Name: pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform
Uploaded: 2022-08-17T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dr. Zhangyong Ming og Mr. Rongji Hou for deres råd om LIMS utvidet søknad. Denne studien støttes av PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) og Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Alle protokoller og trophectoderm (TE) biopsi (1.1.1.1 seksjon) anvendt i denne studien ble gjennomgått og godkjent av human research ethics committee of No. 924 hospital 18. september 2017 (NO: PLA924-2017-59). Pasientene/deltakerne ga skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien.
1. DNA-isolasjon fra human embryobiopsi og genomisk forsterkning
<ol><li>Protokoll for helgenomforsterkning 9,10 MERK: P...

<ol>
	<li>Driscoll, D. A., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hong, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+aneuploidy+rates+are+equivalent+in+natural+cycles+and+gonadotropin-stimulated+cycles.">Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles.</a> Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).</li><li>Adams, D. R., Eng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+to+diagnose+suspected+genetic+disorders.">Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).</li><li>Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+ion+torrent+semiconductor+chip+based+sequencing.">Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing.</a> Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).</li><li>Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+techniques:+Implications+for+clinical+prenatal+diagnosis.">Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis.</a> Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).</li><li>Dilliott, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+next-generation+sequencing+and+bioinformatics+pipeline+to+evaluate+genetic+determinants+of+constitutional+disease.">Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).</li><li>Ion ReproSeq&#8482; PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf</a> (2017)</li><li>PicoPLEX&#174; Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf">https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf</a> (2019)</li><li>. Qubit&#174; 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf</a> (2014)</li><li>Ion AmpliSeq&#8482; DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf</a> (2019)</li><li>Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf</a> (2015)</li><li>Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf</a> (2017)</li><li>Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html">https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html</a> (2017)</li><li>Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Bayesian+inference+of+copy+number+variants+using+Hidden+Markov+models+with+wavelet+compression.">Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression.</a> PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).</li><li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-implantation+genetic+screening+using+fluorescence+in+situ+hybridization+in+patients+with+repetitive+implantation+failure+and+advanced+maternal+age:+two+randomized+trials.">Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).</li><li>Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+screening+(PGS)+still+in+search+of+a+clinical+application:+a+systematic+review.">Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).</li><li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+pre-implantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations.">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li><li>Handyside, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=24-chromosome+copy+number+analysis:+a+comparison+of+available+technologies.">24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).</li><li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation.">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li><li>El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequence+assembly:+Four+stages+of+data+processing+and+computational+challenges.">Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges.</a> PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).</li><li>Jennings, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+validation+of+next-generation+sequencing-based+oncology+panels:+A+joint+consensus+recommendation+of+the+Association+for+Molecular+Pathology+and+College+of+American+Pathologists.">Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).</li><li>de Bourcy, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+comparison+of+single-cell+whole+genome+amplification+methods.">A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods.</a> PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).</li><li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+pre-implantation+genetic+screening+cycles.">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li><li>Damerla, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Torrent+sequencing+for+conducting+genome-wide+scans+for+mutation+mapping+analysis.">Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis.</a> Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).</li><li>Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+genetic+testing+for+aneuploidy:+what+technology+should+you+use+and+what+are+the+differences.">Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).</li><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClinVar:+improving+access+to+variant+interpretations+and+supporting+evidence.">ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence.</a> Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).</li><li>Genomes Project, C, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+reference+for+human+genetic+variation.">A global reference for human genetic variation.</a> Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).</li><li>McKusick, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+inheritance+in+man+and+its+online+version,+OMIM.">Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM.</a> American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).</li><li>Zhao, M., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNVannotator:+A+comprehensive+annotation+server+for+copy+number+variation+in+the+human+genome.">CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome.</a> PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+next-generation+sequencing+in+pre-implantation+genetic+diagnosis+cycles+for+Robertsonian+and+reciprocal+translocations.">Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+allele+with+resolved+carrier+status+of+Robertsonian+and+reciprocal+translocation+in+human+pre-implantation+embryos.">Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).</li></ol>

Kromosomal aneuploidi av embryoer er årsaken til en stor andel av graviditetstap, enten unnfanget naturlig eller in vitro befruktning (IVF). I den kliniske praksisen med IVF foreslås det at screening av embryoaneuploidien og overføring av euploidi-embryoet kan forbedre utfallet av IVF. Fluorescens in situ hybridisering er den tidligste teknikken som er vedtatt for kjønnsvalg og PGT-A; Denne teknikken krever imidlertid mer teknisk kompetanse fra laboratoriepersonell og er relativt arbeidskrevende. Ø...

