Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

우리는 LIMS 확장 응용 프로그램에 대한 조언에 대해 Zhangyong Ming 박사와 Rongji Hou 씨에게 감사드립니다. 이 연구는 PLA 가족 계획 특별 연구 프로젝트 (17JS008, 20JSZ08), 광시 대사 질환 연구 연구소 기금 (No.20-065-76) 및 광저우 시민 건강 과학 기술 연구 프로젝트 (201803010034)가 지원합니다.

본 연구에 적용된 모든 프로토콜과 트로피코더럴(TE) 생검(1.1.1.1 섹션)은 2017년 9월 18일 제924호 병원의 인간 연구 윤리위원회에 의해 검토되고 승인되었다(NO: PLA924-2017-59). 환자 / 참가자는이 연구에 참여하기 위해 서면 정보에 입각 한 동의서를 제공했습니다.
1. 인간 배아 생검 및 전체 게놈 증폭으로부터의 DNA 분리
<ol><li>전체 게놈 증폭을 위한 프로토콜<sup class="...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. 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Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+comparison+of+single-cell+whole+genome+amplification+methods.">A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods.</a> PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).</li><li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+pre-implantation+genetic+screening+cycles.">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li><li>Damerla, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Torrent+sequencing+for+conducting+genome-wide+scans+for+mutation+mapping+analysis.">Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis.</a> Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).</li><li>Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+testing+for+aneuploidy:+what+technology+should+you+use+and+what+are+the+differences.">Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+improving+access+to+variant+interpretations+and+supporting+evidence.">ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence.</a> Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).</li><li>Genomes Project, C, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+reference+for+human+genetic+variation.">A global reference for human genetic variation.</a> Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).</li><li>McKusick, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+in+man+and+its+online+version,+OMIM.">Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM.</a> American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).</li><li>Zhao, M., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNVannotator:+A+comprehensive+annotation+server+for+copy+number+variation+in+the+human+genome.">CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome.</a> PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+next-generation+sequencing+in+pre-implantation+genetic+diagnosis+cycles+for+Robertsonian+and+reciprocal+translocations.">Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+allele+with+resolved+carrier+status+of+Robertsonian+and+reciprocal+translocation+in+human+pre-implantation+embryos.">Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).</li></ol>

배아의 염색체 이수성은 자연적으로 임신하든 체외 수정 (IVF)이든 임신 손실의 큰 비율의 원인입니다. IVF의 임상 실습에서, 배아 이수성을 스크리닝하고 유플로이드 배아를 옮기는 것이 IVF의 결과를 향상시킬 수 있다고 제안된다. 계내 형광 혼성화는 PGT-A성 선택 및 PGT-A를 위해 채택된 최초의 기술이다; 그러나이 기술은 실험실 직원으로부터보다 기술적 인 전문 지식이 필요하며 상?...

