Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Wir möchten Dr. Zhangyong Ming und Herrn Rongji Hou für ihre Beratung zur erweiterten Anwendung von LIMS danken. Diese Studie wird von PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) und Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034) unterstützt.

Alle Protokolle und die Trophektoderm (TE) Biopsie (Abschnitt 1.1.1.1), die in dieser Studie angewendet wurden, wurden am 18. September 2017 von der Ethikkommission für Humanforschung des Krankenhauses Nr. 924 überprüft und genehmigt (NO: PLA924-2017-59). Die Patienten/Teilnehmer gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an dieser Studie.
1. DNA-Isolierung aus menschlicher Embryobiopsie und ganzgenomischer Amplifikation
<ol><li>Protokoll für die Amp...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. 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Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. 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Die chromosomale Aneuploidie von Embryonen ist die Ursache für einen großen Teil des Schwangerschaftsverlustes, unabhängig davon, ob es sich um eine natürliche Empfängnis oder eine In-vitro-Fertilisation (IVF) handelt. In der klinischen Praxis der IVF wird vorgeschlagen, dass das Screening der Embryo-Aneuploidie und der Transfer des Euploidie-Embryos das Ergebnis der IVF verbessern könnte. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ist die früheste Technik für die Geschlechtsselektion und PGT-A; Die...

Aneuploidie ist die Anomalie in der Anzahl der Chromosomen durch das Vorhandensein eines oder mehrerer zusätzlicher Chromosomen oder das Fehlen eines oder mehrerer Chromosomen. Embryonen, die eine Art von Aneuploidie tragen, wie den Verlust eines X-Chromosoms (Turner-Syndrom), zusätzliche Kopien von Autosomen, wie Trisomien von Autosom 21 (Down-Syndrom), 13 (Patau-Syndrom) und 18 (Edwards-Syndrom), oder zusätzliche Geschlechtschromosomen wie 47, XXY (Klinefelter-Syndrom) und 47, XXX (Triple-X-Syndrom), können mit Geburtsfehlern1 überleben. Aneuploidie ist die Hauptursache für Fehlgeburten im ersten Trimester und Versagen der In-vitro-Fertilisation (IVF)2. Es wird berichtet, dass die Aneuploidierate zwischen 25,4% und 84,5% durch die verschiedenen Altersschichten des natürlichen Zyklus und der medizinischen Kontrollgruppe in IVF-Praxis3 liegen könnte.
Die Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation wird bei der klinischen Bestimmung genetischer Informationen immer häufiger eingesetzt. Es bietet einen praktischen Zugang zur Genomsequenz mit Effizienz und hohem Durchsatz. Insbesondere revolutionierte die Next-Generation-Sequenzierung auch die Diagnose von Störungen mit genetischen Faktoren und Tests auf Anomalien im Genom4. Unter Verwendung der Halbleitersequenzierungstechnologie zur direkten Übertragung chemischer Signale bei der Sequenzierung von Bioreaktionen in digitale Daten bietet das halbleiterbasierte Sequenzsystem eine direkte Echtzeit-Detektion von Sequenzdaten in 3-7 h 5,6.
In einem IVF-Verfahren untersucht die Präimplantationsdiagnostik (PGT) das genetische Profil des Embryos, bevor er in die Gebärmutter übertragen wird, um das IVF-Ergebnis zu verbessern und das Risiko genetischer Störungen bei Neugeborenen zu verringern 1,7. Bei der PGT in Kombination mit NGS-Techniken wird genetisches Material, das aus weniger als 10 Zellen extrahiert wurde, mit ganzen Genomamplifikationskits oder einem unabhängig entwickelten gesamten Genomamplifikationsreagenz amplifiziert. Dies erfordert nur einen Schritt in der Amplifikationsphase und erfordert keine Voramplifikation, um Amplifikationsprodukte für das gesamte Genom zu erhalten. Primer oder Panels für Kopienzahlvarianten und spezielle Genloci Sequenzierung werden entworfen und in der konstruierten Bibliothek angewendet.
Ein typischer Arbeitsablauf der Präimplantations-Gentest-Aneuploidie (PGT-A) bei NGS umfasst serielle Eingriffe und erfordert eine intensive Arbeitsbelastung des Laborpersonals8. Einige Fehlbedienungen, die zu einem Rollback des Verfahrens führen, können zu einem unerwünschten Verlust von Zeit und Ressourcen des Labors führen. Eine prägnante und klare Standardarbeitsanweisung (SOP) für den PGS-NGS-Workflow ist hilfreich. Protokolle im Word-Format können jedoch keine detaillierteren Informationen zur Probenverarbeitung, Gerätemanipulation und Geräteeinstellungen enthalten, die in einem Videoprotokoll visualisiert werden können. In diesem Artikel könnte ein validierter Workflow in Kombination mit einer visualisierten Demonstration von Betriebsdetails direktere und intuitivere Referenzprotokolle in der PGT-Praxis auf einer Halbleitersequenzierungsplattform bieten.
Das Protokoll beschreibt hier eine Methode, die die parallele Batches von bis zu 16 Embryobiopsien unterstützt. Für größere Chargen wird empfohlen, ein kommerzielles Kit-basiertes Protokoll für die Halbleitersequenzierung wie Reproes-PGS zu verwenden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

