Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Vorremmo ringraziare il Dr. Zhangyong Ming e il Sig. Rongji Hou per i loro consigli sull'applicazione estesa LIMS. Questo studio è supportato da PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) e Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Tutti i protocolli e la biopsia del trofoectoderma (TE) (sezione 1.1.1.1) applicati in questo studio sono stati esaminati e approvati dal comitato etico di ricerca umana dell'ospedale n. 924 il 18 settembre 2017 (NO: PLA924-2017-59). I pazienti/partecipanti hanno fornito il loro consenso informato scritto per partecipare a questo studio.
1. Isolamento del DNA dalla biopsia dell'embrione umano e amplificazione genomica completa
<ol><li>Protocollo per l'amplificazione<sup clas...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. 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Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Torrent+sequencing+for+conducting+genome-wide+scans+for+mutation+mapping+analysis.">Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis.</a> Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).</li><li>Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+testing+for+aneuploidy:+what+technology+should+you+use+and+what+are+the+differences.">Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).</li><li>Landrum, M. 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L'aneuploidia cromosomica degli embrioni è la causa di gran parte della perdita di gravidanza, sia concepita naturalmente che in vitro (FIV). Nella pratica clinica della fecondazione in vitro, si propone che lo screening dell'aneuploidia embrionale e il trasferimento dell'embrione euploidia possano migliorare l'esito della fecondazione in vitro. L'ibridazione fluorescenza in situ è la prima tecnica adottata per la selezione del sesso e la PGT-A; Tuttavia, questa tecnica richiede più competenze tecnic...

L'aneuploidia è l'anomalia nel numero di cromosomi dovuta alla presenza di uno o più cromosomi extra o all'assenza di uno o più cromosomi. Gli embrioni che portano qualche tipo di aneuploidia, come la perdita di un cromosoma X (sindrome di Turner), copie extra di autosomi, come trisomie dell'autosoma 21 (sindrome di Down), 13 (sindrome di Patau) e 18 (sindrome di Edwards), o cromosomi sessuali extra come 47, XXY (sindrome di Klinefelter) e 47, XXX (sindrome Triple X), possono sopravvivere a termine con difetti alla nascita1. L'aneuploidia è la causa principale degli aborti spontanei del primo trimestre e del fallimento della fecondazione in vitro (IVF)2. È stato riferito che il tasso di aneuploidia potrebbe variare dal 25,4% all'84,5% attraverso i diversi strati di età del ciclo naturale e del gruppo di controllo medicato nella pratica della fecondazione in vitro3.
La tecnologia di sequenziamento di nuova generazione sta diventando selvaggiamente applicata nella determinazione clinica delle informazioni genetiche; Fornisce un accesso pratico alla sequenza del genoma con efficienza e throughput elevato. In particolare, il sequenziamento di nuova generazione ha rivoluzionato anche la diagnosi di disturbi con fattori genetici e test per l'anomalia nel genoma4. Utilizzando la tecnologia di sequenziamento dei semiconduttori per trasferire direttamente i segnali chimici nel sequenziamento della bioreazione in dati digitali, il sistema di sequenza basato su semiconduttori fornisce un rilevamento diretto e in tempo reale per sequenziare i dati in 3-7 h 5,6.
In una procedura di fecondazione in vitro, il test genetico preimpianto (PGT) indaga il profilo genetico dell'embrione prima di essere trasferito nell'utero per migliorare l'esito della fecondazione in vitro e ridurre il rischio di malattie genetiche nei neonati 1,7. Nella PGT combinata con le tecniche NGS, il materiale genetico estratto da meno di 10 cellule viene amplificato con kit di amplificazione dell'intero genoma o un reagente di amplificazione dell'intero genoma sviluppato in modo indipendente. Ciò richiede solo una fase nella fase di amplificazione e non richiede pre-amplificazione, per ottenere prodotti di amplificazione dell'intero genoma. Primer o pannelli per la variante del numero di copie e il sequenziamento speciale dei loci genici sono progettati e applicati nella libreria costruita.
Un tipico flusso di lavoro di test genetici preimpianto-aneuploidia (PGT-A) in NGS comporta procedure seriali e richiede un intenso carico di lavoro del personale di laboratorio8. Alcuni errori di rollback delle procedure causati da errori possono portare a perdite indesiderate di tempo e risorse del laboratorio. Una procedura operativa standard (SOP) concisa e chiara per il flusso di lavoro PGS-NGS è utile; Tuttavia, i protocolli in formato Word non possono presentare informazioni più dettagliate sull'elaborazione dei campioni, sulla manipolazione dei dispositivi e sulle impostazioni degli strumenti, che possono essere visualizzate in un protocollo video. In questo articolo, un flusso di lavoro convalidato combinato con una dimostrazione visualizzata dei dettagli operativi potrebbe offrire protocolli di riferimento più diretti e intuitivi nella pratica PGT su una piattaforma di sequenziamento dei semiconduttori.
Il protocollo qui descrive un metodo che supporta il dosaggio di fino a 16 biopsie embrionali in parallelo. Per lotti più grandi, si consiglia di utilizzare un protocollo commerciale basato su kit per il sequenziamento dei semiconduttori, come Reproes-PGS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

