Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר ג'אנגיונג מינג ולמר רונגג'י הו על עצתם בנוגע ליישום מורחב של LIMS. מחקר זה נתמך על ידי פרויקטי מחקר מיוחדים של PLA לתכנון המשפחה (17JS008, 20JSZ08), קרן מעבדת המפתח של גואנגשי לחקר מחלות מטבוליות (מס '20-065-76), ופרויקט מחקר המדע והטכנולוגיה של בריאות האזרחים בגואנגג'ואו (201803010034).

כל הפרוטוקולים והביופסיה של trophectoderm (TE) (סעיף 1.1.1.1) שיושמו במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בבני אדם של בית החולים מס '924 ב -18 בספטמבר 2017 (NO: PLA924-2017-59). המטופלים/המשתתפים מסרו את הסכמתם מדעת בכתב להשתתף במחקר זה.
1. בידוד DNA מביופסיה של עובר אנושי והגברה גנומית שלמה<...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+aneuploidy+rates+are+equivalent+in+natural+cycles+and+gonadotropin-stimulated+cycles.">Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles.</a> Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).</li><li>Adams, D. R., Eng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+to+diagnose+suspected+genetic+disorders.">Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).</li><li>Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+ion+torrent+semiconductor+chip+based+sequencing.">Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing.</a> Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).</li><li>Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+techniques:+Implications+for+clinical+prenatal+diagnosis.">Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis.</a> Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).</li><li>Dilliott, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+next-generation+sequencing+and+bioinformatics+pipeline+to+evaluate+genetic+determinants+of+constitutional+disease.">Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).</li><li>Ion ReproSeq&#8482; PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf</a> (2017)</li><li>PicoPLEX&#174; Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf">https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf</a> (2019)</li><li>. Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html">https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html</a> (2017)</li><li>Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Bayesian+inference+of+copy+number+variants+using+Hidden+Markov+models+with+wavelet+compression.">Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression.</a> PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).</li><li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+using+fluorescence+in+situ+hybridization+in+patients+with+repetitive+implantation+failure+and+advanced+maternal+age:+two+randomized+trials.">Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).</li><li>Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+screening+(PGS)+still+in+search+of+a+clinical+application:+a+systematic+review.">Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).</li><li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+pre-implantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations.">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li><li>Handyside, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=24-chromosome+copy+number+analysis:+a+comparison+of+available+technologies.">24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).</li><li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation.">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li><li>El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequence+assembly:+Four+stages+of+data+processing+and+computational+challenges.">Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges.</a> PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).</li><li>Jennings, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+validation+of+next-generation+sequencing-based+oncology+panels:+A+joint+consensus+recommendation+of+the+Association+for+Molecular+Pathology+and+College+of+American+Pathologists.">Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).</li><li>de Bourcy, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+comparison+of+single-cell+whole+genome+amplification+methods.">A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods.</a> PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).</li><li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+pre-implantation+genetic+screening+cycles.">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li><li>Damerla, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Torrent+sequencing+for+conducting+genome-wide+scans+for+mutation+mapping+analysis.">Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis.</a> Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).</li><li>Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+testing+for+aneuploidy:+what+technology+should+you+use+and+what+are+the+differences.">Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+improving+access+to+variant+interpretations+and+supporting+evidence.">ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence.</a> Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).</li><li>Genomes Project, C, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+reference+for+human+genetic+variation.">A global reference for human genetic variation.</a> Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).</li><li>McKusick, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+in+man+and+its+online+version,+OMIM.">Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM.</a> American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).</li><li>Zhao, M., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNVannotator:+A+comprehensive+annotation+server+for+copy+number+variation+in+the+human+genome.">CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome.</a> PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+next-generation+sequencing+in+pre-implantation+genetic+diagnosis+cycles+for+Robertsonian+and+reciprocal+translocations.">Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+allele+with+resolved+carrier+status+of+Robertsonian+and+reciprocal+translocation+in+human+pre-implantation+embryos.">Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).</li></ol>

אנופלואידיה כרומוזומלית של עוברים היא הגורם לחלק גדול מאובדן ההריון, בין אם הגה באופן טבעי או הפריה חוץ גופית (IVF). בפרקטיקה הקלינית של הפריה חוץ גופית, מוצע כי סינון האנאופלואידיה של העובר והחזרת העובר האופלואידי יכול לשפר את התוצאה של הפריה חוץ גופית. הכלאה פלואורסצנטית באתרה ה?...