Die Next-Generation-Sequenzierung hat in der klinischen Anwendung bei der Bestimmung genetischer Varianten zunehmend an Bedeutung gewonnen. Im Präimplantations-Gentest hat diese Technik ihre einzigartigen Vorteile in Bezug auf Skalierbarkeit, Durchsatz und Kosten. Für den Präimplantations-Gentest für die Aneuploidie-Analyse bietet das hier vorgestellte halbleiterbasierte Next-Generation-Sequencing-System (NGS) einen umfassenden Ansatz zur Bestimmung struktureller genetischer Varianten mit einer Mindestauflösung von 8 Mb. Von der Probenaufnahme bis zum Abschlussbericht erfordert der Arbeitsprozess mehrere Schritte unter strikter Einhaltung der Protokolle. Da verschiedene kritische Schritte das Ergebnis der Verstärkung, die Qualität der Bibliothek, die Abdeckung der Lesevorgänge und die Ausgabe von Daten bestimmen könnten, könnten beschreibende Informationen mit visueller Demonstration außer Wörtern mehr Details zur Bedienung und Manipulation bieten, was einen großen Einfluss auf die Ergebnisse aller kritischen Schritte haben kann. Die hier vorgestellten Methoden zeigen die Verfahren, die an der gesamten Genomamplifikation (WGA) von biopsierten Trophektodermzellen (TE), der genomischen Bibliothekskonstruktion, dem Sequenzermanagement und schließlich der Erstellung von Berichten über Kopienzahlvarianten beteiligt sind.

Wenn der Sequenzplan nach dem laufenden Prozess in der Maschine abgeschlossen ist, meldet das Sequenzserversystem die Zusammenfassung mit beschreibenden Informationen zu generierten Daten, Chipstatus, ISP-Laderate und Bibliotheksqualität, wie in Abbildung 2 dargestellt. In dieser Ergebnisdemonstration wurden 17,6 G-Daten in der Gesamtbasis erhalten, und die Gesamtladerate von ISP betrug 88% in den Gesamtwells des Chips; Die Heatmap zeigte, dass die Probe gleichmäßig auf die Gesamtfläche ...

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Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Das Protokoll stellt die gesamten Laborverfahren dar, die für Präimplantations-Gentests auf Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform erforderlich sind. Hier präsentieren wir die detaillierten Schritte der Amplifikation des gesamten Genoms, der DNA-Fragmentauswahl, des Bibliotheksaufbaus, der Template-Vorbereitung und des Sequenzierungs-Arbeitsablaufs mit repräsentativen Ergebnissen.

