Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

LIMS拡張アプリケーションに関するアドバイスをしてくれたZhangyong Ming 博士と Rongji Hou 氏に感謝します。本研究は、人民解放軍家族計画特別研究プロジェクト(17JS008, 20JSZ08)、広西チワン族自治区代謝性疾患研究基幹研究所基金(No.20-065-76)、広州市民健康科学技術研究プロジェクト(201803010034)の支援を受けています。

本試験に適用されたすべてのプロトコールおよび対流胚葉(TE)生検(1.1.1.1項)は、2017年9月18日に第924号病院のヒト研究倫理委員会によって審査および承認された(NO:PLA924-2017-59)。患者/参加者は、この研究に参加するための書面によるインフォームドコンセントを提供しました。
1. ヒト胚生検および全ゲノム増幅からのDNA単離
<ol><li>全ゲノム増幅のためのプロト...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+aneuploidy+rates+are+equivalent+in+natural+cycles+and+gonadotropin-stimulated+cycles.">Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles.</a> Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).</li><li>Adams, D. R., Eng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+to+diagnose+suspected+genetic+disorders.">Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).</li><li>Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+ion+torrent+semiconductor+chip+based+sequencing.">Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing.</a> Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).</li><li>Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. 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Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf</a> (2017)</li><li>PicoPLEX&#174; Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf">https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf</a> (2019)</li><li>. Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html">https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html</a> (2017)</li><li>Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Bayesian+inference+of+copy+number+variants+using+Hidden+Markov+models+with+wavelet+compression.">Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression.</a> PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).</li><li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+using+fluorescence+in+situ+hybridization+in+patients+with+repetitive+implantation+failure+and+advanced+maternal+age:+two+randomized+trials.">Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).</li><li>Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+screening+(PGS)+still+in+search+of+a+clinical+application:+a+systematic+review.">Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).</li><li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+pre-implantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations.">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li><li>Handyside, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=24-chromosome+copy+number+analysis:+a+comparison+of+available+technologies.">24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).</li><li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation.">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li><li>El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequence+assembly:+Four+stages+of+data+processing+and+computational+challenges.">Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges.</a> PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).</li><li>Jennings, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+validation+of+next-generation+sequencing-based+oncology+panels:+A+joint+consensus+recommendation+of+the+Association+for+Molecular+Pathology+and+College+of+American+Pathologists.">Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).</li><li>de Bourcy, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+comparison+of+single-cell+whole+genome+amplification+methods.">A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods.</a> PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).</li><li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+pre-implantation+genetic+screening+cycles.">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li><li>Damerla, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Torrent+sequencing+for+conducting+genome-wide+scans+for+mutation+mapping+analysis.">Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis.</a> Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).</li><li>Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+testing+for+aneuploidy:+what+technology+should+you+use+and+what+are+the+differences.">Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+improving+access+to+variant+interpretations+and+supporting+evidence.">ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence.</a> Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).</li><li>Genomes Project, C, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+reference+for+human+genetic+variation.">A global reference for human genetic variation.</a> Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).</li><li>McKusick, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+in+man+and+its+online+version,+OMIM.">Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM.</a> American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).</li><li>Zhao, M., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNVannotator:+A+comprehensive+annotation+server+for+copy+number+variation+in+the+human+genome.">CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome.</a> PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+next-generation+sequencing+in+pre-implantation+genetic+diagnosis+cycles+for+Robertsonian+and+reciprocal+translocations.">Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+allele+with+resolved+carrier+status+of+Robertsonian+and+reciprocal+translocation+in+human+pre-implantation+embryos.">Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).</li></ol>

胚の染色体異数性は、自然に妊娠したか体外受精(IVF)かにかかわらず、妊娠喪失の大部分の原因である。体外受精の臨床現場では、異数性の胚をスクリーニングし、倍数性胚を移入することが体外受精の結果を改善することができることが提案されている。蛍光in situハイブリダイゼーションは、性選択およびPGT-Aに採用された最も初期の技術である。しかし、この技術は実験室?...