Aneuploidy היא חריגה במספר הכרומוזומים על ידי נוכחות של כרומוזום אחד או יותר או היעדר כרומוזום אחד או יותר. עוברים הנושאים סוג כלשהו של אנאופלואידיה, כגון אובדן של כרומוזום X אחד (תסמונת טרנר), עותקים נוספים של אוטוזומים, כמו טריזומיות של אוטוזום 21 (תסמונת דאון), 13 (תסמונת פטאו) ו-18 (תסמונת אדוארדס), או כרומוזומי מין נוספים כגון 47, XXY (תסמונת קליינפלטר) ו-47, XXX (תסמונת טריפל X), יכולים לשרוד עד לתקופה עם מומים מולדים1. Aneuploidy הוא הגורם העיקרי להפלות בשליש הראשון ולכישלון הפריה חוץ גופית (IVF)2. הוא דיווח כי שיעור aneuploidy יכול לנוע בין 25.4%-84.5% דרך שכבות הגיל השונות של מחזור טבעי וקבוצת ביקורת תרופתית בפועלIVF 3.
טכנולוגיית הריצוף של הדור הבא מיושמת בפראות בקביעת מידע גנטי מבחינה קלינית; הוא מספק גישה מעשית לרצף הגנום ביעילות ובתפוקה גבוהה. במיוחד, ריצוף הדור הבא גם חולל מהפכה באבחון הפרעות עם גורמים גנטיים ובדיקות לחריגות בגנום4. באמצעות טכנולוגיית ריצוף מוליכים למחצה להעברה ישירה של אותות כימיים בריצוף תגובה ביולוגית לנתונים דיגיטליים, מערכת הרצף מבוססת המוליכים למחצה מספקת זיהוי ישיר בזמן אמת לנתוני רצף תוך 3-7 שעות 5,6.
בהליך הפריה חוץ גופית, בדיקה גנטית טרום השרשה (PGT) בוחנת את הפרופיל הגנטי של העובר לפני שהוא מועבר לרחם כדי לשפר את תוצאת ההפריה החוץ גופית ולהפחית את הסיכון להפרעות גנטיות בתינוקות 1,7. ב-PGT בשילוב עם טכניקות NGS, חומר גנטי המופק מפחות מ-10 תאים מוגבר באמצעות ערכות הגברה של גנום שלם או ריאגנט להגברת גנום שלם שפותח באופן עצמאי. זה דורש רק שלב אחד בשלב ההגברה ואינו דורש קדם-הגברה, כדי לקבל תוצרי הגברה של גנום שלם. פריימרים או לוחות עבור וריאנט מספר עותק וריצוף מיוחד של לוקי גנים מתוכננים ומיושמים בספרייה שנבנתה.
תהליך עבודה טיפוסי של בדיקות גנטיות טרום השרשה-אנופלואידיה (PGT-A) ב- NGS כרוך בהליכים סדרתיים, ודורש עומס עבודה אינטנסיבי של אנשי מעבדה8. פעולה שגויה מסוימת הנגרמת להחזרת הליכים עלולה להוביל לאובדן לא רצוי של זמן ומשאבים של המעבדה. נוהל הפעלה סטנדרטי תמציתי וברור (SOP) עבור זרימת עבודה של PGS-NGS מועיל; עם זאת, פרוטוקולים בתבנית תמלילים אינם יכולים להציג מידע מפורט יותר על עיבוד לדוגמה, מניפולציה של מכשירים והגדרות מכשירים, שניתן להמחיש בפרוטוקול וידאו. במאמר זה, זרימת עבודה מאומתת בשילוב עם הדגמה חזותית של פרטי הפעלה יכולה להציע פרוטוקולי הפניה ישירים ואינטואיטיביים יותר בתרגול PGT בפלטפורמת רצף מוליכים למחצה.
הפרוטוקול כאן מתאר שיטה התומכת באצווה של עד 16 ביופסיות עוברים במקביל. עבור אצוות גדולות יותר, מומלץ להשתמש בפרוטוקול מסחרי מבוסס ערכה לריצוף מוליכים למחצה, כגון Reproes-PGS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