Präimplantations-Gentests für Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Dieses Protokoll stellt das Verfahren von der Einzelzellamplifikation bis hin zu den endgültigen Berichtsdaten in der Präimplantationsdiagnostik auf Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Sequenzierungsplattform der nächsten Generation dar. Dieses Verfahren kann den Zuschauern helfen, den experimentellen Workflow der PGT-A-Sequenzierung gut zu verstehen und diese Technik in einem diagnostischen Labor mit einer halbleiterbasierten NGS-Plattform zu replizieren. Beginnen Sie damit, 25 Mikroliter der gesamten Genomamplifikationsprodukte zu pipettieren und sie in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu überführen, das mit 25 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser vorgeladen ist.Wirbeln und mischen Sie die DNA-Reinigungsperlen. Aliquot 50 Mikroliter dieser Lösung in jedes Probenröhrchen. Vortex und Zentrifuge kurz für fünf Sekunden.Stellen Sie das Röhrchen für fünf Minuten bei Raumtemperatur für den DNA-Bindungsprozess ein. Führen Sie das 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen in ein Magnetgestell ein. Warten Sie dann, bis alle magnetischen Perlen von der Seitenwand der Röhre angezogen werden.Den Überstand vorsichtig in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Vermeiden Sie es, die Perlen auszupipettieren. Entsprechend dem ursprünglichen Probenvolumen.Pipette 30 Mikroliter Magnetkügelchen, Wirbel und Zentrifuge kurz für fünf Sekunden. Stellen Sie das Röhrchen für fünf Minuten bei Raumtemperatur für den DNA-Bindungsprozess ein. Führen Sie die 1,5-Millimeter-Zentrifugenröhrchen in das Magnetgestell ein.Warten Sie dann, bis alle magnetischen Perlen von der Seitenwand der Röhre angezogen werden. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren.Pipettieren Sie 300 Mikroliter 70% Ethanol in das 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr. Drehen Sie das Rohr dann vorsichtig zweimal in einem 180-Grad-Winkel und bewegen Sie die Perlen entlang der Rohrwand für eine gründliche Wäsche. Pipettieren und entsorgen Sie den Überstand.Vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren. Wiederholen Sie den Waschvorgang einmal. Setzen Sie eine neue Verstärkungsplatte in das System ein, sobald das saubere Programm abgeschlossen ist.Führen Sie die mit jeweils 150 Mikrolitern vorgefüllten Sammelröhrchen Bruchlösung zwei in den Rotor ein und legen Sie dann die Brücke auf die Sammelrohre. Das Reaktionsöl in die Hälfte des Röhrchens und die Emulgatorbruchlösung in ein Drittel des Röhrchens geben. Platzieren Sie einen neuen Filter für die Schablonenvorbereitung auf einem Rohrgestell mit dem Probenportal nach oben.Fünf Sekunden lang die Lösung durchwirbeln und fünf Sekunden lang kurz zentrifugieren. Anschließend wird die Lösung nach dreimaligem Pipettieren von 800 Mikrolitern in das Probenportal des Filters überführt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen, um Blasen vor der letzten Injektion zu verringern.Vermeiden Sie es, Luft in den Filter einzublasen. Injizieren Sie 200 Mikroliter Reaktionsöl zwei, nach der gemischten Lösung. Drehen Sie das Probenportal des Filters nach unten und ersetzen Sie die Waschanlage durch den Filter.Führen Sie die Probennadel in das mittlere Loch des Rotordeckels ein und drücken Sie die Nadel dann auf den Boden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen auf dem Bildschirm und wählen Sie das Programm entsprechend dem entsprechenden Kit aus. Wählen Sie dann Unterstützt, um alle Schritte zu überprüfen.Klicken Sie auf Weiter, bis der Lauf gestartet ist. Der Lauf dauert ca. 4,5 Stunden. Wählen Sie Weiter, wenn das Programm beendet ist.Das System startet einen 10-minütigen Zentrifugationsprozess. Klicken Sie nach der Zentrifugation auf die Schaltfläche Deckel öffnen und verschieben Sie die Sammelröhrchen in die Regale. Wenn der Vorgang nicht innerhalb von 15 Minuten zum nächsten Schritt übergeht, drücken Sie auf die letzte Drehung, um die Zentrifuge erneut zu zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand im Sammelröhrchen und lassen Sie 100 Mikroliter Lösung im Röhrchen. Mischen Sie die verbleibende Probe durch Pipettieren und überführen Sie die Probe in das neue 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung OT. Vermeiden Sie beim Pipettieren des Überstandes, den Boden des Röhrchens an den Seiten zu berühren. Pipettieren Sie 100 Mikroliter nukleasefreies Wasser in jedes Sammelröhrchen und geben Sie die Lösung durch wiederholtes Pipettieren in das OT-Röhrchen, das gewaschen wird.Fügen Sie 600 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die OT-Röhre hinzu, um das Gesamtvolumen von einem Milliliter zu erhalten. Wirbel für 30 Sekunden in Zentrifuge bei 15, 500 mal G für acht Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und lassen Sie 100 Mikroliter Lösung im OT-Röhrchen zurück.Verwenden Sie die Spitze, um die Ölschicht vollständig zu entsorgen. Fügen Sie 900 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, wirbeln Sie für 30 Sekunden und zentrifugieren Sie bei 15, 500 mal G für acht Minuten. Entfernen Sie den Überstand, bis 20 Mikroliter der Lösung übrig sind, und fügen Sie die Schablonenlösung hinzu, um das Volumen von 100 Mikrolitern zu erhalten.Dann 30 Sekunden lang vortex und zwei Sekunden lang kurz zentrifugieren. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt innerhalb von 12 Stunden nach der Probenverarbeitung fort Laden Sie 100 Mikroliter der verdünnten Bibliothek, 130 Mikroliter C1-Perlen, 300 Mikroliter drei x Schablonenwaschlösung und 300 Mikroliter der Abschmelzlösung in die acht Vertiefungsstreifen. Installieren Sie die acht Well-Streifen auf dem Anreicherungsmodul, laden Sie die Pipettierspitze und stellen Sie das 200-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen in die Sammelposition.Klicken Sie auf Start, um das Programm auszuführen. Pipettieren Sie 55 Mikroliter der Probenlösung und injizieren Sie sie in das Probenloch des Chips. Setzen Sie den Chip auf die Zentrifuge.Halten Sie die Kerbe nach außen und das Probenportal nach innen. Dann balancieren Sie es mit einem anderen gebrauchten Chip aus und zentrifugieren Sie es für 10 Minuten. Bereiten Sie die Ladelösung wie im Textmanuskript beschrieben vor.Blasen Sie 100 Mikroliter Luft in die Schaumlösung. Pipettieren Sie die Lösung wiederholt, bis die Blasen in einem dichten, schäumenden Zustand sind, und halten Sie das Schaumvolumen auf etwa 250 Mikroliter. Legen Sie den Chip nach der Zentrifuge auf die Bank.Injizieren Sie 100 Mikroliter Schaum in das Probenloch und entfernen Sie die extrudierte Lösung in das Ausgangsportal. Dann zentrifugieren Sie den Chip kurz für 30 Sekunden. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal.Injizieren Sie zweimal 100 Mikroliter bei 50% Waschpuffer und entfernen Sie die extrudierte Lösung nach jeder Injektion in das Ausgangsportal. Dann injizieren Sie dreimal 100 Mikroliter bei 50% Glühpuffer und entfernen Sie die extrudierte Lösung nach jeder Injektion in das Ausgangsportal. Injizieren Sie 65 Mikroliter bei 50% Enzymreaktionspuffer, vermeiden Sie Blasen und entfernen Sie die extrudierte Lösung im Außenportal.Stabilisieren Sie den geladenen Chip fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und installieren Sie den Chip auf dem Sequenzer-Chipportal. Wählen Sie das Programm Geplant, überprüfen Sie die Informationen und starten Sie den Lauf. Der repräsentative Lauf erhielt insgesamt 17,6 Gigabyte Daten und die Gesamtladerate des Ionenkugelpartikels betrug 88% in den Gesamttöpfen des Chips.Die Heatmap bestätigte sogar die Probenbeladung auf der gesamten Chipfläche. 77% der gesamten Lesevorgänge waren verwendbar. Alle mit ISP beladenen Wells zeigten eine Anreicherung von 100%Vorlagen, wobei 78% klonal waren.Von allen klonalen Vorlagen wurden 97% als endgültige Bibliothek qualifiziert. Die durchschnittliche Länge des Lesevorgangs betrug 177 Basenpaare, während der Median und der Modus 176 bzw. 174 Basenpaare betrugen. Die Spitzenwerte von Thymin, Cytosin und Adenin in den Vorlagen lagen etwa 76 über der qualifizierten Cutoff-Linie von 50.In allen adressierbaren Wells mit Live-ISPs wurden 99,5% als konstruierte Bibliothek qualifiziert und 20% der polyklonalen und minderwertigen Bibliotheken herausgefiltert, während 76,6% der ISPs für weitere Analysen qualifiziert waren. Das Ergebnis der Kopienzahlvarianz aus einer einzelnen Probe zeigte eine 182,16 Megabasenpaare Mosaiktrisomie von P 16,3 bis Q 35,2 auf Chromosom vier und ein 33 Punkt 13 Megabasenpaare Monosomiesegment von Q 11,1 bis Q 13,33 auf Chromosom 22. Bei der Fragmentauswahl sollten die Zeitintervalle zwischen den Schritten entsprechend der Größe der Proben in derselben Charge geändert werden, um eine Über- und Nichtbelichtung für Front- und Heckproben zu vermeiden.

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Forschung

Genetik

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation und Bioinformatik-Pipeline, um genetische Determinanten der konstitutionelle Krankheit zu bewerten

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Gentechnische Veränderung von Dictyostelium Discoideum Zellen basierend auf Auswahl und das Wachstum von Bakterien

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halbleitersequenzierung für Präimplantationsgenetische Tests für Aneuploidie

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen mithilfe der OpenProt-Datenbank zu enthüllen neue Proteine übersetzt aus dem nicht-kanonischen Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA Next-Generation-Sequenzierung und eine Bioinformatik-Pipeline zur Identifizierung von ausgedrückten LINE-1s auf der Locus-spezifischen Ebene

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...