next-generation sequencing-technologie wordt steeds meer toegepast bij de klinische bepaling van genetische informatie; het biedt praktische toegang tot genoomsequentie met efficiëntie en hoge doorvoer. Met name de volgende generatie sequencing zorgde ook voor een revolutie in de diagnose van aandoeningen met genetische factoren en tests voor abnormiteit in het genoom4. Met behulp van halfgeleidersequencingtechnologie om chemische signalen direct over te brengen in sequencing bioreactie in digitale gegevens, biedt het op halfgeleiders gebaseerde sequentiesysteem een directe, realtime detectie van sequentiegegevens in 3-7 h 5,6.
In een IVF-procedure onderzoekt pre-implantatie genetisch testen (PGT) het genetische profiel van het embryo voordat het in de baarmoeder wordt overgebracht om de IVF-uitkomst te verbeteren en het risico op genetische aandoeningen bij pasgeborenen te verminderen 1,7. In PGT in combinatie met NGS-technieken wordt genetisch materiaal geëxtraheerd uit minder dan 10 cellen versterkt met amplificatiekits voor het hele genoom of een onafhankelijk ontwikkeld reagens voor amplificatie van het hele genoom. Dit vereist slechts één stap in de amplificatiefase en vereist geen pre-amplificatie om amplificatieproducten voor het hele genoom te verkrijgen. Primers of panelen voor copy number variant en speciale gene loci sequencing worden ontworpen en toegepast in de geconstrueerde bibliotheek.
Een typische workflow van pre-implantatie genetisch testen-aneuploïdie (PGT-A) in NGS omvat seriële procedures en vereist een intense werklast van laboratoriumpersoneel8. Sommige misoperaties veroorzaakten het terugdraaien van de procedure kan leiden tot ongewenst verlies van zowel tijd als middelen van het lab. Een beknopte en duidelijke standard operating procedure (SOP) voor PGS-NGS workflow is nuttig; Tekstindelingsprotocollen kunnen echter geen meer gedetailleerde informatie bevatten over monsterverwerking, apparaatmanipulatie en instellingen van instrumenten, die kunnen worden gevisualiseerd in een videoprotocol. In dit artikel zou een gevalideerde workflow in combinatie met een gevisualiseerde demonstratie van operationele details meer directe en intuïtieve verwijzende protocollen kunnen bieden in de PGT-praktijk op een halfgeleidersequencingplatform.
Het protocol beschrijft hier een methode die het batchen van maximaal 16 embryobiopten parallel ondersteunt. Voor grotere batches wordt aanbevolen om een commercieel kitgebaseerd protocol te gebruiken voor halfgeleidersequencing, zoals Reproes-PGS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

Next-generation sequencing is steeds belangrijker geworden in de klinische toepassing bij de bepaling van genetische varianten. In de pre-implantatie genetische test heeft deze techniek zijn unieke voordelen in schaalbaarheid, doorvoer en kosten. Voor de pre-implantatie genetische test voor aneuploïdie-analyse biedt het hier gepresenteerde semiconductor-based next-generation sequencing (NGS) systeem een alomvattende aanpak om structurele genetische varianten te bepalen met een minimale resolutie van 8 Mb. Van monsteracquisitie tot het eindrapport, het werkproces vereist meerdere stappen met nauwe naleving van protocollen. Aangezien verschillende kritieke stappen het resultaat van versterking, kwaliteit van de bibliotheek, dekking van gelezen gegevens en uitvoer van gegevens kunnen bepalen, zou beschrijvende informatie met visuele demonstratie anders dan woorden meer details kunnen bieden aan de werking en manipulatie, wat een grote impact kan hebben op de resultaten van alle kritieke stappen. De hierin gepresenteerde methoden zullen de procedures weergeven die betrokken zijn bij de versterking van het hele genoom (WGA) van biopsie Trophectoderm (TE) -cellen, genomische bibliotheekconstructie, sequencerbeheer en ten slotte het genereren van rapporten met kopieernummervarianten.

Terwijl het sequentieplan eindigt na het lopende proces op de machine, rapporteert het sequentieserversysteem de samenvatting met beschrijvende informatie over gegenereerde gegevens, chipstatus, laadsnelheid van ISP en bibliotheekkwaliteit, zoals weergegeven in figuur 2. In deze resultaten werden 17,6 G-gegevens in de totale basis verkregen en de totale belastingssnelheid van ISP was 88% in de totale putten van de chip; de heatmap liet zien dat het monster gelijkmatig was geladen op de total...

Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Het protocol presenteert de algemene procedures in het laboratorium die vereist zijn bij pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie op een op halfgeleiders gebaseerd sequencingplatform van de volgende generatie. Hier presenteren we de gedetailleerde stappen van volledige genoomversterking, DNA-fragmentselectie, bibliotheekconstructie, sjabloonvoorbereiding en sequencing-werkstroom met representatieve resultaten.

Pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie op een halfgeleidergebaseerd next-generation sequencingplatform

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Dit protocol presenteert de procedure van single cell amplification tot definitieve rapportagegegevens in de pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie op een halfgeleider gebaseerd next generation sequencing platform. Deze procedure kan kijkers helpen een goed begrip te krijgen van de experimentele workflow van PGT-A-sequencing en deze techniek te repliceren in een diagnostisch laboratorium met een op halfgeleiders gebaseerd NGS-platform. Begin met het pipetteren van 25 microliter van de hele genoomversterkingsproducten en breng ze over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter die vooraf is geladen met 25 microliter nucleasevrij water.Vortex en meng de DNA-zuiveringsparels. Aliquot 50 microliter van deze oplossing in elke monsterbuis. Vortex en centrifuge kort gedurende vijf seconden.Zet de buis gedurende vijf minuten op kamertemperatuur voor het DNA-bindingsproces. Plaats de centrifugebuis van 1,5 milliliter in een magnetisch rek. Wacht vervolgens tot alle magnetische kralen worden aangetrokken door de zijwand van de buis.Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter. Vermijd het pipetteren van de kralen. Volgens het oorspronkelijke monstervolume.Pipet 30 microliter magnetische kralen, vortex en centrifuge kort gedurende vijf seconden. Zet de buis gedurende vijf minuten op kamertemperatuur voor het DNA-bindingsproces. Plaats de centrifugebuizen van 1,5 millimeter in het magnetische rek.Wacht vervolgens tot alle magnetische kralen worden aangetrokken door de zijwand van de buis. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.Pipet 300 microliter 70% ethanol in de centrifugebuis van 1,5 milliliter. Draai de buis vervolgens twee keer voorzichtig in een hoek van 180 graden en beweeg de kralen langs de buiswand voor een grondige wasbeurt. Pipetteer en gooi het supernatant weg.Vermijd het pipetteren van de kralen. Herhaal de wasprocedure eenmaal. Plaats een nieuwe versterkingsplaat in het systeem zodra het reinigingsprogramma is voltooid.Plaats de opvangbuizen, elk voorgevuld met 150 microliter breekoplossing twee in de rotor en plaats de brug vervolgens op de opvangbuizen. Voeg de reactieolie toe aan de helft van de buis en de emulgatorbreekoplossing aan een derde van de buis. Plaats een nieuw filter voor sjabloonvoorbereiding op een buizenrek met het monsterportaal naar boven geplaatst.Vortex de oplossing gedurende vijf seconden en centrifugeer kort gedurende vijf seconden. Breng de oplossing vervolgens over in het monsterportaal van het filter na drie keer 800 microliter te hebben gepipetteerd. Centrifugeer de buis om de bubbels vóór de laatste injectie te verminderen.Vermijd het injecteren van lucht in het filter. Injecteer 200 microliter reactieolie twee, na de gemengde oplossing. Draai het monsterportaal van het filter naar beneden en vervang de wasaanpassing door het filter.Steek de monsternaald in het middelste gat van het rotordeksel en druk de naald vervolgens naar beneden. Klik op de knop Uitvoeren op het scherm en kies het programma op basis van de bijbehorende kit. Selecteer vervolgens Assisted om alle stappen te controleren.Klik op Volgende totdat de run is gestart. De run duurt ongeveer 4,5 uur. Selecteer Volgende wanneer het programma is voltooid.Het systeem start een centrifugatieproces van 10 minuten. Klik na het centrifugeren op de knop Deksel openen en verplaats de opvangbuizen naar rekken. Als de procedure niet binnen 15 minuten naar de volgende stap gaat, drukt u op de laatste spin om opnieuw te centrifugeren.Verwijder het supernatant in de opvangbuis en laat 100 microliter oplossing in de buis achter. Meng het resterende monster door pipetteer en breng het monster over naar de nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter met de aanduiding OT. Wanneer u het supernatant pipettert, vermijd dan het aanraken van de onderkant van de buis langs de zijkanten. Pipetteer 100 microliter nucleasevrij water in elke opvangbuis en breng de oplossing over naar de OT-buis gewassen door herhaaldelijk pipetteren.Voeg 600 microliter nucleasevrij water toe aan de OT-buis om het totale volume van één milliliter te vormen. Vortex gedurende 30 seconden in centrifuge op 15, 500 maal G gedurende acht minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en laat 100 microliter oplossing achter in de OT-buis.Gebruik de punt om de olielaag volledig weg te gooien. Voeg 900 microliter nucleasevrij water toe, vortex gedurende 30 seconden en