Il sequenziamento di nuova generazione ha acquisito un'importanza crescente nell'applicazione clinica nella determinazione delle varianti genetiche. Nel test genetico preimpianto, questa tecnica ha i suoi vantaggi unici in termini di scalabilità, produttività e costi. Per il test genetico preimpianto per l'analisi delle aneuploidie, il sistema di sequenziamento di nuova generazione (NGS) basato su semiconduttori qui presentato fornisce un approccio completo per determinare le varianti genetiche strutturali con una risoluzione minima di 8 Mb. Dall'acquisizione del campione al report finale, il processo di lavoro richiede più passaggi con una stretta aderenza ai protocolli. Poiché vari passaggi critici potrebbero determinare l'esito dell'amplificazione, la qualità della libreria, la copertura delle letture e l'output dei dati, le informazioni descrittive con dimostrazione visiva diversa dalle parole potrebbero offrire maggiori dettagli al funzionamento e alla manipolazione, che possono avere un grande impatto sui risultati di tutti i passaggi critici. I metodi qui presentati mostreranno le procedure coinvolte nell'amplificazione dell'intero genoma (WGA) delle cellule di Trophectoderm (TE) sottoposte a biopsia, nella costruzione della libreria genomica, nella gestione del sequenziatore e, infine, nella generazione di report sulle varianti del numero di copie.

Al termine del piano delle sequenze dopo il processo di esecuzione nella macchina, il sistema del server di sequenza riporta il riepilogo con informazioni descrittive dei dati generati, dello stato del chip, della velocità di caricamento ISP e della qualità della libreria, come illustrato nella Figura 2. In questa dimostrazione dei risultati, sono stati ottenuti 17,6 G di dati nella base totale e il tasso di caricamento complessivo dell'ISP è stato dell'88% nei pozzi totali del chip; la m...

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Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Il protocollo presenta le procedure generali in laboratorio richieste nei test genetici preimpianto per l'aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori. Qui presentiamo i passaggi dettagliati dell'amplificazione dell'intero genoma, della selezione dei frammenti di DNA, della costruzione della libreria, della preparazione del modello e del flusso di lavoro del sequenziamento con risultati rappresentativi.