Aneuploidy는 하나 이상의 여분의 염색체의 존재 또는 하나 이상의 염색체의 부재에 의한 염색체 수의 이상이다. 하나의 X 염색체 손실 (터너 증후군), 상염색체 21 (다운 증후군), 13 (파타우 증후군) 및 18 (에드워즈 증후군)의 트리솜과 같은 상염색체의 여분의 사본 또는 47, XXY (Klinefelter syndrome) 및 47, XXX (트리플 X 증후군)와 같은 여분의 성 염색체와 같은 일부 유형의 이수성을 지닌 배아는 출생 결함1과 함께 용어까지 생존 할 수 있습니다. Aneuploidy는 첫 번째 삼 분기 유산 및 체외 수정 (IVF) 실패의 주요 원인입니다2. 이수성 비율은 IVF 연습3에서 자연주기와 약용 대조군의 다른 연령층을 통해 25.4 % -84.5 %의 범위 일 수 있다고보고되었습니다.
차세대 염기서열 분석 기술은 임상적으로 유전 정보의 결정에 격렬하게 적용되고있다; 그것은 효율성과 높은 처리량으로 게놈 서열에 대한 실질적인 접근을 제공합니다. 특히, 차세대 시퀀싱은 유전 적 요인을 가진 장애의 진단과 게놈 4의 비정상성에 대한 검사에 혁명을일으켰습니다. 반도체 시퀀싱 기술을 사용하여 시퀀싱 바이오 반응의 화학 신호를 디지털 데이터로 직접 전송하는 반도체 기반 시퀀스 시스템은 3-7 h 5,6의 시퀀스 데이터에 대한 직접적이고 실시간 감지를 제공합니다.
IVF 절차에서 이식 전 유전자 검사 (PGT)는 IVF 결과를 개선하고 신생아의 유전 질환의 위험을 줄이기 위해 자궁으로 옮겨지기 전에 배아의 유전 적 프로파일을 조사합니다 1,7. NGS 기술과 결합된 PGT에서, 10개 미만의 세포로부터 추출된 유전 물질은 전체 게놈 증폭 키트 또는 독립적으로 개발된 전체 게놈 증폭 시약으로 증폭된다. 이것은 증폭 단계에서 단 한 단계만을 필요로 하며, 전체 게놈 증폭 산물을 얻기 위해 사전 증폭을 필요로 하지 않는다. 카피 수 변이체 및 특수 유전자 유전자좌 시퀀싱을 위한 프라이머 또는 패널은 구축된 라이브러리에 설계되고 적용된다.
NGS에서 이식 전 유전자 검사-이수성(PGT-A)의 전형적인 워크플로우는 일련의 절차를 포함하며, 실험실 인력의 집중적인 작업량을 필요로 한다8. 일부 오작동으로 인해 절차 롤백이 발생하면 실험실의 시간과 자원이 바람직하지 않게 손실 될 수 있습니다. PGS-NGS 워크플로우를 위한 간결하고 명확한 표준 운영 절차(SOP)가 도움이 됩니다. 그러나 단어 형식 프로토콜은 비디오 프로토콜에서 시각화할 수 있는 샘플 처리, 장치 조작 및 계측기 설정에 대한 자세한 정보를 제공할 수 없습니다. 이 기사에서는 검증된 워크플로우와 작동 세부 사항에 대한 시각화된 데모가 결합되어 반도체 시퀀싱 플랫폼의 PGT 관행에서 보다 직접적이고 직관적인 참조 프로토콜을 제공할 수 있습니다.
여기의 프로토콜은 최대 16 개의 배아 생검을 병렬로 일괄 처리하는 것을 지원하는 방법을 설명합니다. 더 큰 배치의 경우 Reproes-PGS와 같은 반도체 시퀀싱을 위한 상용 키트 기반 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

차세대 시퀀싱은 유전자 변이의 결정에서 임상 적용에서 점점 더 중요해지고 있다. 이식 전 유전자 검사에서이 기술은 확장 성, 처리량 및 비용면에서 고유 한 이점을 가지고 있습니다. 이수성 분석을 위한 이식 전 유전자 검사의 경우, 여기에 제시된 반도체 기반 차세대 염기서열 분석(NGS) 시스템은 최소 8Mb의 분해능으로 구조적 유전 변이를 결정하는 포괄적인 접근법을 제공합니다. 샘플 수집에서 최종 보고서에 이르기까지 작업 프로세스에는 프로토콜을 밀접하게 준수하는 여러 단계가 필요합니다. 다양한 중요한 단계가 증폭의 결과, 라이브러리의 품질, 읽기 범위 및 데이터 출력을 결정할 수 있기 때문에 단어 이외의 시각적 데모를 통한 설명 정보는 모든 중요한 단계의 결과에 큰 영향을 줄 수있는 작업 및 조작에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다. 본원에 제시된 방법은 생검된 트로피오배엽 (TE) 세포의 전체 게놈 증폭 (WGA), 게놈 라이브러리 구축, 시퀀서 관리, 및 마지막으로 카피 번호 변이체 생성 보고에 관여하는 절차를 디스플레이할 것이다.

시퀀스 계획이 머신에서 실행 중인 프로세스 후에 완료되면 시퀀스 서버 시스템은 그림 2와 같이 생성된 데이터, 칩 상태, ISP 로딩 속도 및 라이브러리 품질에 대한 설명 정보와 함께 요약을 보고합니다. 이 결과 데모에서 총 베이스에서 17.6G 데이터가 얻어졌으며 ISP의 전체 로딩 속도는 칩의 총 웰에서 88 %였습니다. 히트 맵은 샘플이 칩의 전체 면적에 고르게 로딩되었음을 ?...

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Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

이 프로토콜은 반도체 기반 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 이수성에 대한 이식 전 유전자 검사에 필요한 전체 실험실 내 절차를 제시합니다. 여기에서는 전체 게놈 증폭, DNA 단편 선택, 라이브러리 구축, 템플릿 준비 및 대표적인 결과와 함께 시퀀싱 작업 흐름의 자세한 단계를 제시합니다.