Aneuploidy er abnormiteten i antall kromosomer ved tilstedeværelse av en eller flere ekstra kromosomer eller fraværet av ett eller flere kromosomer. Embryoer som bærer noen form for aneuploidi, for eksempel tap av ett X-kromosom (Turners syndrom), ekstra kopier av autosomer, som trisomier av autosom 21 (Downs syndrom), 13 (Patau syndrom) og 18 (Edwards syndrom), eller ekstra kjønnskromosomer som 47, XXY (Klinefelter syndrom) og 47, XXX (Triple X syndrom), kan overleve til termin med fødselsskader1. Aneuploidi er den primære årsaken til spontanaborter i første trimester og in vitro fertilisering (IVF) svikt2. Det er rapportert at aneuploidi-frekvensen kan variere fra 25,4% -84,5% gjennom de forskjellige alderslagene i den naturlige syklusen og medisinert kontrollgruppen i IVF-praksis3.
Neste generasjons sekvenseringsteknologi blir vilt brukt til å bestemme genetisk informasjon klinisk; Det gir praktisk tilgang til genomsekvens med effektivitet og høy gjennomstrømning. Spesielt revolusjonerte neste generasjons sekvensering også diagnosen lidelser med genetiske faktorer og tester for abnormitet i genomet4. Ved hjelp av halvledersekvenseringsteknologi for direkte overføring av kjemiske signaler ved sekvensering av bioreaksjon til digitale data, gir det halvlederbaserte sekvenssystemet en direkte sanntidsdeteksjon til sekvensdata i 3-7 timer 5,6.
I en IVF-prosedyre undersøker preimplantasjonsgenetisk testing (PGT) den genetiske profilen til embryoet før det overføres til livmoren for å forbedre IVF-utfallet og redusere risikoen for genetiske lidelser hos nyfødte 1,7. I PGT kombinert med NGS-teknikker forsterkes genetisk materiale ekstrahert fra mindre enn 10 celler med fullgenomforsterkningssett eller et uavhengig utviklet fullgenomamplifikasjonsreagens. Dette krever bare ett trinn i forsterkningsfasen og krever ikke forforsterkning for å oppnå fullgenomforsterkningsprodukter. Primere eller paneler for kopinummervariant og spesiell gen loci sekvensering er utformet og anvendt i biblioteket konstruert.
En typisk arbeidsflyt for preimplantasjon genetisk testing-aneuploidi (PGT-A) i NGS innebærer serielle prosedyrer, og krever en intens arbeidsbelastning av laboratoriepersonell8. Noen feiloperasjoner forårsaket prosedyren roll-back kan føre til uønsket tap av både tid og ressurser på laboratoriet. En kortfattet og tydelig standard driftsprosedyre (SOP) for PGS-NGS-arbeidsflyt er nyttig; Word-formatprotokoller kan imidlertid ikke presentere mer detaljert informasjon om prøvebehandling, enhetsmanipulering og instrumentinnstillinger, som kan visualiseres i en videoprotokoll. I denne artikkelen kan en validert arbeidsflyt kombinert med en visualisert demonstrasjon av driftsdetaljer tilby mer direkte og intuitive henvisningsprotokoller i PGT-praksis på en halvledersekvenseringsplattform.
Protokollen her beskriver en metode som støtter batching av opptil 16 embryobiopsier parallelt. For større partier anbefales det å bruke en kommersiell settbasert protokoll for sekvensering av halvledere, for eksempel Reproes-PGS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Syringe Filter Unit</td>
			<td>Merkmillipore</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mLDNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anstart Tap DNA Polymerase</td>
			<td>FAPON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A63881</td>
			<td>https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM &#946;-glycerophosphate, 0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinVar</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA elution buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1016L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>P031-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Independently developed whole genome amplification reagents</td>
			<td>Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td>The reagents consist of the following components: 
			1. Cell Lysis 
			2. Amplification Pre-mixed solution 
			&#160;&#160;&#160; 1) Primer WGA-P2 (10 &#956;M) 
			&#160;&#160;&#160; 2) dNTP (10 mM) 
			&#160;&#160;&#160; 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 
			3. Amplification Enzyme 
			&#160;&#160;&#160; 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&#956;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Kit mentioned in step 4.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4476610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Server System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4487118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Preparation Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>114</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo WGA-P2</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN 
			NNNNATGTGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTouch 2 System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4474779</td>
			<td>&#160;Template amplification and enrichment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Kit</td>
			<td>Takara Bio USA</td>
			<td>R300671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Mini Centrifuge LX-300</td>
			<td>Qilinbeier</td>
			<td>E0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer server system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Torrent Suite Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Reactions Universal Kit</td>
			<td>Daan Gene Co., Ltd</td>
			<td>113</td>
			<td>https://www.daangene.com/pt/certificate.html 
			This kit contains the following components: 
			1. Template Preparation Kit Set 
			 