異数性は、1つ以上の余分な染色体の存在または1つ以上の染色体の不在による染色体数の異常である。1つのX染色体の喪失(ターナー症候群)、常染色体21(ダウン症候群)、13(パタウ症候群)、および18(エドワーズ症候群)のトリソミーのような常染色体の余分なコピー、または47、XXX(クラインフェルター症候群)および47、XXX(トリプルX症候群)などの余分な性染色体のようなある種の異数性を有する胚は、先天性欠損症1の期間まで生き残ることができる。異数性は、第1期流産および 体外 受精(IVF)障害の主な原因である2。異数性率は、体外受精の実践3における自然サイクルおよび薬用対照群の異なる年齢層を通じて、25.4%〜84.5%の範囲であり得ることが報告されている。
次世代シーケンシング技術は、遺伝情報の決定に臨床的に広く応用されつつあります。それは効率および高いスループットでゲノム配列への実用的なアクセスを提供する。特に、次世代シーケンシングは、遺伝的要因による疾患の診断やゲノムの異常性の検査にも革命をもたらしました4。半導体シーケンシング技術を使用して、シーケンシングバイオ反応の化学信号をデジタルデータに直接転送する半導体ベースのシーケンスシステムは、3-7時間5,6でシーケンスデータに直接、リアルタイム検出を提供します。
体外受精手順では、着床前遺伝子検査(PGT)は、体外受精の結果を改善し、新生児の遺伝性疾患のリスクを軽減するために、子宮に移される前に胚の遺伝子プロファイルを調査します1,7。PGTとNGS技術を組み合わせることで、10細胞未満から抽出した遺伝物質を全ゲノム増幅キットまたは独自開発の全ゲノム増幅試薬で増幅します。これは、増幅段階で1つのステップのみを必要とし、全ゲノム増幅産物を得るために、事前増幅を必要としない。コピー数変異体および特別な遺伝子座配列決定のためのプライマーまたはパネルは、構築されたライブラリーにおいて設計および適用される。
NGSにおける着床前遺伝子検査異数性検査(PGT-A)の典型的なワークフローは、逐次的な手順を伴い、実験室職員の激しい作業負荷を必要とする8。一部の誤操作により、手順のロールバックが発生し、ラボの時間とリソースの両方が望ましくない損失につながる可能性があります。PGS-NGS ワークフローの簡潔で明確な標準操作手順 (SOP) が役立ちます。ただし、ワード形式のプロトコルでは、サンプル処理、デバイス操作、および計測器の設定に関するより詳細な情報を提示できず、ビデオプロトコルで視覚化できます。この記事では、検証済みのワークフローと動作の詳細の視覚化されたデモンストレーションを組み合わせることで、半導体シーケンシングプラットフォームでのPGTプラクティスにおいて、より直接的で直感的な参照プロトコルを提供できます。
ここでのプロトコルは、最大16回の胚生検を並行してバッチ処理することをサポートする方法を説明しています。より大きなバッチの場合は、Reproes-PGSなどの半導体シーケンシングに商用キットベースのプロトコルを使用することをお勧めします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

次世代シーケンシングは、遺伝的バリアントの決定における臨床応用においてますます重要性を増しています。移植前の遺伝子検査では、この技術にはスケーラビリティ、スループット、およびコストの点で独自の利点があります。異数性解析のための移植前遺伝子検査では、ここで紹介する半導体ベースの次世代シーケンシング(NGS)システムは、8Mbの最小分解能で構造的遺伝的バリアントを決定するための包括的なアプローチを提供します。サンプルの取得から最終レポートまで、作業プロセスにはプロトコルに厳密に準拠した複数のステップが必要です。さまざまな重要なステップが増幅の結果、ライブラリの品質、読み取りのカバレッジ、およびデータの出力を決定することができるため、言葉以外の視覚的なデモンストレーションを伴う説明情報は、操作と操作の詳細を提供する可能性があり、すべての重要なステップの結果に大きな影響を与える可能性があります。本明細書に提示される方法は、生検されたTrophectoderm(TE)細胞の全ゲノム増幅(WGA)、ゲノムライブラリー構築、シークエンサー管理、そして最後にコピー数バリアントのレポートの生成に関与する手順を示す。

マシンで実行中のプロセスが終了した後にシーケンス計画が終了すると、シーケンス・サーバー・システムは、 図 2 に示すように、生成されたデータ、チップ状況、ISP ロード・レート、およびライブラリー品質の説明情報とともに要約を報告します。この結果実証では、全ベースで17.6Gのデータが得られ、ISPの全体的な負荷率はチップの全ウェルで88%でした。ヒートマ...