Test genetici preimpianto per aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Questo protocollo presenta la procedura dall'amplificazione di singole cellule ai dati di segnalazione finale nei test genetici preimpianto per aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori. Questa procedura può aiutare gli spettatori ad avere una buona comprensione del flusso di lavoro sperimentale del sequenziamento PGT-A e replicare questa tecnica in un laboratorio diagnostico con una piattaforma NGS basata su semiconduttori. Inizia pipettando 25 microlitri di prodotti di amplificazione dell'intero genoma e trasferendoli in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri precaricata con 25 microlitri di acqua priva di nucleasi.Vortice e mescolare le perle di purificazione del DNA. Aliquot 50 microlitri di questa soluzione in ciascuna provetta del campione. Vortice e centrifugare brevemente per cinque secondi.Impostare il tubo per cinque minuti a temperatura ambiente per il processo di legame del DNA. Inserire il tubo da centrifuga da 1,5 millilitri in una cremagliera magnetica. Quindi, attendere che tutte le sfere magnetiche siano attratte dalla parete laterale del tubo.Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Evitare di pipettare le perline. Secondo il volume campione originale.Pipettare 30 microlitri di sfere magnetiche, vortice e centrifugare brevemente per cinque secondi. Impostare il tubo per cinque minuti a temperatura ambiente per il processo di legame del DNA. Inserire le provette da centrifuga da 1,5 millimetri nella cremagliera magnetica.Quindi, attendere che tutte le sfere magnetiche siano attratte dalla parete laterale del tubo. Rimuovere con cautela e scartare il surnatante. Evitare di pipettare le perline.Pipettare 300 microlitri di etanolo al 70% nella provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Quindi ruotare delicatamente il tubo due volte con un angolo di 180 gradi e spostare le perline lungo la parete del tubo per un lavaggio accurato. Pipettare ed eliminare il surnatante.Evitare di pipettare le perline. Ripetere la procedura di lavaggio una volta. Posizionare una nuova piastra di amplificazione nel sistema una volta completato il programma pulito.Inserire i tubi di raccolta, ciascuno preriempito con 150 microlitri di soluzione di rottura due nel rotore, quindi posizionare il ponte sui tubi di raccolta. Aggiungere l'olio di reazione a metà del tubo e la soluzione di rottura dell'emulsionante a un terzo del tubo. Posizionare un nuovo filtro per la preparazione del modello su un rack di tubi con il portale di campionamento posizionato verso l'alto.Vortice la soluzione per cinque secondi e centrifugare brevemente per cinque secondi. Quindi trasferire la soluzione nel portale del campione del filtro dopo aver pipettellato 800 microlitri tre volte. Centrifugare il tubo per diminuire le bolle prima dell'ultima iniezione.Evitare di iniettare aria nel filtro. Iniettare 200 microlitri di olio di reazione due, seguendo la soluzione miscelata. Ruotare il portale campione del filtro verso il basso e sostituire l'adattamento di lavaggio con il filtro.Inserire l'ago del campione nel foro centrale del coperchio del rotore e quindi premere l'ago verso il basso. Fare clic sul pulsante Esegui sullo schermo e scegliere il programma in base al kit corrispondente. Quindi selezionare Assistito per controllare tutti i passaggi.Fare clic su Avanti fino all'avvio della corsa. La corsa richiederà circa 4,5 ore per terminare. Selezionare Avanti al termine del programma.Il sistema avvierà un processo di centrifugazione di 10 minuti. Dopo la centrifugazione, fare clic sul pulsante Apri coperchio e spostare i tubi di raccolta nei rack. Se la procedura non passa alla fase successiva entro 15 minuti, premere sul giro finale per centrifugare nuovamente.Rimuovere il surnatante nel tubo di raccolta, lasciando 100 microlitri di soluzione nel tubo. Mescolare il campione rimanente mediante pipettaggio e trasferire il campione nella nuova provetta da centrifuga da 1,5 millilitri contrassegnata OT. Quando si pipetta il surnatante, evitare di toccare il fondo del tubo lungo i lati. Pipettare 100 microlitri di acqua priva di nucleasi in ogni provetta di raccolta e trasferire la soluzione nella provetta OT lavata mediante pipettaggio ripetuto.Aggiungere 600 microlitri di acqua priva di nucleasi al tubo OT per ottenere il volume totale di un millilitro. Vortice per 30 secondi in centrifuga a 15, 500 volte G per otto minuti. Rimuovere delicatamente il surnatante lasciando 100 microlitri di soluzione nel tubo OT.Utilizzare la punta per eliminare completamente lo strato di olio. Aggiungere 900 microlitri di acqua priva di nucleasi, vortice per 30 secondi e centrifugare a 15, 500 volte G per otto minuti. Rimuovere il surnatante fino a quando rimangono 20 microlitri della soluzione e aggiungere la soluzione di sospensione del modello per ottenere il volume