			1.1 Template Preparation Kit: 
			Emulsion PCR buffer 
			Emulsion PCR enzyme mix 
			Template carrier solution 
			 
			1.2 Template Preparation solutions: 
			Template preparation reaction oil I 
			emulsifier breaking solution II 
			Template Preparation Reaction Oil II 
			Nuclease-free water 
			Tween solution 
			Demulsification solution I 
			Template washing solution 
			C1 bead washing solution 
			C1 bead resuspension solution 
			Template resuspension solution 
			 
			1.3 Template Preparation Materials: 
			Reagent tube I 
			connector 
			Collection tube 
			Reagent tube pipette I 
			Amplification plate 
			8 wells strip 
			Dedicated tips 
			Template preparation washing adapter 
			Template preparation filter 
			 
			2. Sequencing Kit Set 
			 
			2.1 Sequencing Kit: 
			dGTP 
			dCTP 
			dATP 
			dTTP 
			Sequencing enzyme solution 
			Sequencing primers 
			Quality control templates 
			 
			2.2&#160; Sequencing Solutions: 
			Sequencing solution II 
			Sequencing solution IIII 
			Annealing buffer 
			Loading buffer 
			Foaming agent 
			Chlorine tablets 
			C1 bead 
			 
			2.3 Sequencing Materials: 
			Reagent Tube II 
			Reagent tube cap 
			Reagent tube sipper&#160; II 
			Reagent bottle sipper 
			Reagent bottles 
			 
			3. Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-implantation genetic testing for aneuploidy on a semiconductor based next-generation sequencing platform

Neste generasjons sekvensering har fått økende betydning i den kliniske anvendelsen ved bestemmelse av genetiske varianter. I den genetiske testen før implantasjon har denne teknikken sine unike fordeler i skalerbarhet, gjennomstrømning og kostnad. For preimplantasjonsgenetisk test for aneuploidianalyse gir det halvlederbaserte neste generasjons sekvenseringssystemet (NGS) som presenteres her en omfattende tilnærming for å bestemme strukturelle genetiske varianter med en minimumsoppløsning på 8 Mb. Fra prøveinnsamling til sluttrapport krever arbeidsprosessen flere trinn med nær overholdelse av protokoller. Siden ulike kritiske trinn kan bestemme utfallet av forsterkning, kvaliteten på biblioteket, dekning av leser og utdata av data, kan beskrivende informasjon med annen visuell demonstrasjon enn ord gi mer detaljer til operasjonen og manipulasjonen, noe som kan ha stor innvirkning på resultatene av alle kritiske trinn. Metodene som presenteres her, vil vise prosedyrene som er involvert i helgenomforsterkning (WGA) av biopsierte trofektoverm (TE) celler, genomisk bibliotekkonstruksjon, sequencerhåndtering, og til slutt generering av kopinummervarianters rapporter.

Når sekvensplanen er ferdig etter at kjøreprosessen i maskinen, rapporterer sekvensserversystemet sammendraget med beskrivende informasjon om genererte data, brikkestatus, ISP-lastehastighet og bibliotekkvalitet, som vist i figur 2. I denne resultatdemonstrasjonen ble det oppnådd 17, 6 G data i den totale basen, og den totale lastehastigheten til ISP var 88% i de totale brønnene i brikken; varmekartet viste at prøven var jevnt lastet på det totale arealet av brikken (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform at JoVE.com

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Protokollen presenterer de generelle prosedyrene i laboratoriet som kreves i genetisk testing før implantasjon for aneuploidi på en halvlederbasert neste generasjons sekvenseringsplattform. Her presenterer vi de detaljerte trinnene for helgenomforsterkning, DNA-fragmentvalg, bibliotekkonstruksjon, malforberedelse og sekvensering av arbeidsflyt med representative resultater.

Preimplantasjonsgenetisk testing for aneuploidi på en halvlederbasert neste generasjons sekvenseringsplattform

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...