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Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

このプロトコルは、半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォーム上での異数性に対する移植前遺伝子検査に必要なラボ内の全体的な手順を提示します。ここでは、全ゲノム増幅、DNA断片選択、ライブラリ構築、テンプレート調製、シーケンシング作業フローの詳細なステップを代表的な結果とともに紹介します。

半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

このプロトコルは、半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームでの異数性の移植前遺伝子検査における単一細胞増幅から最終報告データまでの手順を提示します。この手順は、視聴者がPGT-Aシーケンシングの実験ワークフローをよく理解し、半導体ベースのNGSプラットフォームを備えた診断ラボでこの手法を再現するのに役立ちます。まず、25マイクロリットルの全ゲノム増幅産物をピペッティングし、25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をプリロードした1.5ミリリットルの遠沈管に移します。DNA精製ビーズを渦巻きして混合する。この溶液を50マイクロリットルずつサンプルチューブに分注します。渦と遠心分離を5秒間短時間行います。DNA結合プロセスのために、チューブを室温で5分間セットします。1.5ミリリットルの遠沈管を磁気ラックに挿入します。次に、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで待ちます。上清を新しい1.5ミリリットルの遠沈管に慎重に移します。ビーズをピペッティングしないでください。元のサンプル量によると。30マイクロリットルの磁気ビーズ、ボルテックス、遠心分離機を5秒間短時間ピペットで入れます。DNA結合プロセスのために、チューブを室温で5分間セットします。1.5ミリメートルの遠心管を磁気ラックに挿入します。次に、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで待ちます。上清を慎重に取り除き、廃棄します。ビーズをピペッティングしないでください。300マイクロリットルの70%エタノールを1.5ミリリットルの遠沈管にピペットで入れます。次に、チューブを180度の角度で2回ゆっくりと回転させ、ビーズをチューブの壁に沿って動かして完全に洗浄します。上清をピペットで捨てる。ビーズをピペッティングしないでください。洗浄手順を一度繰り返します。クリーンプログラムが完了したら、新しいアンププレートをシステムに配置します。それぞれ150マイクロリットルの破砕溶液2が事前に充填された収集チューブをローターに挿入し、ブリッジを収集チューブに配置します。チューブの半分に反応油を加え、チューブの3分の1に乳化剤破砕溶液を加えます。テンプレート準備用の新しいフィルターを、サンプルポータルを上向きに配置したチューブラックに配置します。溶液を5秒間ボルテックスし、5秒間短時間遠心分離します。次に、800マイクロリットルを3回ピペッティングした後、溶液をフィルターのサンプルポータルに移します。最後の注入の前にチューブを遠心分離して気泡を減らします。フィルターに空気を注入しないでください。混合溶液に続いて、200マイクロリットルの反応油を2つ注入します。フィルターのサンプルポータルを下向きにし、洗浄アダプターをフィルターと交換します。サンプル針をローター蓋の中央の穴に挿入し、針を下に押し付けます。画面の[実行]ボタンをクリックして、対応するキットに従ってプログラムを選択します。次に、[支援] を選択してすべての手順を確認します。実行が開始されるまで[次へ]をクリックします。実行が完了するまでに約4.5時間かかります。プログラムが終了したら、[次へ] を選択します。システムは10分間の遠心分離プロセスを開始します。遠心分離後、[蓋を開く]ボタンをクリックして、収集チューブをラックに移動します。手順が15分以内に次のステップに進まない場合は、最後のスピンを押して再遠心分離します。収集チューブ内の上清を取り除き、チューブ内に100マイクロリットルの溶液を残します。残りのサンプルをピペッティングで混合し、OTとマークされた新しい1.5ミリリットルの遠沈管にサンプルを移します。上清をピペッティングするときは、側面に沿ってチューブの底に触れないでください。100マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水を各収集チューブにピペットで入れ、繰り返しピペッティングして洗浄したOTチューブに溶液を移す。600マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をOTチューブに追加して、1ミリリットルの総容量を構成します。