반도체 기반 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 Aneuploidy에 대한 이식 전 유전자 검사

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

이 프로토콜은 반도체 기반 차세대 염기서열 분석 플랫폼에서 이수성을 위한 착상 전 유전자 검사에서 단일 세포 증폭에서 최종 보고 데이터에 이르는 절차를 제시합니다. 이 절차는 시청자가 PGT-A 시퀀싱의 실험 워크플로우를 잘 이해하고 반도체 기반 NGS 플랫폼이 있는 진단 실험실에서 이 기술을 복제하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 25마이크로리터의 전체 게놈 증폭 산물을 피펫팅하고 25마이크로리터의 뉴클레아제 자유수가 미리 로드된 1.5밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다.DNA 정제 비드를 와동시키고 혼합한다. 이 용액 50 마이크로리터를 각 샘플 튜브에 분취합니다. 소용돌이와 원심 분리기가 5 초 동안 잠깐 지속됩니다.DNA 결합 과정을 위해 실온에서 5 분 동안 튜브를 설정하십시오. 1.5 밀리리터 원심 분리기 튜브를 마그네틱 랙에 삽입합니다. 그런 다음 모든 마그네틱 비드가 튜브의 측벽에 끌릴 때까지 기다립니다.상청액을 새로운 1.5 밀리리터 원심 분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 구슬을 피펫팅하지 마십시오. 원래 샘플 볼륨에 따라.30 마이크로 리터의 자기 비드를 피펫팅하고 5 초 동안 와류와 원심 분리합니다. DNA 결합 과정을 위해 실온에서 5 분 동안 튜브를 설정하십시오. 1.5mm 원심분리기 튜브를 마그네틱 랙에 삽입합니다.그런 다음 모든 자기 비드가 튜브의 측벽에 끌릴 때까지 기다리십시오. 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 구슬을 피펫팅하지 마십시오.300 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에 피펫팅합니다. 그런 다음 튜브를 180도 각도로 부드럽게 두 번 돌리고 튜브 벽을 따라 비드를 움직여 철저히 씻습니다. 피펫팅하고 상청액을 버린다.구슬을 피펫팅하지 마십시오. 세척 절차를 한 번 반복하십시오. 깨끗한 프로그램이 완료되면 시스템에 새 증폭판을 놓습니다.각각 150 마이크로 리터로 미리 채워진 수집 튜브를 로터에 삽입 한 다음 수집 튜브에 브리지를 놓습니다. 튜브의 절반에 반응 오일을 추가하고 튜브의 1/3에 유화제 차단 용액을 추가합니다. 샘플 포털이 위쪽으로 배치된 튜브 랙에 템플릿 준비를 위한 새 필터를 놓습니다.용액을 5 초 동안 소용돌이 치고 5 초 동안 짧게 원심 분리합니다. 그런 다음 800 마이크로 리터를 3 회 피펫 팅 한 후 용액을 필터의 샘플 포털로 옮깁니다. 마지막 주입 전에 기포를 줄이기 위해 튜브를 원심분리합니다.필터에 공기를 주입하지 마십시오. 200 마이크로리터의 반응 오일을 주입하고, 혼합 용액에 이어 한다. 필터의 샘플 포털을 아래쪽으로 돌리고 세척 적응을 필터로 교체하십시오.샘플 바늘을 로터 뚜껑의 중앙 구멍에 삽입한 다음 바늘을 바닥으로 누릅니다. 화면에서 실행 버튼을 클릭하고 해당 키트에 따라 프로그램을 선택하십시오. 그런 다음 지원을 선택하여 모든 단계를 확인합니다.실행이 시작될 때까지 다음을 클릭합니다. 실행을 완료하는 데 약 4.5시간이 걸립니다. 프로그램이 완료되면 다음을 선택합니다.시스템은 10분 원심분리 프로세스를 시작합니다. 원심분리 후 뚜껑 열기 버튼을 클릭하고 수집 튜브를 랙으로 이동합니다. 절차가 15 분 안에 다음 단계로 이동하지 않으면 최종 스핀을 눌러 다시 원심 분리합니다.수집 튜브에서 상청액을 제거하고 튜브에 100 마이크로 리터의 용액을 남깁니다. 나머지 샘플을 피펫팅으로 혼합하고 샘플을 OT라고 표시된 새로운 1.5밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 상청액을 피펫팅할 때 측면을 따라 튜브 바닥을 만지지 마십시오. 100 마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 각각의 수집 튜브에 피펫팅하고, 용액을 반복 피펫팅으로 세척된 OT 튜브로 옮긴다.600 마이크로 리터의 뉴 클레아제 자유수를 OT 튜브에 추가하여 1 밀리리터의 총 부피를 구성합니다. 8 분 동안 15, 500 회 G에서 원심 분리기에서 30 초 동안 와동. OT 튜브에 100 마이크로 리터의 용액을 남기고 상청액을 부드럽게 제거하십시오.