di 100 microlitri.Quindi vortice per 30 secondi e centrifugare brevemente per due secondi. Procedere al passaggio successivo entro 12 ore dall'elaborazione del campione Caricare 100 microlitri della libreria diluita, 130 microlitri di perline C1, 300 microlitri di tre soluzioni di lavaggio del modello e 300 microlitri della soluzione di fusione nelle otto strisce del pozzetto. Installare le otto strisce del pozzetto sul modulo di arricchimento, caricare la punta del pipettaggio e posizionare il tubo della centrifuga da 200 microlitri nella posizione di raccolta.Fare clic su Start per eseguire il programma. Pipettare 55 microlitri della soluzione campione e iniettarla nel foro del campione del chip. Impostare il chip sulla centrifuga.Mantenere la tacca verso l'esterno e il portale del campione all'interno. Quindi, bilanciarlo con un altro chip usato e centrifugare per 10 minuti. Preparare la soluzione di caricamento come descritto nel manoscritto di testo.Soffiare 100 microlitri di aria nella soluzione schiumogena. Pipettare ripetutamente la soluzione fino a quando le bolle sono in uno stato denso e schiumogeno e mantenere il volume di schiuma a circa 250 microlitri. Posizionare il chip sul banco dopo la centrifuga.Iniettare 100 microlitri di schiuma nel foro del campione e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno. Quindi, centrifugare brevemente il chip per 30 secondi. Ripeti questo processo una volta.Iniettare due volte 100 microlitri al 50% tampone di lavaggio e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno dopo ogni iniezione. Quindi iniettare tre volte 100 microlitri al 50% del tampone di ricottura e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno dopo ogni iniezione. Iniettare 65 microlitri al 50% tampone di reazione enzimatica, evitando bolle e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno.Stabilizzare il chip caricato a temperatura ambiente per cinque minuti e installare il chip sul portale del chip sequencer. Scegli il programma pianificato controlla le informazioni e avvia l'esecuzione. La corsa rappresentativa ha ottenuto un totale di 17,6 gigabyte di dati e il tasso di caricamento complessivo della particella della sfera ionica è stato dell'88% nei pozzetti totali del chip.La mappa di calore ha confermato anche il carico del campione sull'area totale del chip. Il 77% delle letture totali era utilizzabile. Tutti i pozzi caricati con ISP hanno mostrato un arricchimento del 100% dei modelli in cui il 78% era clonale.Di tutti i modelli clonali, il 97% è stato qualificato come libreria finale. La lunghezza media della lettura era di 177 coppie di basi, mentre la mediana e la modalità erano rispettivamente di 176 e 174 coppie di basi. I picchi di timina, citosina e adenina nei modelli erano circa 76 oltre la linea di taglio qualificata di 50.In tutti i pozzi indirizzabili con ISP attivi il 99,5% si è qualificato come libreria costruita e il 20% delle librerie policlonali e di bassa qualità sono stati filtrati, mentre il 76,6% degli ISP è stato qualificato per ulteriori analisi. Il risultato della varianza del numero di copie da un singolo campione ha rappresentato una trisomia a mosaico di 182,16 megabasi di coppie di P 16,3 a Q 35,2 sul cromosoma quattro e un segmento di monosomia di 33 punti 13 coppie di megabasi da Q 11,1 a Q 13,33 sul cromosoma 22. Quando si esegue la selezione dei frammenti, gli intervalli di tempo tra le fasi devono essere modificati in base alle dimensioni dei campioni nello stesso lotto per evitare sovraccarico e mancanza di esposizione per i campioni anteriori e posteriori.

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Valutazione della contaminazione da DNA a RNA campioni basati sul DNA Ribosomal

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Ricerca

Genetica

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del DNA organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Un'elevato Throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Sequenziamento di nuova generazione e bioinformatica Pipeline per valutare fattori determinanti genetici della malattia costituzionale mirati

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificazione del vicino full-length provirus di HIV-1 per il sequenziamento di nuova generazione

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Ingegneria genetica di Dictyostelium discoideum cellule basata sulla selezione e crescita sui batteri

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneuplodia

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Basati sulla spettrometria di massa proteomica analisi utilizzando il Database di OpenProt a svelare nuove proteine tradotte da Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

Sequenziamento di nuova generazione di RNA e una pipeline di bioinformatica per identificare i LINE-1S espressi a livello specifico del locus

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...