15, 500倍Gの遠心分離機で30秒間8分間ボルテックスします。OTチューブに100マイクロリットルの溶液を残して上清を静かに取り除きます。チップを使用して、油層を完全に廃棄します。900マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加え、30秒間ボルテックスし、15, 500倍Gで8分間遠心分離します。20マイクロリットルの溶液が残るまで上清を取り除き、100マイクロリットルの容量を補うためにテンプレート再懸濁溶液を追加します。その後、30秒間ボルテックスし、2秒間短時間遠心分離します。サンプル処理から12時間以内に次のステップに進みます 100マイクロリットルの希釈ライブラリ、130マイクロリットルのC1ビーズ、300マイクロリットルの3つのテンプレート洗浄液、および300マイクロリットルのメルトオフ溶液を8つのウェルストリップにロードします。エンリッチメントモジュールに8つのウェルストリップを取り付け、ピペッティングチップをロードし、200マイクロリットルの遠沈管を収集位置に設定します。[開始]をクリックしてプログラムを実行します。55マイクロリットルの試料溶液をピペットで、チップのサンプル孔に注入する。チップを遠心分離機にセットします。ノッチを外側に向け、サンプルポータルを内側に保ちます。次に、別の使用済みチップとのバランスを取り、10分間遠心分離します。テキスト原稿に記載されているように、ローディング溶液を準備します。発泡溶液に100マイクロリットルの空気を吹き込みます。泡が密な発泡状態になるまで溶液を繰り返しピペットで固定し、泡の体積を約250マイクロリットルに保ちます。遠心分離後、チップをベンチに置きます。100マイクロリットルの泡をサンプル穴に注入し、押し出された溶液をアウトポータルに取り出します。次に、チップを30秒間短時間遠心分離します。このプロセスを一度繰り返します。50%洗浄バッファーで100マイクロリットルを2回注入し、注入のたびにアウトポータルの押し出し溶液を取り除きます。次に、50%アニーリングバッファーで100マイクロリットルを3回注入し、注入のたびにアウトポータルの押し出し溶液を除去します。気泡を避けて50%酵素反応バッファーに65マイクロリットルを注入し、アウトポータルの押し出し溶液を取り除きます。ロードしたチップを室温で5分間安定させ、シーケンサーチップポータルにチップを取り付けます。計画済みプログラムを選択して情報を確認し、実行を開始します。代表的な実行では、合計17.6ギガバイトのデータが得られ、イオン球粒子の全体的な負荷率は、チップの全ウェルで88%でした。ヒートマップは、チップの総面積に均一なサンプル負荷を確認しました。合計読み取りの77%が使用可能でした。ISPを負荷したすべてのウェルは、100%テンプレート濃縮を示し、78%がクローン性でした。すべてのクローンテンプレートのうち、97%が最終ライブラリとして認定されました。リードの平均長は177塩基対で、中央値と最頻値はそれぞれ176塩基対と174塩基対でした。テンプレート中のチミン、シトシン、アデニンのピーク数は、適格なカットオフラインの50に対して約76でした。ライブISPを備えたすべてのアドレス可能なウェルで、構築されたライブラリとして99.5%が認定され、ポリクローナルおよび低品質のライブラリの20%が除外され、ISPの76.6%がさらなる分析の資格を得ました。単一サンプルからのコピー数分散の結果は、4番染色体上のP 16.3からQ 35.2の182.16メガ塩基対モザイクトリソミーと、22番染色体上のQ 11.1からQ 13.33の33ポイント13メガ塩基対モノソミーセグメントを示した。フラグメント選択を実行する場合、ステップ間の時間間隔は、フロントエンドおよびリアエンドサンプルの過剰および曝露の欠如を防ぐために、同じバッチ内のサンプルのサイズに応じて変更する必要があります。

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

リボソーム DNA に基づいて RNA サンプルの DNA 汚染の評価

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

キイロタマホコリカビの選択に基づいて細胞と細菌の成長の遺伝子工学

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

無呼吸性遺伝子検査用半導体シーケンシング

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

非正規の開いたリーディング ・ フレームから翻訳された蛋白質を発表する OpenProt データベースを利用した質量分析を用いたプロテオミクス解析

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA 次世代シーケンシングと、遺伝子座固有のレベルで表現されたライン-1s を識別するバイオインフォマティクスパイプライン

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...