ריצוף הדור הבא זכה לחשיבות גוברת ביישום הקליני בקביעת וריאנטים גנטיים. בבדיקה הגנטית שלפני ההשתלה, לטכניקה זו יש יתרונות ייחודיים במדרגיות, בתפוקה ובעלות. עבור הבדיקה הגנטית טרום השרשה לניתוח אנאופלואידיה, מערכת ריצוף הדור הבא (NGS) המבוססת על מוליכים למחצה המוצגת כאן מספקת גישה מקיפה לקביעת וריאנטים גנטיים מבניים ברזולוציה מינימלית של 8 Mb. מרכישת המדגם ועד לדוח הסופי, תהליך העבודה דורש שלבים מרובים תוך הקפדה על פרוטוקולים. מכיוון שצעדים קריטיים שונים יכולים לקבוע את תוצאת ההגברה, איכות הספרייה, כיסוי הקריאות ופלט הנתונים, מידע תיאורי עם הדגמה חזותית שאינה מילים יכול להציע פרטים נוספים לפעולה ולמניפולציה, מה שעשוי להשפיע רבות על התוצאות של כל השלבים הקריטיים. השיטות המוצגות כאן יציגו את ההליכים המעורבים בהגברה גנומית שלמה (WGA) של תאי Trophectoderm (TE) בביופסיה, בניית ספרייה גנומית, ניהול רצפים, ולבסוף, הפקת דוחות של מספרי עותקים.

כאשר תוכנית הרצפים מסתיימת לאחר תהליך הריצה במכונה, מערכת שרת הרצפים מדווחת על הסיכום עם מידע תיאורי של נתונים שנוצרו, מצב שבב, קצב טעינה של ספק שירותי אינטרנט ואיכות הספרייה, כפי שמוצג באיור 2. בהדגמת תוצאות זו התקבלו 17.6 G נתונים בבסיס הכולל, ושיעור הטעינה הכולל של ISP היה 88% ב...

Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

הפרוטוקול מציג את ההליכים הכוללים במעבדה הנדרשים בבדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא. כאן אנו מציגים את השלבים המפורטים של הגברה גנומית שלמה, בחירת מקטעי DNA, בניית ספרייה, הכנת תבניות וזרימת עבודה של ריצוף עם תוצאות מייצגות.

בדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

פרוטוקול זה מציג את ההליך מהגברה של תאים בודדים ועד לנתוני דיווח סופיים בבדיקות הגנטיות שלפני ההשרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא. הליך זה יכול לעזור לצופים להבין היטב את זרימת העבודה הניסיונית של ריצוף PGT-A ולשכפל טכניקה זו במעבדת אבחון עם פלטפורמת NGS מבוססת מוליכים למחצה. התחילו בצינורות של 25 מיקרוליטרים של כל תוצרי ההגברה של הגנום והעברתם לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר הטעון מראש ב-25 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז.מערבבים ומערבבים את חרוזי טיהור הדנ"א. Aliquot 50 microliters של פתרון זה לתוך כל צינור דגימה. מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר למשך חמש שניות.מכוונים את הצינור למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לתהליך קשירת הדנ"א. הכנס את צינור הצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לתוך מתלה מגנטי. לאחר מכן, המתן עד שכל החרוזים המגנטיים יימשכו לקיר הצדדי של הצינור.העבר בזהירות את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. הימנעו מלהוציא את החרוזים. על פי נפח המדגם המקורי.פיפטה 30 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים, מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר במשך חמש שניות. מכוונים את הצינור למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לתהליך קשירת הדנ"א. הכנס את צינורות הצנטריפוגה בקוטר 1.5 מ"מ לתוך המדף המגנטי.לאחר מכן, המתן עד שכל החרוזים המגנטיים יימשכו לקיר הצדדי של הצינור. הסר בזהירות והשלך את הסופרנטנט. הימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה.פיפטה 300 מיקרוליטר של 70% אתנול לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר מכן סובבו בעדינות את הצינור פעמיים בזווית של 180 מעלות והזיזו את החרוזים לאורך דופן הצינור לשטיפה יסודית. פיפטה והשליכו את הסופרנטנט.הימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה. יש לחזור על הליך הכביסה פעם אחת. הניחו צלחת הגברה חדשה במערכת לאחר השלמת התוכנית הנקייה.הכנס את צינורות האיסוף, שכל אחד מהם ממולא מראש ב -150 מיקרוליטרים שוברים את תמיסה שתיים לתוך הרוטור, ולאחר מכן הנח את הגשר על צינורות האיסוף. מוסיפים את שמן התגובה למחצית הצינור ואת תמיסת שבירת המתחלב לשליש מהצינור. מקם מסנן חדש להכנת תבנית במדף צינורות כאשר פורטל הדוגמאות ממוקם כלפי מעלה.מערבבים את התמיסה במשך חמש שניות וצנטריפוגה לזמן קצר במשך חמש שניות. לאחר מכן להעביר את הפתרון לתוך פורטל המדגם של המסנן לאחר pipetting 800 microliters שלוש פעמים. צנטריפוגה את הצינור כדי להקטין בועות לפני ההזרקה האחרונה.הימנעו מהזרקת אוויר למסנן. הזריקו 200 מיקרוליטרים של שמן תגובה שניים, בעקבות התמיסה המעורבת. סובב את פורטל הדגימה של המסנן כלפי מטה והחלף את התאמת הכביסה במסנן.הכנס את מחט הדגימה לחור המרכזי של מכסה הרוטור ולאחר מכן לחץ על המחט לתחתית. לחץ על כפתור ההפעלה על המסך ובחר את התוכנית בהתאם לערכה המתאימה. לאחר מכן בחר סיוע כדי לבדוק את כל השלבים.לחץ על הבא עד תחילת הריצה. הריצה תארך כ-4.5 שעות. בחר הבא בסיום התוכנית.המערכת תתחיל בתהליך צנטריפוגה של 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, לחץ על הלחצן פתח מכסה והזז את צינורות האיסוף למדפים. אם ההליך אינו עובר לשלב הבא תוך 15 דקות, לחץ על הסיבוב הסופי כדי לבצע צנטריפוגה מחדש.הסר את supernatant בצינור האיסוף, משאיר 100 microliters של תמיסה בצינור. מערבבים את הדגימה הנותרת על ידי פיפטינג ומעבירים את הדגימה לצינור הצנטריפוגה החדש של 1.5 מיליליטר המסומן OT. בעת צנרת הסופר-נטנט, הימנעו מלגעת בתחתית הצינור לאורך הצדדים. Pipette 100 microliters של מים ללא נוקלאז לתוך כל צינור איסוף ולהעביר את התמיסה לצינור OT שטף על ידי pipetting חוזר.הוסף 600 מיקרוליטרים של מים ללא נוקלאז לצינור OT כדי לפצות על הנפח הכולל של מיליליטר אחד. מערבולת במשך 30 שניות בצנטריפוגה ב 15, 500 פעמים G במשך שמונה דקות. הסר בעדינות את supernatant משאיר 100 microliters של תמיסה בצינור OT.