Denne protokollen presenterer prosedyren fra enkeltcelleforsterkning til sluttrapporteringsdata i preimplantasjonsgenetisk testing for aneuploidi på en halvlederbasert neste generasjons sekvenseringsplattform. Denne prosedyren kan hjelpe seerne til å få en god forståelse av den eksperimentelle arbeidsflyten for PGT-A-sekvensering og replikere denne teknikken i et diagnostisk laboratorium med en halvlederbasert NGS-plattform. Begynn med å pipettere 25 mikroliter av hele genomforsterkningsproduktene og overføre dem til et 1,5 milliliter sentrifugerør forhåndslastet med 25 mikroliter nukleasefritt vann.Vortex og bland DNA-rensingsperlene. Aliquot 50 mikroliter av denne løsningen i hvert prøverør. Vortex og sentrifuge kort i fem sekunder.Sett røret i fem minutter ved romtemperatur for DNA-bindingsprosessen. Sett 1,5 milliliter sentrifugerøret inn i et magnetisk stativ. Vent deretter til alle magnetiske perler er tiltrukket av rørets sidevegg.Overfør supernatanten forsiktig til et nytt 1,5 milliliter sentrifugerør. Unngå pipettering ut perlene. I henhold til det opprinnelige prøvevolumet.Pipette 30 mikroliter magnetiske perler, virvel og sentrifuge kort i fem sekunder. Sett røret i fem minutter ved romtemperatur for DNA-bindingsprosessen. Sett de 1,5 millimeter sentrifugerørene inn i magnetstativet.Vent deretter til alle magnetiske perler er tiltrukket av rørets sidevegg. Fjern og kast supernatanten forsiktig. Unngå pipettering av perlene.Pipette 300 mikroliter 70% etanol inn i 1,5 milliliter sentrifugerøret. Roter deretter røret forsiktig to ganger i 180 graders vinkel og flytt perlene langs rørveggen for en grundig vask. Pipette og kast supernatanten.Unngå pipettering av perlene. Gjenta vaskeprosedyren en gang. Plasser en ny forsterkningsplate i systemet når rengjøringsprogrammet er fullført.Sett inn oppsamlingsrørene, hver ferdigfylt med 150 mikroliter som bryter løsning to inn i rotoren, og plasser deretter broen på oppsamlingsrørene. Tilsett reaksjonsoljen til halvparten av røret og emulgatorbryteløsningen til en tredjedel av røret. Plasser et nytt filter for klargjøring av maler på et rørstativ med eksempelportalen plassert oppover.Vortex løsningen i fem sekunder og sentrifuger kort i fem sekunder. Overfør deretter løsningen til filterets prøveportal etter pipettering av 800 mikroliter tre ganger. Sentrifuge røret for å redusere bobler før siste injeksjon.Unngå å injisere luft inn i filteret. Injiser 200 mikroliter reaksjonsolje to, etter blandet oppløsning. Vri filterets prøveportal nedover og bytt ut vasketilpasningen med filteret.Stikk prøvekanylen inn i det midterste hullet på rotorlokket og trykk deretter nålen til bunnen. Klikk på Kjør-knappen på skjermen og velg programmet i henhold til det tilsvarende settet. Velg deretter Assistert for å sjekke alle trinnene.Klikk på Neste til kjøringen er startet. Løpet vil ta omtrent 4,5 timer å fullføre. Velg Neste når programmet er ferdig.Systemet vil starte en 10-minutters sentrifugeringsprosess. Etter sentrifugering klikker du på Åpne lokk-knappen og flytter oppsamlingsrørene til stativer. Hvis prosedyren ikke går videre til neste trinn på 15 minutter, trykker du på siste spinn for å sentrifugere på nytt.Fjern supernatanten i oppsamlingsrøret, og la 100 mikroliter oppløsning ligge i røret. Bland den gjenværende prøven ved pipettering og overfør prøven til det nye 1,5 milliliter sentrifugerøret merket OT. Når du pipetterer supernatanten, må du unngå å berøre bunnen av røret langs sidene. Pipetter 100 mikroliter nukleasefritt vann inn i hvert oppsamlingsrør og overfør løsningen til OT-røret vasket ved gjentatt pipettering.Tilsett 600 mikroliter nukleasefritt vann til OT-røret for å utgjøre det totale volumet på en milliliter. Vortex i 30 sekunder i sentrifuge ved 15, 500 ganger G i åtte minutter. Fjern forsiktig supernatanten og la 100 mikroliter oppløsning ligge i OT-røret.Bruk spissen til å kaste oljelaget helt. Tilsett 900 mikroliter nukleasefritt vann, virvel i 30 sekunder og sentrifuge ved 15, 500 ganger G i åtte minutter. Fjern supernatanten til 20 mikroliter av løsningen gjenstår, og legg til malen resuspenderingsløsning for å utgjøre volumet på 100 mikroliter.Deretter vortex i 30 sekunder og kort sentrifuge i to sekunder. Fortsett til