centrifugeer op 15, 500 keer G gedurende acht minuten. Verwijder het supernatant totdat er 20 microliter van de oplossing overblijft en voeg de sjabloon resuspending-oplossing toe om het volume van 100 microliter te vormen.Vervolgens vortex gedurende 30 seconden en kort centrifugeren gedurende twee seconden. Ga verder met de volgende stap binnen 12 uur na monsterverwerking Laad 100 microliter van de verdunde bibliotheek, 130 microliter C1-kralen, 300 microliter drie x sjabloonwasoplossing en 300 microliter van de smeltoplossing op de acht putstrips. Installeer de acht putstrips op de verrijkingsmodule, laad de pipetteerpunt en zet de centrifugebuis van 200 microliter in de verzamelpositie.Klik op Start om het programma uit te voeren. Pipetteer 55 microliter van de monsteroplossing en injecteer deze in het monstergat van de chip. Plaats de chip op de centrifuge.Houd de inkeping naar buiten en het monsterportaal naar binnen. Balanceer het vervolgens met een andere gebruikte chip en centrifugeer gedurende 10 minuten. Bereid de laadoplossing voor zoals beschreven in het tekstmanuscript.Blaas 100 microliter lucht in de schuimoplossing. Pipetteer de oplossing herhaaldelijk totdat de bubbels zich in een dichte, schuimende toestand bevinden en houd het schuimvolume op ongeveer 250 microliter. Plaats de chip na de centrifuge op de bank.Injecteer 100 microliter schuim in het monstergat en verwijder de geëxtrudeerde oplossing in het buitenportaal. Centrifugeer de chip vervolgens kort gedurende 30 seconden. Herhaal dit proces één keer.Injecteer tweemaal 100 microliter met 50% wasbuffer en verwijder de geëxtrudeerde oplossing na elke injectie in het buitenportaal. Injecteer vervolgens driemaal 100 microliter met 50% gloeibuffer en verwijder de geëxtrudeerde oplossing na elke injectie in het buitenportaal. Injecteer 65 microliter op 50% enzymreactiebuffer, vermijd bubbels en verwijder de geëxtrudeerde oplossing in het buitenportaal.Stabiliseer de geladen chip gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en installeer de chip op het sequencerchipportaal. Kies het geplande programma controleer de informatie en start de run. De representatieve run verkreeg in totaal 17,6 gigabyte gegevens en de totale belastingssnelheid van het ionenboldeeltje was 88% in de totale putten van de chip.De heatmap bevestigde een gelijkmatige monsterbelasting op het totale chipoppervlak. 77% van de totale reads waren bruikbaar. Alle putten geladen met ISP vertoonden 100% sjablonenverrijking waarin 78% klonaal was.Van alle klonale sjablonen werd 97% gekwalificeerd als de uiteindelijke bibliotheek. De gemiddelde lengte van de aflezing was 177 basenparen, terwijl de mediaan en modus respectievelijk 176 en 174 basenparen waren. Piektellingen van thymine, cytosine en adenine in de sjablonen waren ongeveer 76 over de gekwalificeerde cutoff-lijn van 50.In alle adresseerbare putten met live ISP's kwalificeerde 99,5% zich als de geconstrueerde bibliotheek en 20% van de polyklonale en lage kwaliteit bibliotheken werden uitgefilterd, terwijl 76,6% van de ISP's gekwalificeerd was voor verdere analyse. Het resultaat van de afwijking van het aantal kopieën van een enkel monster toonde een 182,16 megabase paren mozaïek trisomie van P 16,3 tot Q 35,2 op chromosoom vier en een 33 punts 13 megabase paren monosomie segment van Q 11,1 tot Q 13,33 op chromosoom 22. Bij het selecteren van fragmenten moeten de tijdsintervallen tussen de stappen worden aangepast aan de grootte van de monsters in dezelfde batch om over- en uitval van blootstelling voor voor- en achterkantmonsters te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimalisatie en Vergelijkende Analyse van Plant Organellaire DNA Verrijkingsmethoden Geschikt voor Volgend Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Next-generation Sequencing en Bioinformatics pijpleiding om te evalueren van genetische determinanten van constitutionele ziekte gericht

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetische manipulatie van Dictyostelium discoideum cellen op basis van de selectie en de groei van bacteriën

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halfgeleider sequencing voor pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massa spectrometrie gebaseerde Proteomics Analyses met behulp van de OpenProt Database te onthullen nieuwe eiwitten vertaald uit niet-canonieke Open lezing Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

De volgende-generatie van RNA het rangschikken en een bioinformatica pijpleiding om uitgedrukte lijn-1S op het Locus-specific niveau te identificeren

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...