팁을 사용하여 오일 층을 완전히 버립니다. 900 마이크로 리터의 뉴 클레아제 자유 물을 넣고 30 초 동안 와동시키고 15, 500 배 G에서 8 분 동안 원심 분리합니다. 20 마이크로리터의 용액이 남을 때까지 상청액을 제거하고 100 마이크로리터의 부피를 구성하기 위해 주형 재현탁 용액을 첨가한다.그런 다음 30 초 동안 소용돌이 치고 2 초 동안 잠시 원심 분리합니다. 샘플 처리 후 12시간 이내에 다음 단계로 진행하여 희석된 라이브러리 100마이크로리터, C1 비드 130마이크로리터, 300마이크로리터의 3x 템플릿 세척 용액 및 300마이크로리터의 용융 용액을 8개의 웰 스트립에 로드합니다. 농축 모듈에 8개의 웰 스트립을 설치하고 피펫팅 팁을 로드한 다음 200마이크로리터 원심분리 튜브를 수집 위치에 놓습니다.시작을 클릭하여 프로그램을 실행하십시오. 55 마이크로리터의 샘플 용액을 피펫팅하여 칩의 샘플 구멍에 주입한다. 칩을 원심 분리기에 놓습니다.노치는 바깥쪽으로, 샘플 포털은 안쪽으로 유지하십시오. 그런 다음 사용한 다른 칩과 균형을 맞추고 10 분 동안 원심 분리합니다. 텍스트 원고에 설명 된대로 로딩 솔루션을 준비하십시오.발포 용액에 100 마이크로 리터의 공기를 불어 넣습니다. 기포가 조밀하고 거품이 나는 상태가 될 때까지 용액을 반복적으로 피펫팅하고 거품 부피를 약 250마이크로리터로 유지합니다. 원심 분리 후 칩을 벤치에 놓습니다.100마이크로리터의 폼을 샘플 구멍에 주입하고 압출된 용액을 아웃 포털로 제거합니다. 그런 다음 칩을 30초 동안 짧게 원심분리합니다. 이 과정을 한 번 반복하십시오.100 % 세척 완충액에 50 마이크로 리터를 두 번 주입하고 매 주입 후 아웃 포털에서 압출 용액을 제거합니다. 그런 다음 50 % 어닐링 버퍼에 100 마이크로 리터를 세 번 주입하고 매 주입 후 아웃 포털에서 압출 용액을 제거합니다. 65 % 효소 반응 완충액에 50 마이크로 리터를 주입하여 기포를 피하고 아웃 포털에서 압출 용액을 제거합니다.적재 된 칩을 실온에서 5 분 동안 안정화하고 시퀀서 칩 포털에 칩을 설치하십시오. 계획된 프로그램을 선택하여 정보를 확인하고 실행을 시작합니다. 대표적인 실행은 총 17.6 기가 바이트 데이터를 얻었으며 이온 구 입자의 전체 로딩 속도는 칩의 전체 웰에서 88 %였습니다.히트 맵은 전체 칩 영역에서 샘플 로딩도 확인했습니다. 전체 읽기 횟수의 77%를 사용할 수 있었습니다. ISP가로드 된 모든 우물은 100 % 템플릿 농축을 보여 주었고 78 %는 클론이었습니다.모든 클론 템플릿 중 97%가 최종 라이브러리로 인정되었습니다. 판독의 평균 길이는 177 염기쌍이었고 중앙값과 최빈값은 각각 176 및 174 염기쌍이었습니다. 템플릿에서 티민, 시토신 및 아데닌의 피크 수는 적격 컷오프 라인 50에서 약 76이었습니다.라이브 ISP가 있는 주소 지정이 가능한 모든 웰에서 99.5%가 구축된 라이브러리로 인정되었고 20%의 다클론 및 저품질 라이브러리가 필터링되었으며 76.6%의 ISP가 추가 분석을 위해 검증되었습니다. 단일 샘플로부터의 복제 수 분산의 결과는 염색체 4에서 P 16.3 내지 Q 35.2의 182.16 메가베이스 쌍 모자이크 삼염색체 및 염색체 22 상에서 Q 11.1 내지 Q 13.33의 33 점 13 메가베이스 쌍 단일체 세그먼트를 나타내었다. 조각 선택을 수행할 때 단계 사이의 시간 간격은 동일한 배치의 샘플 크기에 따라 수정하여 전면 및 후면 샘플에 대한 과다 및 노출 부족을 방지해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Ribosomal DNA에 따라 RNA 샘플에서 DNA 오염 평가

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

연구

유전학

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

다음-세대 시퀀싱과 생물 정보학 파이프라인 헌법 질병의 유전 결정 요인 평가 대상

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum 셀 선택에 따라 성장과 박테리아에서의 유전 공학

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA 차세대 염기 서 열 분석 및 생물 정보학 파이프라인은 궤적 특이 수준에서 발현 된 라인-1s를 식별 한다

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...