neste trinn innen 12 timer etter prøvebehandling Last inn 100 mikroliter av det fortynnede biblioteket, 130 mikroliter C1-perler, 300 mikroliter tre x malvaskeløsning og 300 mikroliter smelteløsning til de åtte brønnstrimlene. Installer de åtte brønnstrimlene på anrikningsmodulen, last pipetteringsspissen og sett 200 mikroliter sentrifugerøret i oppsamlingsposisjon.Klikk på Start for å kjøre programmet. Pipette 55 mikroliter av prøveløsningen og injiser den i prøvehullet på brikken. Sett brikken på sentrifugen.Hold hakket mot utsiden og eksempelportalen inne. Balanser den deretter med en annen brukt brikke og sentrifuge i 10 minutter. Klargjør lasteløsningen som beskrevet i tekstmanuskriptet.Blås 100 mikroliter luft inn i skumløsningen. Pipetter oppløsningen gjentatte ganger til boblene er i tett, skummende tilstand og hold skumvolumet til ca. 250 mikroliter. Plasser brikken på benken etter sentrifuge.Injiser 100 mikroliter skum i prøvehullet og fjern den ekstruderte løsningen i utportalen. Sentrifuger deretter brikken kort i 30 sekunder. Gjenta denne prosessen en gang.Injiser 100 mikroliter ved 50% vaskebuffer to ganger og fjern den ekstruderte løsningen i utportalen etter hver injeksjon. Injiser deretter 100 mikroliter ved 50% glødebuffer tre ganger og fjern den ekstruderte løsningen i utportalen etter hver injeksjon. Injiser 65 mikroliter ved 50% enzymreaksjonsbuffer, unngå bobler og fjern den ekstruderte løsningen i utportalen.Stabiliser den lastede brikken ved romtemperatur i fem minutter og installer brikken på sequencer-chipportalen. Velg Planlagt program sjekk informasjonen og start kjøringen. Representantkjøringen oppnådde totalt 17, 6 gigabyte data og den totale lastehastigheten til ionkulepartikkelen var 88% i de totale brønnene i brikken.Varmekartet bekreftet jevn prøvelasting på det totale chipområdet. 77 % av de totale avlesningene var brukbare. Alle brønner lastet med ISP viste 100% maler anrikning der 78% var klonale.Av alle klonale maler var 97% kvalifisert som det endelige biblioteket. Gjennomsnittlig lengde på lesingen var 177 basepar, mens median og modus var henholdsvis 176 og 174 basepar. Topptellingen av tymin, cytosin og adenin i malene var ca. 76 over den kvalifiserte grenseverdien på 50.I alle adresserbare brønner med live ISP-er ble 99,5% kvalifisert som det konstruerte biblioteket og 20% av polyklonale og lavkvalitetsbiblioteker filtrert ut, mens 76,6% av Internett-leverandørene var kvalifisert for videre analyse. Resultatet av kopinummervariansen fra en enkelt prøve avbildet en 182,16 megabasepar mosaikktrisomi av P 16,3 til Q 35,2 på kromosom fire og et 33 punkt 13 megabasepar monosomi segment av Q 11,1 til Q 13,33 på kromosom 22. Når du utfører fragmentvalg, bør tidsintervaller mellom trinnene endres i henhold til størrelsen på prøvene i samme batch for å forhindre over- og mangel på eksponering for prøver foran og bak.

Research

JoVE Journal

Genetics

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering av DNA forurensning i RNA eksempler basert på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimalisering og sammenligningsanalyse av organellar DNA-berigelsesmetoder som er egnet for neste generasjons sekvensering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: En høy gjennomstrømning sekvensering-basert teknikk for å identifisere sent replikere regioner i genomet

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Neste generasjons sekvensering og bioinformatikk rørledning for å evaluere genetisk determinanter av konstitusjonelle sykdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genteknologi Dictyostelium discoideum cellene basert på valget og vekst på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Semiconductor sekvensering for Preimplantation genetisk testing for avvik

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Masse massespektrometri-baserte Proteomikk analyser bruker OpenProt databasen å avsløre romanen proteiner oversatt fra ikke-kanoniske åpent lesing rammer

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

RNA neste generasjons sekvensering og en bioinformatikk rørledning for å identifisere uttrykt linje-1s på det geometriske-spesifikke nivået

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...