השתמשו בקצה כדי להשליך את שכבת השמן לחלוטין. הוסף 900 מיקרוליטרים של מים ללא נוקלאז, מערבולת במשך 30 שניות וצנטריפוגה ב 15, 500 פעמים G במשך שמונה דקות. הסר את הסופר-נאטנט עד שיישארו 20 מיקרוליטרים של התמיסה והוסף את פתרון ההחייאה של התבנית כדי להשלים את הנפח של 100 מיקרוליטר.לאחר מכן מערבלים במשך 30 שניות וצנטריפוגה קצרה במשך שתי שניות. המשך לשלב הבא תוך 12 שעות מעיבוד הדגימה טען 100 מיקרוליטרים של הספרייה המדוללת, 130 מיקרוליטרים של חרוזי C1, 300 מיקרוליטרים של שלושה x תמיסת שטיפת תבנית, ו -300 מיקרוליטרים של תמיסת ההמסה לשמונה רצועות הבאר. התקן את שמונה רצועות הבאר על מודול ההעשרה, טען את קצה הפיפטינג וקבע את צינור הצנטריפוגה של 200 מיקרוליטר במצב האיסוף.לחץ על התחל כדי להפעיל את התוכנית. Pipette 55 microliters של פתרון המדגם ולהזריק אותו לתוך חור הדגימה של השבב. הגדר את השבב על הצנטריפוגה.שמור את החריץ כלפי חוץ ואת פורטל המדגם בפנים. לאחר מכן, לאזן אותו עם שבב משומש אחר צנטריפוגה במשך 10 דקות. הכן את פתרון הטעינה כמתואר בכתב היד של הטקסט.לפוצץ 100 מיקרוליטר של אוויר לתוך פתרון מקציף. צמצמו את התמיסה שוב ושוב עד שהבועות נמצאות במצב צפוף ומקציף ושמרו על נפח הקצף לכ-250 מיקרוליטרים. מניחים את השבב על הספסל לאחר צנטריפוגה.הזריקו 100 מיקרוליטרים של קצף לתוך חור הדגימה והסירו את התמיסה המובלטת לפורטל החוצה. לאחר מכן, צנטריפוגה השבב לזמן קצר במשך 30 שניות. חזור על תהליך זה פעם אחת.הזריקו 100 מיקרוליטרים ב-50% שטיפה פעמיים והסירו את התמיסה המובלטת בשער החיצוני לאחר כל הזרקה. לאחר מכן הזריקו 100 מיקרוליטרים ב-50% חישול שלוש פעמים והסירו את התמיסה המובלטת בשער החיצוני לאחר כל הזרקה. להזריק 65 מיקרוליטרים במאגר תגובה של 50% אנזים, להימנע מבועות ולהסיר את התמיסה המובלטת בפורטל החוצה.ייצב את השבב הטעון בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות והתקן את השבב בפורטל שבב הרצף. בחר את התוכנית מתוכננת לבדוק את המידע ולהתחיל את ההפעלה. הריצה הייצוגית השיגה בסך הכל נתונים של 17.6 ג'יגה-בייט וקצב ההעמסה הכולל של חלקיק כדור היונים היה 88% מסך הבארות של השבב.מפת החום אישרה אפילו טעינה לדוגמה על שטח השבב הכולל. 77% מכלל הקריאות היו שמישות. כל הבארות הטעונות בספק שירותי אינטרנט הראו 100% העשרת תבניות שבהן 78% היו קלונליות.מתוך כל התבניות הקלוניות, 97% הוסמכו כספרייה הסופית. האורך הממוצע של הקריאה היה 177 זוגות בסיסים ואילו החציון והמצב היו 176 ו-174 זוגות בסיסים, בהתאמה. ספירות השיא של תימין, ציטוזין ואדנין בתבניות היו כ-76 מעל קו החיתוך המוסמך של 50.בכל הבארות הניתנות להתייחסות עם ספקי שירותי אינטרנט חיים 99.5% הוסמכו כספרייה הבנויה ו-20% מהספריות הפוליקלונליות והאיכותיות היו מסוננות בעוד ש-76.6% מספקי שירותי האינטרנט היו מוסמכים לניתוח נוסף. התוצאה של שונות מספר ההעתקה מדגימה בודדת תיארה טריזומיה פסיפס של 182.16 מגה-בסיס של P 16.3 עד Q 35.2 על כרומוזום ארבע ומקטע מונוזומי של 33 נקודות 13 מגה-בסיס של Q 11.1 עד Q 13.33 על כרומוזום 22. בעת ביצוע בחירת שברים, יש לשנות את מרווחי הזמן בין השלבים בהתאם לגודל הדגימות באותה אצווה כדי למנוע חשיפת יתר וחוסר חשיפה לדגימות קדמיות ואחוריות.

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

ממוקד הדור הבא רצפי וכן ביואינפורמטיקה צינור להעריך גורמים גנטיים של המחלה החוקתי

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

רצפי מוליכים למחצה עבור השרשה בדיקה גנטית עבור אנאפלואידיה

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

ניתוחים פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה משימוש במסד הנתונים OpenProt לחשוף את הרומן חלבונים מתורגם ממסגרות קאנונית קריאה פתוחה

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

ה-RNA רצף הדור הבא וצינור ביואינפורמטיקה לזיהוי קו מבוטא-1s ברמה הספציפית לוקוס

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...